離體培養(yǎng)液蔗糖濃度對水稻籽粒蔗糖合成酶活性的影響課件

離體培養(yǎng)液蔗糖濃度對水稻籽粒蔗糖合成酶活性的影響植物學(xué)專題討論之二導(dǎo)師：粱建生教授報告人：王玉霞2005年12月20日前言蔗糖合成酶的作用：

蔗糖+UDP果糖＋UDPG一、試驗設(shè)置1.材料與方法1.1供試材料

供試品種為具較高結(jié)實率的超級稻兩優(yōu)培九。2004年種植于揚州大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗田，單本植，田間管理一致，同一般大田栽培。始穗期選擇生育進(jìn)程和長勢長相基本一致的主莖進(jìn)行標(biāo)記,待稻穗穗頸節(jié)露出劍葉鞘1～2ｄ,取樣進(jìn)行穗培養(yǎng)（1）不同濃度的蔗糖溶液處理

0、50、100、150、200mM（2）不同時間的蔗糖溶液處理

12、24、48h（3）不同滲透性溶液處理

Mit、Sit、KCl100mM

（4）相同濃度的己糖溶液處理

Glu、Fru、Glu+Fru100mM（5）己糖激酶抑制劑處理

NAG（6）糖類似物溶液處理

Man、3-O-MG1.3試驗處理2.試驗方法2.1蔗糖、可溶性總糖的測定2.2蔗糖合成酶活性的測定10ml80%乙醇80C水浴30min冷卻殘渣10ml80%乙醇80C水浴30min2000rpm離心15min冷卻2000rpm離心15min殘渣10ml80%乙醇80C水浴30min冷卻2000rpm離心15min殘渣合并三次上清液0.1克干樣定容至100ml蔗糖測定可溶性總糖測定吸0.9ml提取液吸1.0ml提取液0.1ml2NNaOH1.0ml水沸水浴10min4ml0.2%蒽酮冷卻15min沸水浴1ml0.1%間苯二酚3ml10NHCl80C水浴60min冷卻比色OD500冷卻比色OD620

酶的反應(yīng)介質(zhì)為：0.2ml的反應(yīng)介質(zhì)中含有50mmol/LHepes/KOH(pH7.5),5mmol/LMgcl2,3mmol/LUDPG,15mmol/L果糖，一定量的酶液。酶的活性測定過程參照Roe（1934）的方法，混合物30℃反應(yīng)30分鐘2mol/LNaOH溶液終止反應(yīng)，用間苯二酚測定生成的蔗糖的量。酶活力單位為μmol蔗糖/mg蛋白·分鐘。

蛋白質(zhì)含量測定：蛋白質(zhì)的測定用Bradford(1976)方法，以BSA為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。二、結(jié)果與分析1.不同濃度的蔗糖處理對水稻籽粒中蔗糖合成酶活性的影響由圖可見，在介質(zhì)蔗糖濃度為100mM范圍內(nèi)，蔗糖合成酶活性隨蔗糖 濃度的提高而提高，當(dāng)蔗糖濃度為150mM時略有下降，之后又再升高。Fig.1.CarbohydratecontentsandSuSyactivityinthegrainsofrice.Excisedricepanicleswerefedwithsolutioncontainingtheindicatedconcentrationsofsucrose(0-200mM).3.不同滲透性糖對水稻籽粒中蔗糖合成酶活性的影響Table1.EffectofvariousosmoticallyactivysugarsonSuSyactivityinricegrainfromexcisedricepanicles

thatwereculturedfor24hinwater,sucrose,Kcl,mannitol,orsoribitol.

由表1看出，用Kcl、甘露醇、山梨醇作為糖介質(zhì)培養(yǎng)離體穗24小時，在百粒重、蔗糖含量、總糖含量及蔗糖合成酶活性與對照差異不大，這說明蔗糖對籽粒發(fā)育以及蔗糖合成酶活性的調(diào)節(jié)不是因為滲透壓的影響。4.己糖和抑制劑處理對水稻籽粒中蔗糖合成酶活性的影響NAG:N-acetyl-glucosamine,aninhibitorofhexokinase(HXK);SuSy:SucrosesynthaseTable2.EffectofhexosesandNAGonSuSyactivity.InexperimentA,excisedricepanicleswerefedwater,100mMsucrose,100mMglucose,100mMfructose,or100mMglucoseplus100mMfructosefor24h.InexperimentB,excisedricepanicleswerefed

wateror100mMsucrose,glucose,fructoseinthepresenceorabsenceof10mMNAGfor24h.由表2可見，等摩爾濃度的己糖處理后蔗糖合成酶活性雖有提高，但這種效應(yīng)要低于蔗糖對它的影響。模擬蔗糖水解的處理也沒有達(dá)到蔗糖的促進(jìn)效應(yīng)。加入NAG阻斷己糖調(diào)節(jié)途徑，對蔗糖的調(diào)節(jié)效應(yīng)沒有大的影響。這說明蔗糖調(diào)節(jié)是不依賴己糖激酶的途徑。5.己糖類似物處理對水稻籽粒中蔗糖合成酶活性的影響Table3.SugarregulationofSuSyactivityinthericegrains.Excisedricepanicleswerefedwithwater,20mMsucrose,20mMglucose,20mMmannoseand20mM3-O-methylglucose(3-O-MG)inthedarkfor24h.由表3可知，糖的類似物甘露糖，3－氧甲基葡萄糖培養(yǎng)離體穗24小時，在百粒重、蔗糖含量、總糖含量及蔗糖合成酶活性與對照差異不大。三、討論1.對蔗糖合成酶活性的調(diào)節(jié)主要是蔗糖的效應(yīng)，且與外源蔗糖的濃度以及內(nèi)源蔗糖含量都是相關(guān)的，2.蔗糖對蔗糖合成酶活性的調(diào)節(jié)是可逆的。3.蔗糖合成酶活性在一定濃度范圍內(nèi)與蔗糖濃度成正效應(yīng)。4.外源蔗糖的加入會改變?nèi)芤旱乃畡萦绊懻崽堑倪\輸，為了消除滲透壓的影響用相同摩爾濃度的滲透性糖處理證明蔗糖調(diào)節(jié)不是滲透壓的影響。

由于植物中的蔗糖易水解成葡萄糖和果糖，所以對蔗糖特異的信號傳導(dǎo)途徑的解釋較困難。然而，最近的實驗表明，因植物存在蔗糖特異的信號傳導(dǎo)途徑從而影響基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。例如，蔗糖特異地誘導(dǎo)patatin啟動子基因轉(zhuǎn)錄首次證明蔗糖能特異地對蔗糖同向轉(zhuǎn)運體的轉(zhuǎn)錄和翻譯進(jìn)行調(diào)節(jié)，而己糖等其他糖則不具備此調(diào)節(jié)作用。本實驗也證明蔗糖合成酶活性是受蔗糖調(diào)節(jié)的。

關(guān)于植物糖感知和信號傳導(dǎo)機制的研究取得很大進(jìn)展，已經(jīng)從擬南芥中分離出了許多糖響應(yīng)突變體，糖調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其與多重信號傳導(dǎo)途徑相互作用的關(guān)系圖已見雛形，但對不同糖水平下信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行詳細(xì)解