生物學(xué)標(biāo)志物在流行病學(xué)研究中的應(yīng)用

生物學(xué)標(biāo)志物在流行病學(xué)研究中的應(yīng)用第1頁(yè)/共45頁(yè)學(xué)習(xí)目標(biāo)掌握生物學(xué)標(biāo)志物的概念掌握生物學(xué)標(biāo)志物的分類(lèi)理解生物學(xué)標(biāo)志物的用途理解在流行病學(xué)研究中使用生物學(xué)標(biāo)志物應(yīng)注意的問(wèn)題第2頁(yè)/共45頁(yè)操作目標(biāo)在設(shè)計(jì)應(yīng)用生物學(xué)標(biāo)志物的流行病學(xué)研究時(shí)能夠做到合理選擇標(biāo)志物閱讀應(yīng)用生物學(xué)標(biāo)志物的文獻(xiàn)時(shí)能夠分析其合理性第3頁(yè)/共45頁(yè)什么是生物標(biāo)志物生物標(biāo)志物是從生物學(xué)介質(zhì)中可以檢測(cè)到的細(xì)胞、生物化學(xué)或分子改變。生物學(xué)介質(zhì)包括各種體液（如血液、尿液）、糞便、組織、細(xì)胞、頭發(fā)、呼氣等。第4頁(yè)/共45頁(yè)為什么要用生物標(biāo)志物暴露測(cè)量：精確研究對(duì)象選擇：減少錯(cuò)分機(jī)體反應(yīng)：提前發(fā)現(xiàn)個(gè)體易感性：暴露 健康損害：有助于闡明機(jī)理第5頁(yè)/共45頁(yè)從暴露到發(fā)病的途徑暴露內(nèi)部劑量生物學(xué)有效劑量早期反應(yīng)機(jī)體結(jié)構(gòu)/機(jī)能改變疾病個(gè)體易感性第6頁(yè)/共45頁(yè)生物標(biāo)志物的分類(lèi)暴露標(biāo)志物內(nèi)部劑量標(biāo)志物生物學(xué)有效劑量標(biāo)志物易感性標(biāo)志物效應(yīng)標(biāo)志物：機(jī)體早期反應(yīng)與疾病標(biāo)志第7頁(yè)/共45頁(yè)內(nèi)部劑量標(biāo)志物內(nèi)部劑量標(biāo)志物是在生物材料中測(cè)得的暴露物質(zhì)或暴露物質(zhì)的代謝產(chǎn)物。第8頁(yè)/共45頁(yè)生物學(xué)有效劑量標(biāo)志物與重要的亞細(xì)胞靶結(jié)構(gòu)相互作用的暴露物質(zhì)劑量即生物學(xué)有效劑量。第9頁(yè)/共45頁(yè)易感性標(biāo)志物可測(cè)得的遺傳或獲得性因素的指示物。易感性本身不引起疾病，但可影響暴露引發(fā)疾病的概率。第10頁(yè)/共45頁(yè)生物學(xué)反應(yīng)標(biāo)志物因?qū)Ρ┞斗磻?yīng)而引起的靶細(xì)胞或組織的生物學(xué)改變第11頁(yè)/共45頁(yè)疾病標(biāo)志物疾病標(biāo)志物是一生物學(xué)或生物化學(xué)事件的指示物，它預(yù)示著疾病的亞臨床期或是疾病自身的一種表現(xiàn)第12頁(yè)/共45頁(yè)流行病學(xué)研究中常用的

幾種生物標(biāo)志物暴露物質(zhì)本身或其體內(nèi)代謝產(chǎn)物染色體改變：如染色體畸變、姊妹染色單體交換、微核等DNA加合物、蛋白質(zhì)加合物各種酶類(lèi)基因與癌基因第13頁(yè)/共45頁(yè)暴露劑量生物學(xué)標(biāo)志物的用途綜合反映多途徑暴露綜合反映飄忽不定的暴露將暴露發(fā)生時(shí)間同內(nèi)部劑量聯(lián)系起來(lái)研究急性暴露與健康結(jié)局之間的聯(lián)系研究長(zhǎng)期暴露與健康結(jié)局之間的聯(lián)系從混合暴露物中區(qū)分出致病性物質(zhì)增加對(duì)發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)估計(jì)總的健康危害第14頁(yè)/共45頁(yè)易感性生物學(xué)標(biāo)志物的用途估計(jì)個(gè)體發(fā)病危險(xiǎn)性增加對(duì)暴露-疾病聯(lián)系強(qiáng)度估計(jì)的精確性提供發(fā)病機(jī)理的線(xiàn)索

目前研究熱點(diǎn)：代謝酶、受體、DNA修復(fù)酶基因的多態(tài)性與人群的腫瘤易感性研究。第15頁(yè)/共45頁(yè)早期生物學(xué)反應(yīng)和疾病生物標(biāo)志物的用途有助于早期發(fā)現(xiàn)健康損害在建立隊(duì)列時(shí)，將亞臨床期疾病病人排除改進(jìn)對(duì)疾病誘導(dǎo)期、潛伏期的估計(jì)確定暴露發(fā)生作用的疾病發(fā)展階段使疾病的分類(lèi)更為合理第16頁(yè)/共45頁(yè)例1、用TNT-Hb加合物估計(jì)TNT的暴露劑量三硝基甲苯(TNT)進(jìn)入體內(nèi)途徑：呼吸道、消化道、皮膚暴露劑量因工種、時(shí)間而異傳統(tǒng)對(duì)暴露的測(cè)定方法：環(huán)境TNT粉塵濃度，對(duì)經(jīng)消化道和皮膚吸收難以估計(jì)生物檢測(cè)：血、尿中TNT代謝物測(cè)定：反映近期暴露第17頁(yè)/共45頁(yè)TNT從各種途徑吸收進(jìn)入血液以后，部分與血紅蛋白結(jié)合，形成TNT-Hb加合物TNT-Hb加合物與傳統(tǒng)的暴露劑量指標(biāo)、工種、TNT晶狀體白內(nèi)障有無(wú)等相關(guān)，表明這加合物能夠真實(shí)反映暴露水平TNT-Hb加合物相對(duì)穩(wěn)定(3個(gè)月內(nèi))TNT-Hb反映了多途徑總的暴露劑量第18頁(yè)/共45頁(yè)例2、黃曲霉毒素與肝癌關(guān)系研究以往多次流行病學(xué)調(diào)查表明，食用霉變食物增加肝癌發(fā)生的危險(xiǎn)性食物中的黃曲霉毒素含量因季節(jié)、地區(qū)、因素習(xí)慣不同而不同對(duì)個(gè)體黃曲霉毒素的攝入量估計(jì)困難缺乏黃曲霉致病的直接證據(jù)第19頁(yè)/共45頁(yè)隊(duì)列內(nèi)病例對(duì)照研究：18,000份45-64歲健康男性尿液標(biāo)本，隨訪7年，50人發(fā)生肝癌。尿中黃曲霉毒素陽(yáng)性發(fā)生肝癌的危險(xiǎn)度RR為3，乙肝表面抗原陽(yáng)性的危險(xiǎn)度RR為7，兩者均陽(yáng)性的危險(xiǎn)度為60?？梢?jiàn)兩種危險(xiǎn)因素的作用間有相乘作用。第20頁(yè)/共45頁(yè)生物標(biāo)志物的選擇關(guān)聯(lián)性：所選用的生物學(xué)標(biāo)志物應(yīng)與所研究的暴露-疾病關(guān)系有關(guān)聯(lián)真實(shí)性：所選用的暴露標(biāo)志物應(yīng)能反映暴露有無(wú)及其劑量可靠性：即可重復(fù)性穩(wěn)定性：所選用的標(biāo)志物應(yīng)相對(duì)穩(wěn)定第21頁(yè)/共45頁(yè)應(yīng)用生物學(xué)標(biāo)志物應(yīng)注意的問(wèn)題個(gè)體間變異：不同個(gè)體同一組織器官中標(biāo)志物的出現(xiàn)頻率和量有可能相差很大組織間變異：同一個(gè)體不同組織器官之間標(biāo)志物出現(xiàn)的頻率和量可能差別較大測(cè)定方法；不同測(cè)定方法的靈敏度不同樣本含量：由于測(cè)定方法的復(fù)雜性或費(fèi)用問(wèn)題，樣本含量一般較小，因此統(tǒng)計(jì)把握度較低第22頁(yè)/共45頁(yè)流行病學(xué)研究設(shè)計(jì)特點(diǎn)橫斷面研究：應(yīng)用生物學(xué)標(biāo)志物的流行病學(xué)研究大多具有橫斷面的特點(diǎn)病例-對(duì)照研究：實(shí)質(zhì)上也為橫斷面病例-病例研究：將某種疾病病例按標(biāo)志物有無(wú)分為兩組，比較兩組間某些因素的差異隊(duì)列內(nèi)（巢式）病例-對(duì)照研究：需要在隊(duì)列建立時(shí)采取并儲(chǔ)存生物標(biāo)本，如血清第23頁(yè)/共45頁(yè)應(yīng)用生物學(xué)標(biāo)志物的優(yōu)點(diǎn)暴露標(biāo)志物對(duì)暴露的測(cè)定更精確減少暴露錯(cuò)分易感性標(biāo)志物可篩檢出易感個(gè)體估計(jì)個(gè)體危險(xiǎn)性生物學(xué)反應(yīng)標(biāo)志物可發(fā)現(xiàn)早期反應(yīng)有助于揭示暴露致病機(jī)理第24頁(yè)/共45頁(yè)應(yīng)用生物學(xué)標(biāo)志物的缺點(diǎn)有些標(biāo)志物測(cè)定方法復(fù)雜、費(fèi)用昂貴無(wú)法對(duì)久遠(yuǎn)的暴露進(jìn)行測(cè)量不宜對(duì)隨時(shí)間變動(dòng)較大的暴露進(jìn)行測(cè)量樣本量一般較小，研究的把握度較小不易控制多個(gè)因素的混雜作用許多標(biāo)志物的本質(zhì)尚不完全明了第25頁(yè)/共45頁(yè)生物標(biāo)志物小結(jié)合理選用生物學(xué)標(biāo)志物會(huì)增強(qiáng)流行病學(xué)在探索暴露-疾病之間關(guān)系方面的能力不加選擇地使用生物學(xué)標(biāo)志物并不能提高流行病學(xué)研究的質(zhì)量傳統(tǒng)方式的流行病學(xué)調(diào)查仍會(huì)繼續(xù)應(yīng)用第26頁(yè)/共45頁(yè)分子流行病學(xué)定義：利用現(xiàn)代分子生物學(xué)原理和技術(shù)，從分子乃至基因水平闡明疾病和健康狀態(tài)的相關(guān)生物標(biāo)志物（或分子事件）在人群中的分布及其影響因素，并研究防制疾病、促進(jìn)健康的策略與措施的科學(xué)。第27頁(yè)/共45頁(yè)傳統(tǒng)流行病學(xué)與分子流行病學(xué)傳統(tǒng)流行病學(xué)：暴露 疾病

以分布為基礎(chǔ)，進(jìn)行病因推斷。第28頁(yè)/共45頁(yè)分子流行病學(xué)的切入點(diǎn)暴露內(nèi)部劑量生物學(xué)有效劑量早期反應(yīng)機(jī)體結(jié)構(gòu)/機(jī)能改變疾病易感標(biāo)志物-------暴露標(biāo)志-----------效應(yīng)標(biāo)志---第29頁(yè)/共45頁(yè)生物標(biāo)志物的種類(lèi)1、暴露標(biāo)志2、易感標(biāo)志3、效應(yīng)標(biāo)志第30頁(yè)/共45頁(yè)如何進(jìn)行工作？1、標(biāo)志物的篩選：能反映疾病的進(jìn)程；特異性高、穩(wěn)定性好；檢測(cè)方法靈敏、特異、快速方便。2、標(biāo)本采集與儲(chǔ)存：無(wú)污染；不變質(zhì)；標(biāo)本檔案材料要齊全。第31頁(yè)/共45頁(yè)3、檢測(cè)技術(shù)要合適。（1）DNA水平：PCR、SSCP、測(cè)序（2）RNA水平：RT-PCR、NorthernBlot

（3）蛋白質(zhì)水平：WesternBlot、組化（4）功能水平：酶學(xué)、機(jī)能學(xué)第32頁(yè)/共45頁(yè)4、設(shè)計(jì)方案的要求：（1）與流行病學(xué)研究方法一致。（2）樣本種類(lèi)和樣本量的確定。（3）檢測(cè)指標(biāo)的選擇：要有理論依據(jù)；考慮到縱向和橫向?qū)Ρ?。?）強(qiáng)調(diào)多學(xué)科的合作。第33頁(yè)/共45頁(yè)分子流行病學(xué)主要研究方法一、選擇生物標(biāo)志物作為測(cè)量指標(biāo)“暴露---易感----效應(yīng)”三大類(lèi)要求：（1）.特異、穩(wěn)定（2）.標(biāo)本采集、儲(chǔ)存方便（3）.檢測(cè)方法簡(jiǎn)便、實(shí)用、規(guī)范（4）.靈敏度和特異度高第34頁(yè)/共45頁(yè)二、標(biāo)本收集與儲(chǔ)存建立與檢測(cè)技術(shù)相適應(yīng)的生物標(biāo)本庫(kù)。要求:（1）.無(wú)污染。（2）.每個(gè)標(biāo)本都有標(biāo)識(shí)和病例背景。（3）.儲(chǔ)存標(biāo)本在有效期內(nèi)結(jié)果穩(wěn)定。第35頁(yè)/共45頁(yè)三、常用分子生物學(xué)及相關(guān)技術(shù)簡(jiǎn)介

1、DNA:Southernblot;PCR;Sequencing.Enzymerestriction;electrophoresis.2、RNA:Northernblot;Dotblot;RT-PCR.3、Protein:Westernblot;Immuno-histochemistry.第36頁(yè)/共45頁(yè)四、資料分析：

1、傳統(tǒng)流行病學(xué)指標(biāo)。

2、遺傳學(xué)多態(tài)性、雜合度等。

3、連鎖與分離分析。

4、易感性與危險(xiǎn)度分析。第37頁(yè)/共45頁(yè)五、質(zhì)量控制

1、儀器設(shè)備的計(jì)量校正、正確使用。

2、實(shí)驗(yàn)試劑的批次不變。

3、標(biāo)本采集和儲(chǔ)存能確保其生物性狀。

4、實(shí)驗(yàn)方法統(tǒng)一，操作規(guī)范。

5、設(shè)立多重對(duì)照：標(biāo)準(zhǔn)、空白、+、-。

6、重復(fù)試驗(yàn)。第38頁(yè)/共45頁(yè)六、研究實(shí)例1、應(yīng)用PCR和測(cè)序追蹤HIV傳染源。某地1名牙醫(yī)（HIV+）與7名HIV感染者(該牙醫(yī)治療過(guò)的病人)有無(wú)傳播關(guān)系？同時(shí)抽查35名與該牙醫(yī)無(wú)關(guān)的HIV感染，取外周血分離單核細(xì)胞，經(jīng)PCR、測(cè)序；結(jié)果：牙醫(yī)HIV株與5名其治療過(guò)的病人的HIV同株,其它毒株與牙醫(yī)株關(guān)系較遠(yuǎn)。第39頁(yè)/共45頁(yè)2、GSTm1基因多態(tài)與潮汕地區(qū)食管癌易感性的關(guān)系。107例食管癌，111例正常人，外周血提取DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。無(wú)產(chǎn)物為“-”。

GSTm1casecontrol-6855+3956

合計(jì)107111X2=4.34,P=0.0371,OR=1.78(1.01,3.07)第40頁(yè)/共45頁(yè)研究實(shí)例1研究題目波蘭某工業(yè)區(qū)環(huán)境中芳香族化合物暴露人群的DNA加合物研究測(cè)量指標(biāo)

DNA加合物/淋巴細(xì)胞DNA（介質(zhì)）測(cè)量方法

熒光檢測(cè)競(jìng)爭(zhēng)ELISA法、DNA加合物32P后標(biāo)記技術(shù)研究設(shè)計(jì)橫斷面分析研究

暴露組煤焦油作業(yè)工人

對(duì)照組當(dāng)?shù)爻鞘芯用?、近郊農(nóng)民排除年齡、吸煙、其他職業(yè)暴露等因素影響比較3組DNA加合物水平第三節(jié)研究方法第41頁(yè)/共45頁(yè)結(jié)果分析

當(dāng)?shù)爻鞘芯用瘢?9例）與煤焦瀝青作業(yè)工人（63例）的DNA加合物水平和譜型相似近郊農(nóng)民（15例）的DNA加合物水平僅為煤焦油作業(yè)工人的1/2或1/3

結(jié)論

環(huán)境中芳香族化合物（煤焦油）暴露可導(dǎo)致體內(nèi)DNA加合物水平質(zhì)量控制

每份標(biāo)本同時(shí)在不同實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果一致性好(r=0.66,p<0.01)第三節(jié)研究方法第42頁(yè)/共45頁(yè)研究實(shí)例2研究題目應(yīng)用HBV-DNA序列多態(tài)性研究HBV的傳播測(cè)量標(biāo)志

HBV2551-2650位點(diǎn)核酸序列/血清HBV-DNA測(cè)量方法ELISA法和PCR法研究設(shè)計(jì)