核酸的生物合成課件

核酸的生物合成

本章重點介紹遺傳中心法則和DNA、RNA的生物合成，對基因工程作一般介紹。

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DNA是絕大多數(shù)生物體遺傳信息的載體，繼1953年Watson&Crick提出DNA雙螺旋結構模型后，1958年，Crick提出了“中心法則”(Centraldogma)揭示了遺傳信息的傳遞規(guī)律。遺傳信息傳遞的中心法則

蛋白質翻譯轉錄逆轉錄復制復制DNARNA生物的遺傳信息以密碼的形式儲存在DNA分子上，表現(xiàn)為特定的核苷酸排列順序。在細胞分裂的過程中，通過DNA復制把親代細胞所含的遺傳信息忠實地傳遞給兩個子代細胞。在子代細胞的生長發(fā)育過程中，這些遺傳信息通過轉錄傳遞給RNA，再由RNA通過翻譯轉變成相應的蛋白質多肽鏈上的氨基酸排列順序，由蛋白質執(zhí)行各種各樣的生物學功能，使后代表現(xiàn)出與親代相似的遺傳特征。后來人們又發(fā)現(xiàn)，在宿主細胞中一些RNA病毒能以自己的RNA為模板復制出新的病毒RNA，還有一些RNA病毒能以其RNA為模板合成DNA，稱為逆轉錄這是中心法則的補充。

中心法則總結了生物體內遺傳信息的流動規(guī)律，揭示遺傳的分子基礎，不僅使人們對細胞的生長、發(fā)育、遺傳、變異等生命現(xiàn)象有了更深刻的認識，而且以這方面的理論和技術為基礎發(fā)展了基因工程，給人類的生產(chǎn)和生活帶來了深刻的革命。目錄第四節(jié)基因工程及分子生物學技術簡介第一節(jié)DNA的生物合成第二節(jié)RNA的生物合成第三節(jié)核酸合成的抑制劑一、DNA的半保留復制

1、概念和實驗依據(jù)

2、原核生物DNA聚合反應有關的酶類

3、原核細胞DNA的復制的起始點和方式5、DNA復制的忠實性6、真核細胞DNA的復制

4、原核細胞DNA的復制過程（半不連續(xù)復制）DNA的半保留復制的概念

DNA在復制時，兩條鏈解開分別作為模板，在DNA聚合酶的催化下按堿基互補的原則合成兩條與模板鏈互補的新鏈，以組成新的DNA分子。這樣新形成的兩個DNA分子與親代DNA分子的堿基順序完全一樣。由于子代DNA分子中一條鏈來自親代，另一條鏈是新合成的，這種復制方式稱為半保留復制。

原核生物DNA聚合反應有關的酶類

（1）DNA聚合酶(DNApolymetases)（2）引物酶(peimase)和引發(fā)體(primosome)

：啟動RNA引物鏈的合成。(3）DNA連接酶（DNAligase）（4）DNA解鏈酶(DNAhelicase)(5）單鏈結合蛋白(single-strandbindingprotein,SSB)：結合在解開的DNA單鏈上，防止重新形成雙螺旋。(6）拓撲異構酶(topoisomerase):兼具內切酶和連接酶活力，能迅速將DNA超螺旋或雙螺旋緊張狀態(tài)變成松馳狀態(tài)，便于解鏈。解旋酶DNA聚合酶III解鏈酶RNA引物引物酶和引發(fā)體DNA聚合酶ISSB3′3′5′3′5′5′RNA引物復制的忠實性

DNA復制過程是一個高度精確的過程，據(jù)估計，大腸桿菌DNA復制109-1010堿基對僅出現(xiàn)一個誤差，保證復制忠實性的原因主要有以下三點:a、DNA聚合酶的高度專一性（嚴格遵循堿基配對原則）b、DNA聚合酶的校對功能（錯配堿基被3’-5’外切酶切除）c、起始時以RNA作為引物連接酶連接切口Mg2+連接酶ATP或NAD＋PPi或NMNATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPPOHTGGATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPTGGP缺口3'3'5'5'5'5'3'3'模板鏈模板鏈大腸桿菌復制起點成串排列的重復序列

GATCTNTTNTTT成串排列的三個13bp序列共有序列共有序列TTATCCACADnaA蛋白結合位點四個9bp序列DnaADnaB(解螺旋酶)SSB大腸桿菌DNA復制起點在起始階段的結構模型原核細胞DNA的半不連續(xù)復制復制過程

復制叉的移動方向解旋酶DNA聚合酶III解鏈酶RNA引物引物體DNA聚合酶ISSB3′3′5′前導鏈隨后鏈3′5′復制的起始DNA鏈的合成與延長DNA鏈合成的終止5′RNA引物3′3′DNA連接酶DNA聚合酶Ⅲ全酶核心酶PolIIIPolIII延長因子DNA聚合酶Ⅲ二聚體DNA聚合酶催化的鏈延長反應3′5′模板鏈5′RNA引物子鏈3′3′5′5′3′3′5′5′3′DNA聚合酶的3-5外切酶水解位點3′3′5′5′錯配堿基3′-5′核酸外切酶水解位點復制叉處前導鏈和隨后鏈同時合成的工作模型聚合酶III全酶引物聚合酶III全酶引物引物體引物體解旋酶解旋酶DNA聚合酶的校對功能聚合酶錯配鹼基復制方向正確核苷酸5′5′5′3′3′3′切除錯配核苷酸真核細胞DNA復制的特點多個起點復制起點起點起點起點起點起點端粒（telemere）復制端粒酶（telomerase）DNA復制需要引物，但在線形DNA分子末端不可能通過正常的機制在引物被降解后合成相應的片段.如果沒有特殊的機制合成末端序列，染色體就會在細胞傳代中變得越來越短。這一難題是通過端粒酶的發(fā)現(xiàn)才得到了澄清，端粒酶是一種含RNA的蛋白復合物，實質上是一種逆轉錄酶，它能催化互補于RNA模板的DNA片段的合成，使復制以后的線形DNA分子的末端保持不變。

初步研究表明，人體中生殖細胞的端粒長度保持不變，而體細胞的端粒長度則隨個體的老化而逐步縮短。對此的一個推論是：人的生殖細胞具端粒酶的活力，體細胞則否。這一問題的解決無疑會有助于對生命衰老的認識。5′3′AAAACCCCAAAACCCCCCA端粒酶真核和原核DNA細胞復制比較二、逆轉錄作用1、概念2、逆轉錄酶3、病毒逆轉錄過程4、逆轉錄的生物學意義擴充了中心法則有助于對病毒致癌機制的了解與真核細胞分裂和胚胎發(fā)育有關逆轉錄酶是分子生物學重要工具酶三種功能依賴DNA指導下的DNA聚合酶活力依賴RNA的DNA聚合酶活力核糖核酸酶H活力

以RNA為模板合成DNA，這與通常轉錄過程中遺傳信息從DNA到RNA的方向相反，故稱為逆轉錄作用。

三、DNA的突變

DNA分子中的核苷酸序列發(fā)生突然而穩(wěn)定的改變，從而導致DNA的復制以及后來的轉錄和翻譯產(chǎn)物隨之發(fā)生變化，表現(xiàn)出異常的遺傳特性，稱為DNA的突變。它包括由于DNA損傷和錯配得不到修復而引起的突變，以及由于不同DNA分子之間的交換而引起的遺傳重組。二、誘變劑的作用堿基類似物(baseanalog)

堿基修飾劑(basemodifier)嵌入染料(intercalationdye)

紫外線(ultraviolet)和電離輻射(ionizingradiation)一、突變的類型

堿基對的置換(substitution)

移碼突變(framesshiftmutation)

DNA突變的類型

-T-C-G-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-C-G-A-C-A-T-G-C-轉換

-T-C-G-A-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-T-C-G-A-C-A-T-G-C-插入A

-T-C-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-G-A-C-A-T-G-C-缺失T野生型基因

-T-C-G-A-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-T-G-A-C-A-T-G-C-

-T-C-G-T-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-A-G-A-C-A-T-G-C-顛換堿基對的置換(substitution)移碼突變(framesshiftmutation)四、DNA的損傷與修復

某些物理化學因子，如紫外線、電離輻射和化學誘變劑等，都有引起生物突變和致死的作用，其機理是作用于DNA，造成DNA結構和功能的破壞，稱為DNA的損傷.DNA的修復主要有以下類型:暗修復（4）誘導修復（SOS修復）（1）光裂合酶修復活（2）切除修復（3）重組修復

DNA紫外線損傷的光裂合酶修復1、形成嘧啶二聚體2、光復合酶結合于損傷部位3、酶被可見光激活4、修復后酶被釋放DNA的損傷和切除修復堿基丟失堿基缺陷或錯配結構缺陷切開核酸內切酶核酸外切酶切除DNA聚合酶DNA連接酶AP核酸內切酶核酸外切酶切開切除修復連接糖苷酶插入酶堿基取代DNA的重組修復胸腺嘧啶二聚體復制核酸酶及重組蛋白修復復制DNA聚合酶DNA連接酶重組SOS反應的機制靶基因表達lexA靶基因表達但產(chǎn)物被分解recA大量表達RecA促使分解LexA未誘導的細胞誘導的細胞靶基因lexA基因被LexA

蛋白質部分阻遏recA基因被LexA

蛋白質部分阻遏（40個不同的位點被阻遏）LexA(阻遏物)RecA(輔蛋白酶)單鏈DNAATP第二節(jié)

RNA的生物合成一、DNA指導下RNA的合成（轉錄）二、RNA指導下RNA的合成(RNA的復制)三、RNA和DNA合成比較一、DNA指導下RNA的合成（轉錄）1、概念及DNA的有義鏈和反義鏈2、RNA聚合酶及催化反應3、RNA合成過程4、RNA轉錄后的加工5、真核生物的RNA合成轉錄的概念和DNA的有義鏈和反義鏈

轉錄是在DNA的指導下的RNA聚合酶的催化下，按照鹼基配對的原則，以四種核苷酸為原料合成一條與模板DNA互補的RNA的過程。RNA的轉錄從DNA模板的特定位點開始，并在一定的位點終止。此轉錄區(qū)域為一個轉錄單位。

啟動子（promoter)

終止子(terminator)模板鏈（templattestrand）反意義鏈(antisensestrand)有意義鏈(sensestrand)非信息區(qū)DNA5′5′3′3′大腸桿菌RNA聚合酶的結構示意圖核心酶(α2ββ)起始因子β——和模板DNA結合β——起始和催化聚合反應α——？全酶(αββ)RNA聚合酶催化的反應ACGACGUU模板DNA5′3′5′3′新合成RNARNA合成過程起始雙鏈DNA局部解開磷酸二酯鍵形成終止階段解鏈區(qū)到達基因終點延長階段53RNA

啟動子（promoter)

終止子(terminator)5RNA聚合酶5353553離開RNA鏈的延伸圖解3′3′RNA-DNA雜交螺旋聚合酶的移動方向新生RNA復鏈解鏈有義鏈模板鏈（反義鏈）延長部位原核生物中rRNA前體的加工

甲基化作用專一核酸內切酶30S前體17StRNA25S專一核酸外切酶16SrRNAtRNA23SrRNA5S

rRNA專一核酸外切酶tRNA前體分子的加工a、切除tRNA前體兩端多余的序列：5’—端切除幾到10個核苷酸。b、末端添加：3’-端添加CCA序列。c、修飾：形成稀有堿基如DH2。RNAasePRNAaseFRNAasePRNAaseFRNAaseDRNAaseDACC表示核酸內切酶的作用表示核苷酸轉移酶的作用表示核酸外切酶的作用

表示異構化酶的作用

真核細胞mRNA的加工5′

“帽子”PolyA

3′

順反子(cistron)

m7G-5′ppp-N-3′pAAAAAAA-OH5′端接上一個“帽子”(CAP)結構3′端添加PolyA“尾巴”,由RNA末端核苷酸轉移酶催化剪接：剪去內含子(intron)，拼接外顯子(extron)酵母酪氨酸t(yī)RNA前體的加工早轉錄本成熟tRNA加工真核生物和原核生物轉錄的差別

DNA核核糖體新生蛋白質真核生物原核生物mRNA前體轉運加工mRNAmRNA

真核生物中轉錄與復制在不同的區(qū)域RNA聚合酶不相同啟動子不同轉錄后RNA加工修飾不同噬菌體Q的合成

A.負鏈的合成B.正鏈的合成病毒的正鏈復制中間體復制中間體新合成的正鏈新合成的負鏈負鏈第三節(jié)核酸合成的抑制劑核苷酸合成抑制劑氨基酸類似物葉酸類似物堿基和核苷酸類似物嵌合劑烷化劑

與DNA模板結合的抑制劑

作用于DNA聚合酶或RNA集合酶的抑制劑抗菌素:如利福平、曲張霉素有機化合物：如磷羧基乙酸第四節(jié)基因工程及分子生物學技術簡介

一、基因工程二、體細胞克隆技術三、聚合酶鍵式反應（polymerasechainreaction,PCR）一、基因工程簡介

基因工程亦稱遺傳工程，即利用DNA重組技術的方法，把DNA作為組件，在細胞外將一種外源DNA（目的基因）和載體DNA重新組合連接（重組），最后將重組體轉入宿主細胞，使外源基因DNA在宿主細胞中，隨細胞的繁殖而增殖（cloning，克隆），或最后得到表達，最終獲得基因表達產(chǎn)物或改變生物原有的遺傳性狀。

基因工程的操作技術

基因工程的應用與前景基因工程的操作技術

ForeignDNAtobeinsertedPlansmidvectorJoiningRecombinantDNAmoleculeIntroductionintohostcellsbytransformationofviralinfection

HostchromatemeSlectionforcellscoteiningarecombinantDNAmoleculeCloning+1、體外基因重組

目的基因的制備

載體的構建：質粒或噬菌體