生物工程下游技術(shù)第三章微載體培養(yǎng)技術(shù)課件

第三章微載體培養(yǎng)技術(shù)

（microcarrierculturetechnique）

一、何謂微載體？指直徑60-250μm，能適用于貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)的微珠。一般是由天然葡聚糖或者各種合成的聚合物組成。最初采用在培養(yǎng)液中加人一定數(shù)量的小滾瓶，增加細(xì)胞生長(zhǎng)的貼壁面積。此方法構(gòu)造簡(jiǎn)單，成本低，重復(fù)性好，放大過(guò)程可依靠滾瓶數(shù)量的增加。但產(chǎn)率低，勞動(dòng)強(qiáng)度大，占空間大。如何增加細(xì)胞生長(zhǎng)的貼壁面積？微載體系統(tǒng)1967年被用于動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)。兼具懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，放大容易。現(xiàn)廣泛用于培養(yǎng)各類細(xì)胞，生產(chǎn)疫苗、蛋白質(zhì)產(chǎn)品。微載體培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)4h，微載體間的細(xì)胞“橋聯(lián)”×200

電鏡下串在一起的肝細(xì)胞微載體×730由于肝細(xì)胞的粘附作用微載體形成“串珠”×400

脊髓灰質(zhì)炎、狂犬和乙腦等疫苗顯微鏡下的高密度微載體優(yōu)良的微載體應(yīng)具有的特性價(jià)廉，能重復(fù)使用。不含能毒害細(xì)胞的成分；微載體須與細(xì)胞有良好的相容性；密度應(yīng)略大于培養(yǎng)基；粒徑在40～120μm范圍，生理鹽水溶脹后增大到60~250μm，粒度分布地均勻，徑差不大于20~25μm；良好的光學(xué)透明性；能在PBS中耐120~125℃、20~30min高溫滅菌；應(yīng)是非剛性材料；不吸收培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分；收獲細(xì)胞或細(xì)胞制品容易，不影響蛋白質(zhì)分離純化；三、微載體培養(yǎng)原理與操作

1、原理：將對(duì)細(xì)胞無(wú)害的顆?！⑤d體加入到培養(yǎng)容器的培養(yǎng)液中，作為載體，使細(xì)胞在微載體表面附著生長(zhǎng)，同時(shí)通過(guò)持續(xù)攪動(dòng)使微載體始終保持懸浮狀態(tài)。絲網(wǎng)微載體通氣的培養(yǎng)基鼓泡器攪拌葉輪微載體培養(yǎng)裝置圖細(xì)胞能否黏附，主要取決于細(xì)胞與微載體的接觸概率和相融性。細(xì)胞增殖階段：黏附貼壁、生長(zhǎng)和擴(kuò)展成單層貼壁依賴性細(xì)胞在微載體表面上：貼附是進(jìn)一步鋪展和生長(zhǎng)的關(guān)鍵，主要是靠靜電引力和范德華力Vero細(xì)胞在Cytodex-3微載體表面粘附鋪展的形貌變化通常做法：貼壁期采用低攪拌轉(zhuǎn)速，時(shí)攪時(shí)停；數(shù)小時(shí)后，待細(xì)胞附著于微載體表面時(shí)，維持設(shè)定的低轉(zhuǎn)速，進(jìn)入培養(yǎng)階段。微載體培養(yǎng)的攪拌非常慢，最大速度75r/min。2、攪拌轉(zhuǎn)速：動(dòng)物細(xì)胞無(wú)細(xì)胞壁，對(duì)剪切力敏感，無(wú)法靠提高攪拌轉(zhuǎn)速來(lái)增加接觸概率。3、細(xì)胞與微載體的相融性：與微載體表面理化性質(zhì)有關(guān)。一般細(xì)胞在進(jìn)入生理pH值時(shí)，表面帶負(fù)電荷。若微載體帶正電荷，則利用靜電引力可加快細(xì)胞貼壁速度。若微載體帶負(fù)電荷，因靜電斥力使細(xì)胞難于黏附貼壁，但培養(yǎng)液中溶有或微載體表面吸附著二價(jià)陽(yáng)離子作為媒介時(shí)，則帶負(fù)電荷的細(xì)胞也能貼附。(a)MCC細(xì)胞，未經(jīng)處理的Cytodex-3表面；(b)MCC細(xì)胞，用纖粘連蛋白處理后的Cytodex-3表面(c)Vero細(xì)胞，未經(jīng)處理的Cytodex-3表面；(d)Vero細(xì)胞，用層粘連蛋白處理的Cytodex-3表面(e)Vero細(xì)胞，用纖粘連蛋白處理的Cytodex-3表面細(xì)胞（Vero和MCC）在不同外源基質(zhì)處理的（Cytodex-3）微載體上貼附4、細(xì)胞在微載體表面的生長(zhǎng)受影響因素：細(xì)胞方面：細(xì)胞群體、狀態(tài)和類型。微載體方面：微載體表面狀態(tài)、吸附的大分子和離子；微載體表面光滑時(shí)細(xì)胞擴(kuò)展快，表面多孔則擴(kuò)展慢。培養(yǎng)環(huán)境中：培養(yǎng)基組成、溫度、pH、DO以及代謝廢物等均明顯影響細(xì)胞在微載體上的生長(zhǎng)。如果所處條件最優(yōu)，則細(xì)胞生長(zhǎng)快；反之生長(zhǎng)速度慢。

交聯(lián)葡聚糖纖維素為基質(zhì)微載體蛋白質(zhì)為基質(zhì)微載體（變性膠原微載體:蛋黃色，表面特性好，易與細(xì)胞結(jié)合）高分子材料為基質(zhì)微載體無(wú)機(jī)玻璃基質(zhì)微載體

微載體基質(zhì)PCL微球表面多皺，PLLA微球表面布滿坑洞，PGLA微球表面光滑不同種類聚酯的微球表面形貌差異多孔載體培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn):降低血清用量，增加細(xì)胞固定性。生長(zhǎng)空間大，免受機(jī)械損傷，可以提高攪拌強(qiáng)度和通氣量，強(qiáng)化傳質(zhì)。多孔載體不僅能培養(yǎng)貼壁細(xì)胞，也適合懸浮細(xì)胞的固定化連續(xù)灌流培養(yǎng)。多孔載體固定細(xì)胞過(guò)程簡(jiǎn)單，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害和損傷，細(xì)胞可從長(zhǎng)滿細(xì)胞的微載體中自動(dòng)轉(zhuǎn)移到未長(zhǎng)細(xì)胞的新載體上生長(zhǎng)，接種方便，培養(yǎng)簡(jiǎn)單，特別適合于反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)。5、微載體培養(yǎng)操作要點(diǎn)

●培養(yǎng)初期：

保證培養(yǎng)基與微球體處于穩(wěn)定的pH與溫度水平，接種細(xì)胞（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期）至終體積1/3的培養(yǎng)液中，以增加細(xì)胞與微載體接觸的機(jī)會(huì)。不同的微載體所用濃度及接種細(xì)胞密度不同，常使用2-3g/L的微載體含量，更高的微載體濃度需要控制環(huán)境或經(jīng)常換液。

貼壁階段（3-8d）后，緩慢加入培養(yǎng)液至工作體積，并且增加攪拌速度保證完全均質(zhì)混合。●培養(yǎng)維持期：進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)（胞核計(jì)數(shù)）、葡萄糖測(cè)定及細(xì)胞形態(tài)鏡檢。隨著細(xì)胞增殖，微球變得越來(lái)越重，需增加攪拌速率。經(jīng)過(guò)3d左右，培養(yǎng)液開始呈酸性，需換液（停止攪拌，讓微珠沉淀5min，棄掉適宜體積的培養(yǎng)液，緩慢加入新鮮培養(yǎng)液（37℃），重新開始攪拌?！裎⑤d體培養(yǎng)的放大：可以通過(guò)增加微載體的含量或培養(yǎng)體積進(jìn)行放大。使用異倍體或原代細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)疫苗、干擾素，已被放大至4000L以上。細(xì)胞形態(tài)飽滿、生長(zhǎng)良好細(xì)胞形態(tài)更加立體，輪廓清晰，細(xì)胞數(shù)量明顯增加，少量微載體上細(xì)胞幾乎長(zhǎng)滿微載體上細(xì)胞基本長(zhǎng)滿，細(xì)胞形態(tài)健康微載體上細(xì)胞更加致密，細(xì)胞密度達(dá)到5×106個(gè)/ml以上微載體上細(xì)胞依然良好，沒(méi)有明顯細(xì)胞脫落現(xiàn)象

Marc145細(xì)胞微載體培養(yǎng)第1天

Marc145細(xì)胞微載體培養(yǎng)第2天

Marc145細(xì)胞微載體培養(yǎng)第3天

Marc145細(xì)胞微載體培養(yǎng)第4天

Marc145細(xì)胞微載體培養(yǎng)第