儀器培訓(xùn)熒光定量

儀器培訓(xùn)熒光定量第1頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六PartI中心儀器簡介PartII熒光定量PCR原理PartIII熒光定量PCR儀操作規(guī)程第2頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六PartI中心儀器簡介熒光定量PCR儀Rotorgene3000普通PCR儀GeneAMPSystem9700第3頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六提供兩種不同的轉(zhuǎn)子36*0.2ml標(biāo)準(zhǔn)PCR管72*0.1ml金屬鎖環(huán)僅限于36孔轉(zhuǎn)輪使用僅適用于平頭0.2ml薄壁管PartI中心儀器簡介第4頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六首先，傳統(tǒng)的PCR檢測方法在測定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物前需打開反應(yīng)管，容易造成產(chǎn)物污染，成為“假陽性”的主要來源。實(shí)時PCR在擴(kuò)增過程中動態(tài)檢測，完全以閉管方式進(jìn)行，不僅操作簡便，也杜絕了產(chǎn)物污染源。其次，傳統(tǒng)PCR都是在PCR到達(dá)平臺期后進(jìn)行檢測。PCR經(jīng)過指數(shù)期后，對反應(yīng)條件的變化十分敏感，擴(kuò)增到達(dá)平臺期的信號強(qiáng)度重現(xiàn)性很差。實(shí)時PCR方法則在指數(shù)擴(kuò)增的開始階段進(jìn)行檢測，此時樣品間的細(xì)小誤差尚未放大，因此具有重復(fù)性。PartII熒光定量PCR原理第5頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六定量PCR技術(shù)的產(chǎn)生1992年由Higuchi等人第一次報告：使用EB內(nèi)插染料法插至雙鏈DNA，經(jīng)改裝的帶有冷CCD的PCR儀檢測樣品的熒光強(qiáng)度PCR循環(huán)=雙鏈DNA=染料=熒光后來用與雙鏈DNA有更強(qiáng)結(jié)合力的SYBRGreenI取代EBPartII熒光定量PCR原理第6頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六PartII熒光定量PCR原理實(shí)時定量PCR技術(shù)是PCR技術(shù)和熒光檢測技術(shù)的結(jié)合通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時在線監(jiān)控PCR反應(yīng)過程，通過儀器和相應(yīng)的軟件分析結(jié)果，對待測樣品的初始模板進(jìn)行定量或定性分析。第7頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六熒光定量PCR標(biāo)記方法內(nèi)摻式染料

SYBRGreenI序列特異性探針

Taqman MolecularBeacons

FRET引物特異性探針 Amplifluor(Intergen)PartII熒光定量PCR原理第8頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六SYBR-GreenI

dsDNA的內(nèi)插染料是一種能插入到雙鏈DNA并發(fā)出強(qiáng)烈熒光的化學(xué)物質(zhì)，其熒光強(qiáng)度的增加與dsDNA的數(shù)量成正比。如SYBRGreenⅠ染料，當(dāng)它沒有結(jié)合上雙鏈DNA時，只發(fā)出相對弱的熒光；然而，當(dāng)它一旦插入到雙鏈DNA里時，熒光信號將會強(qiáng)烈地增加，從而根據(jù)熒光信號的增強(qiáng)來計算PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的增加。PartII熒光定量PCR原理第9頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六5’3’5’3’SGExcitationSGSGSGSGEmissionSYBR-GreenI

第10頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六5’3’5’3’SGSGSGSGSGExcitationEmissionSYBR-GreenI

第11頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六5’3’5’3’SGExcitationSGSGSGSGEmissionSYBR-GreenI

PartII熒光定量PCR原理第12頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六5’3’5’3’SGSGSGSGSGExcitationEmissionSYBR-GreenI

PartII熒光定量PCR原理第13頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六雙標(biāo)記探針（TaqmanProbe）

5’端標(biāo)記熒光分子（如：FAM），在3’端標(biāo)記一個吸收或淬滅熒光的分子（如：TAMRA），這樣5’端激發(fā)出的熒光會被3’端的分子淬滅或吸收掉，所以開始時，儀器并不能檢測到熒光。由于Taq聚合酶同時具有5’端外切酶的活性，在PCR反應(yīng)的延伸階段，Taq酶會把5’端的熒光分子切下，使其與3’端吸收或淬滅熒光的分子分開，儀器就會檢測到熒光信號。每一個循環(huán)，隨著PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，熒光信號會增強(qiáng)，從而根據(jù)熒光信號的增強(qiáng)來計算PCR產(chǎn)物擴(kuò)增量的增加。PartII熒光定量PCR原理第14頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六RQ5’3’5’3’5’3’5’3’ExcitationRQQRQRExcitationPartII熒光定量PCR原理第15頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六1、配備36孔和72孔轉(zhuǎn)子，根據(jù)實(shí)驗需要更換。2、非實(shí)驗孔用空管填滿，以保證絕對的溫度均一性。3、每次放好樣品管后，開始實(shí)驗前要用壓環(huán)將樣品管蓋（平頭管蓋）壓住。0.2mlPCR管PartIII熒光定量PCR儀操作規(guī)程第16頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六開機(jī)操作：打開電腦等待導(dǎo)入WindowsXP系統(tǒng)打開Rotor-Gene3000主機(jī)電源，等待出現(xiàn)Ready狀態(tài)提示。打開Rotorgene3000的蓋子，將PCR反應(yīng)管放入反應(yīng)倉中，用空管填滿反應(yīng)倉。加上金屬鎖環(huán)（36孔），合上蓋子。注意事項：

務(wù)必在轉(zhuǎn)輪中填滿管子，不反應(yīng)的位置用空管代替，以保證熱反應(yīng)系統(tǒng)內(nèi)部結(jié)構(gòu)的均一性如果使用的是0.1ml的管子，在空管處拔掉帽子。如果使用的是0.2ml的管子，必須使用平頭管子。PartIII熒光定量PCR儀操作規(guī)程第17頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六軟件使用流程：雙擊軟件圖標(biāo)，進(jìn)入控制軟件Rotor-Gene6點(diǎn)Performlastrun,new點(diǎn)36-wellRotor,并選中NoDomed0.2mlTubes前面的復(fù)選框，點(diǎn)next設(shè)定自己的反應(yīng)體系，點(diǎn)next點(diǎn)Editprofile,按自己預(yù)實(shí)驗的每個基因的最佳條件設(shè)置hold和cycling,設(shè)好后點(diǎn)OK.點(diǎn)next,點(diǎn)StartRun,將當(dāng)次實(shí)驗保存至自己的文件夾中。PartIII熒光定量PCR儀操作規(guī)程第18頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六關(guān)機(jī)操作：實(shí)驗結(jié)束后，關(guān)閉電腦程序，關(guān)閉Rotorgene3000電源，電腦關(guān)機(jī)。系統(tǒng)設(shè)置注意：不要關(guān)掉硬盤，確保永不關(guān)掉硬盤。系統(tǒng)不能處于待命狀態(tài)，確保永不進(jìn)入待命狀態(tài)。不能安裝屏幕保護(hù)PartIII熒光定量PCR儀操作規(guī)程第19頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六儀器維護(hù)：保持鏡頭的清潔，防止灰塵累積。加熱艙朝下看，你會發(fā)現(xiàn)有一個（多通道機(jī)型）或兩個（兩通道）圓形透鏡，他們是不同通道的檢測物鏡，如果通道上積累了灰塵或碎片，用棉簽沾酒精清洗。在機(jī)器不用時，蓋好艙蓋以減少落入的灰塵。PartIII熒光定量PCR儀操作規(guī)程第20頁，共22頁，2023年，2月20日，星期六1.RotorGene3000熒光定量