微衛(wèi)星篩選方法

微衛(wèi)星篩選方法課件第1頁，共23頁，2023年，2月20日，星期六什么是微衛(wèi)星（Microsatellite）？

短串聯(lián)重復(fù)(shorttandemrepeat，STR)簡單序列重復(fù)(simplesequencerepeat，SSR)由1-5個核苷酸為重復(fù)單位串聯(lián)組成的長達幾十個核苷酸的序列,重復(fù)數(shù)為10~20次含有串聯(lián)重復(fù)的核心序列兩側(cè)較保守的側(cè)翼序列

動物體中以雙核苷酸（CA/GT）n最為常見第2頁，共23頁，2023年，2月20日，星期六廣泛分布于各種真核生物基因組中，非常豐富且分布比較均勻數(shù)量多、特異的PCR擴增、穩(wěn)定性好、在基因組內(nèi)分布均勻、多態(tài)性信息豐富、易于檢測第3頁，共23頁，2023年，2月20日，星期六完美（perfect）重復(fù)型第4頁，共23頁，2023年，2月20日，星期六不完全（imperfect）重復(fù)型第5頁，共23頁，2023年，2月20日，星期六復(fù)合（compound）重復(fù)型第6頁，共23頁，2023年，2月20日，星期六所有的微衛(wèi)星分離篩選實驗都是沙里淘金的過程第7頁，共23頁，2023年，2月20日，星期六傳統(tǒng)篩選法使用限制性內(nèi)切酶或者聲波處理使基因組片段化電泳切膠選擇300-700bp的片段作為篩選庫連接到質(zhì)粒中轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細胞中與放射性的探針做Southern雜交，選擇出陽性克隆后進行測序、引物設(shè)計和引物最優(yōu)化第8頁，共23頁，2023年，2月20日，星期六第9頁，共23頁，2023年，2月20日，星期六傳統(tǒng)篩選法缺點：實驗成本高、耗時長而無法大批量操作，并且由于使用放射性元素而使得操作過程不安全。第10頁，共23頁，2023年，2月20日，星期六基于引物擴增的方法基因組片段化和片段大小選擇把片段轉(zhuǎn)入噬菌體中從而得到一個單鏈的DNA庫以這些ssDNA為模板，以重復(fù)堿基引物做PCR擴增，得到篩選庫第11頁，共23頁，2023年，2月20日，星期六基于引物擴增的方法缺點：操作繁雜，使用重復(fù)堿基引物擴增的效率較低從而使得一些較稀少的位點被忽略，并且這個方法在篩選三四堿基重復(fù)的位點時會出現(xiàn)單克隆的多拷貝情況第12頁，共23頁，2023年，2月20日，星期六選擇性雜交法對目標物種的基因組進行片段化和片段大小選擇將片段接入質(zhì)?；蛘呒由辖宇^與一定的探針雜交，雜交后的片斷可以選擇雜交篩選和磁珠吸附兩種方法對雜交片段進行富集第13頁，共23頁，2023年，2月20日，星期六FLASCO法（FastisolationbyAFLPofSequencesCOtainingrepeats）跳過對基因組片段化和大小的選擇充分利用了基因組，以免稀有微衛(wèi)星的丟失。步驟較為簡單，方便快速，優(yōu)化效率高，實驗成本較低。第14頁，共23頁，2023年，2月20日，星期六1DNA抽提2酶切連接3AFLP特異擴增4探針雜交5磁珠洗脫6雙鏈恢復(fù)7質(zhì)粒連接8轉(zhuǎn)化克隆9單克隆擴增培養(yǎng)10菌落PCR選擇目標克隆11測序12引物設(shè)計及優(yōu)化13熒光PCR及基因分型14數(shù)據(jù)分析第15頁，共23頁，2023年，2月20日，星期六（1）DNA抽提 -Sambrooketal.1989；其它方法（2）酶切連接 -MseI+T4Ligase（3）AFLP特異擴增DNA片段-酶切連接液為模板-MesI–N引物第16頁，共23頁，2023年，2月20日，星期六（4）探針雜交-5，端生物素修飾的重復(fù)堿基探針與擴增產(chǎn)物雜交（5）磁珠洗脫-磁珠特異性吸附雜交片段，洗脫除去未雜交片段第17頁，共23頁，2023年，2月20日，星期六（6）雙鏈恢復(fù)-磁珠富集得到的目的單鏈以MesI-N為引物特異擴增恢復(fù)為雙鏈（7）質(zhì)粒連接-PMD18-Tvector第18頁，共23頁，2023年，2月20日，星期六（8）轉(zhuǎn)化克隆-DH5-α感受態(tài)細胞涂板，37℃培養(yǎng)11-13h（9）單克隆擴增培養(yǎng)-挑取白色飽滿菌落液體培養(yǎng)基培養(yǎng)5h

（10）菌落PCR選擇目標克隆-三引物法擴增產(chǎn)物為雙帶第19頁，共23頁，2023年，2月20日，星期六（11）測序-目標克隆菌液測序（12）引物設(shè)計及優(yōu)化-CID軟件分析序列及設(shè)計引物-引物擴增條件優(yōu)化（13）熒光PCR及基因分型-熒光修飾引物特異擴增-基因分型第20頁，共23頁，2023年，2月20日，星期六（14）數(shù)據(jù)分析-Genescan讀取基因分型數(shù)據(jù)-位點多態(tài)性信息-位點是否偏離