第14講微陣列技術(shù)

第14講微陣列技術(shù)第一頁，共75頁。1997年，《財富》雜志就報道說，“在20世紀(jì)科技史上有兩件事影響深遠(yuǎn)：一是微電子芯片，它是計算機和許多家電的‘心臟’，改變了我們的經(jīng)濟和文化生活，并已進入每一個家庭；另一就是生物芯片，它將改變生命科學(xué)的研究方式，革新醫(yī)學(xué)診斷和治療，極大地提高人口素質(zhì)和健康水平?！钡诙?，共75頁。1.生物芯片的誕生

生物芯片（Biochip,Bioarray,microarray）：將高密度核酸、抗原、抗體、細(xì)胞或組織等生物識別分子按預(yù)先設(shè)置的排列固定于一種載體（如硅片、玻片及高聚物載體等）表面，利用生物分子的特意性親和反應(yīng)，如DNA-DNA雜交、DNA-RNA雜交、抗原-抗體以及受體-配體之間的特異性結(jié)合，檢測生物樣品中對應(yīng)生物分子的有無、多少或者結(jié)構(gòu)改變等。高通量、微型化和自動化

第三頁，共75頁。在許多情況下，生物學(xué)問題最終的解決都源于技術(shù)上的突破。

——MarkSchena

第四頁，共75頁。后基因組時代，蛋白組學(xué)，涌現(xiàn)出許多功能強大的研究方法和研究工具，最突出的就是細(xì)胞蛋白質(zhì)二維凝膠電泳（2-D-gel）（及相應(yīng)的質(zhì)譜法測蛋白分子量）和生物芯片（Biochip）技術(shù)

生物科學(xué)正迅速地演變?yōu)橐婚T信息科學(xué)生物芯片是信息時代的產(chǎn)物，橫跨：生命科學(xué)、物理學(xué)、計算機科學(xué)、微電子技術(shù)光電技術(shù)、材料科學(xué)、等現(xiàn)代高科技

第五頁，共75頁。生物芯片發(fā)展歷史Southern&NorthernBlotDotBlotMacroarrayMicroarraySouthernblot可以被看作是生物芯片的雛形

第六頁，共75頁。2.生物芯片（微陣列）是如何定義的？必須符合：①有規(guī)則的；②顯微尺度的；③平面的；④特異性的。第七頁，共75頁。①規(guī)則的微陣列微陣列上的點按照行和列規(guī)則地排列而非無規(guī)則排列；點的大小和點間距均一而非不均一；點的位置明確而非模棱兩可。第八頁，共75頁。②顯微尺度的點顯微尺度（microscopic):是一個物體若沒有顯微鏡的幫助，不能清楚地被看見。一般以小于1mm為界。微陣列：光引導(dǎo)原位合成的點：15～30μm點制的點：50～350μm組織芯片的點：200～600μm第九頁，共75頁。一塊指甲大小基因芯片的密度：100-1millionDNA探針/1cm2第十頁，共75頁。③平面基片平面基片是像玻璃、塑料、硅片一樣平行不能彎曲的基質(zhì)載體。玻片是微陣列中用得最為廣泛的基質(zhì)載體。非平面基片：尼龍膜、硝酸纖維素膜等。平坦的表面優(yōu)點：適合大規(guī)模自動化生產(chǎn)；為光掩膜、接觸式針點樣、噴墨式非接觸點樣和其它制備工序提供了精密的距離，確保制備微陣列的高質(zhì)量；使掃描和成像變得容易。第十一頁，共75頁。④特異性吸附微陣列上的每一個點能與標(biāo)記好的探針混合物中的一種分子發(fā)生吸附，才能對此基因或基因產(chǎn)物進行精確的檢測第十二頁，共75頁。Principle：Hybridizationofthetargettotheprobe

第十三頁，共75頁。核酸分子固相雜交方法菌落原位雜交（Colonyinsituhybridization）Southern印跡雜交（Southernblot）Northern印跡雜交（Northernblot）斑點雜交（Dotblot）組織原位雜交（Tissueinsituhybridization）第十四頁，共75頁。Hybridizationmethods

第十五頁，共75頁。SouthernandNorthernblothybridization第十六頁，共75頁。Colonyinsituhybridization第十七頁，共75頁。Fluorescentinsituhybridization(FISH)第十八頁，共75頁。抗原抗體酶聯(lián)免疫吸附測定

(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA)第十九頁，共75頁。3.Biochip的類型

①狹義：微陣列芯片，主要包括cDNA微陣列、寡核苷酸微陣列、蛋白質(zhì)微陣列和小分子化合物微陣列等②廣義：能對生物成分或生物分子進行快速并行處理和分析的厘米見方的固體薄型器件，主要還包括微流體芯片和“芯片實驗室”。第二十頁，共75頁。生物芯片的類型基因芯片genechip：又稱DNA芯片,是根據(jù)核酸雜交的原理，將大量探針分子固定于支持物上，然后與標(biāo)記的樣品進行雜交，通過檢測雜交信號的強度及分布來進行分析。蛋白質(zhì)芯片proteinchip：利用抗體與抗原特異性結(jié)合即免疫反應(yīng)的原理，將蛋白質(zhì)分子（抗原或抗體）結(jié)合到固相支持物上，形成蛋白質(zhì)微陣列，即蛋白質(zhì)芯片。組織芯片tissuemicroarray芯片實驗室(labs-on-chip)

：微流體芯片：微流控芯片技術(shù)(Microfluidics)是把生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)分析過程的樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測等基本操作單元集成到一塊微米尺度的芯片上，自動完成分析全過程。第二十一頁，共75頁。第二十二頁，共75頁。蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片（proteinchip）,又稱蛋白質(zhì)微陣列，是指以蛋白質(zhì)或多肽作為配基,將其有序地固定在固相載體的表面形成微陣列；用標(biāo)記了熒光的蛋白質(zhì)或其它分子與之作用，洗去未結(jié)合的成分，經(jīng)熒光掃描等檢測方式測定芯片上各點的熒光強度，來分析蛋白質(zhì)之間或蛋白質(zhì)與其它分子之間的相互作用關(guān)系。第二十三頁，共75頁。Therearetwogeneraltypesofproteinmicroarray:Analyticalproteinmicroarraysinvolveahigh-densityarrayofaffinityreagents(e.g.antibodiesorantigens)thatareusedfordetectingproteinsinacomplexmixture.Functionalproteinchipsareconstructedbyimmobilizinglargenumbersofpurifiedproteinsonasolidsurface.Ithasanenormouspotentialinassayingforawiderangeofbiochemicalactivities(protein-protein,protein-lipid,protein-nucleicacid,andenzyme-substrateinteractions),aswellasdruganddrugtargetidentification.第二十四頁，共75頁。組織芯片它將數(shù)十個甚至上千個不同個體的組織標(biāo)本集成在一張固相載體上，為醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)提供了一種高通量、大樣本以及快速的分子水平的分析工具研究者一次可有效利用成百上千份自然或出于疾病狀態(tài)下的組織標(biāo)本來研究特定基因及其所表達的蛋白質(zhì)與疾病之間的相關(guān)關(guān)系對于疾病的分子診斷，預(yù)后指標(biāo)和治療靶點的定位，抗體和藥物的篩選等方面均有十分重要的實用價值。第二十五頁，共75頁。測序芯片任何線狀的單鏈DNA或RNA序列均可被分解為一個序列固定、錯落而重疊的寡核苷酸，又稱亞序列（subsequence）。例如可把寡核苷酸序列TTAGCTCATATG分解成5個8nt亞序列；這5個亞序列依次錯開一個堿基而重疊7個堿基。亞序列中，A、T、C、G4個堿基自由組合而形成的所有可能的序列共有65536種。

第二十六頁，共75頁。人工合成的已知序列的所有可能的nt寡核苷酸探針與一個未知的熒光標(biāo)記DNA/RNA序列雜交，通過對雜交熒光信號檢測，檢出所有能與靶DNA雜交的寡核苷酸，從而推出靶DNA中的所有8nt亞序列，最后由計算機對大量熒光信號的譜型（pattern）數(shù)據(jù)進行分析，重構(gòu)靶DNA的互補寡核苷酸序列。

測序芯片原理第二十七頁，共75頁。測序芯片原理芯片測序的原理是雜交測序方法，即通過與一組已知序列的核酸探針雜交進行核酸序列測定的方法。如圖在一塊基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探針。當(dāng)溶液中帶有熒光標(biāo)記的核酸序列TATGCAATCTAG，與基因芯片上對應(yīng)位置的核酸探針產(chǎn)生互補匹配時，通過確定熒光強度最強的探針位置，獲得一組序列完全互補的探針序列。據(jù)此可重組出靶核酸的序列。

第二十八頁，共75頁。ChIP-chip(chromatinimmunoprecipitation（ChIP)：在生理狀態(tài)下把胞內(nèi)蛋白質(zhì)和DNA甲醛作用下交聯(lián)在一起，用超聲波打碎為0.2-2kb的染色體小片段，然后通過目的蛋白質(zhì)特異性抗體沉淀此復(fù)合物，獲得特異地作用于目的蛋白結(jié)合的DNA片段，通過對目的片段的純化與檢測，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。

ChIP-chip：將共沉淀的DNA和合適的對照用熒光標(biāo)記，加在載玻片上，用于芯片分析。使用外源性DNA作為背景，免疫沉淀DNA與作為背景的對照進行比較，可以找到特異性蛋白在基因組中的結(jié)合位點。

POI，proteinofinterest第二十九頁，共75頁。表達譜芯片基因表達譜芯片是采用DNA片段作探針，固化在芯片上；將待測樣品（處理組）與對照樣品的cDNA以兩種不同的熒光分子進行標(biāo)記，然后同時與芯片進行雜交，通過分析兩種樣品與探針雜交的熒光強度的比值，來檢測基因表達水平的變化。

第三十頁，共75頁。單核苷酸多態(tài)芯片(SNP-chip)WhatareSNPs?SNPsmakeup90%ofallhumangeneticvariations,≥1%occurevery100to300basesalongthehumangenome,onaverage.SNPscanaffecthowhumansdevelopdiseases,respondtopathogens,chemicals,drugs,etc.AsaconsequenceSNPsareofgreatvaluetobiomedicalresearchandindevelopingpharmacyproducts.Wehavetwoalleles:Frommomandfromdad；EachoneiseitherAorB,soyoucanbeAA,AB,BBSNP-chipisusedtodeterminegenotypefor1000sSNPsatatime第三十一頁，共75頁。單核苷酸多態(tài)芯片(SNP-chip)ThethreemandatorycomponentsoftheSNParraysare:Anarraycontainingimmobilizedallele-specificoligonucleotide(ASO)probes.SNP-chiphasmillionsofspots,eachcontainingadifferentsingle-strandedoligonucleotidethatcontainsasiteofvariation.（ASOprobes，600,000SNPsforanAffymetrixSNP-chip）EachoftheprobesoneachpositionofthechipcorrespondstoageneticlocusForeachsuchsite,thefouroligonucleotidescontainingeachofthefourpossiblebasesatthatsiteareadjacenttoeachotheronthechipFragmentednucleicacidsequencesoftarget,labeledwithfluorescentdyes.Adetectionsystemthatrecordsandinterpretsthehybridizationsignal.第三十二頁，共75頁。單核苷酸多態(tài)芯片(SNP-chip)hybridizationconditions！第三十三頁，共75頁。第三十四頁，共75頁。比較基因組雜交芯片（CGH-chip）Probe：severalthousandevenlyspacedclonedDNAfragmentsoroligonucleotides,whichhavebeenspottedintriplicateonthearray.第三十五頁，共75頁。Thesamplehasaduplication.第三十六頁，共75頁。4.DNA芯片進行實驗過程生物學(xué)問題的提出、探針設(shè)計與制備以及芯片制備

“根和葉的基因表達有和不同？”把探針固定于載體表面樣品制備（核酸提純、擴增、標(biāo)記）mRNA分離與富集、探針標(biāo)記、PCR、微陣列點制雜交反應(yīng)（樣本與互補模板形成雙鏈）雜交、基片處理、封閉、清洗結(jié)果探測（共聚焦掃描，雙色激光）最常用熒光法：選擇熒光通道、激光設(shè)置、生成圖像數(shù)據(jù)處理和建模（定量軟件，數(shù)據(jù)庫檢索）數(shù)據(jù)定量、計算比率、聚類分析

第三十七頁，共75頁。Stepsinamicroarrayexperiment

第三十八頁，共75頁。芯片制備①探針的設(shè)計：根據(jù)應(yīng)用目的不同，設(shè)計不同的固定于芯片上的探針。表達型芯片探針的設(shè)計：不需要知道待測樣品中靶基因的精確細(xì)節(jié)；序列的特異性應(yīng)放在首要位置（特定區(qū)域的幾套寡聚核苷酸）單核苷酸多態(tài)性檢測芯片探針的設(shè)計：多態(tài)性分析、突變檢測或者基因測序時，每個核苷酸或突變位點都必須檢測出來。

等長移位設(shè)計法通常設(shè)計出一套四種寡聚核苷酸，在靶序列上跨越每個位點，只在中央位點堿基有所不同，根據(jù)每套探針在某一特點位點的雜交嚴(yán)謹(jǐn)程度，即可測定出該堿基的種類?；虮磉_檢測芯片：只需設(shè)計出針對基因中的即可。特定突變位點探針的設(shè)計：疊瓦式策略

②探針的合成原位合成（insitusynthesis）PCR,RT-PCR（點樣法）

第三十九頁，共75頁。AffymetrixGeneChip第四十頁，共75頁?；蛐酒暮铣煞椒c樣芯片：多用于大片段DNANaturalDNA(PCRProducts)geneexpressiongenomicDNAdetection光蝕刻原位合成法：適用于寡核苷酸ArtificialDNA(oligonucleotide，30nt左右)geneexpressionSNPgenotypinggenemutationon-chipSynthesis（insitusynthesis）spotting第四十一頁，共75頁。光蝕刻原位合成法原理是在經(jīng)過處理的載玻片表面鋪上一層連接分子（linker），其羥基上加有光敏保護基團，可用光照除去，用特制的光刻掩膜（photolithographicmask）保護不需要合成的部位，而暴露合成部位，在光作用下去除羥基上的保護基團，游離羥基，利用化學(xué)反應(yīng)加上第一個核苷酸，所加核苷酸種類及在芯片上的部位預(yù)先設(shè)定，所引入的核苷酸帶有光敏保護基團，以便下一步合成。然后按上述方法在其它位點加上另外三種核苷酸完成第一位核苷酸的合成，因而N個核苷酸長的芯片需要4N個步驟。每一個獨特序列的探針稱為一個“feature”，這樣的芯片便具有4N個“feature”，包含了全部長度為N的核苷酸序列。第四十二頁，共75頁。原位光刻合成基因芯片原理光源遮蔽板芯片第四十三頁，共75頁。arrayprobesA3×3arrayCGACGACACGAGCGAGCNucleotideDepositionSequenceACGAMask1AAAAA光蝕刻原位合成法實例第四十四頁，共75頁。arrayprobesA3×3arrayCGACGACACGAGCGAGCNucleotideDepositionSequenceACGC

Mask2CCCCCCAAAAA光蝕刻原位合成法實例第四十五頁，共75頁。A3×3arrayCGACGACACGAGCGAGCGMask3CCCCCCAAAAAGGGGGGCGACGACGAGCGAGCAC光蝕刻原位合成法實例完成的芯片NucleotideDepositionSequenceACG第四十六頁，共75頁。光蝕刻原位合成特征密集程度高可合成任意序列的寡聚核苷酸特異性較差寡聚核苷酸合成長度有限，約20-25個核苷酸堿基。隨長度增加，合成錯誤率增高成本較高，設(shè)計和制造較煩瑣費時常用于基因類型的分析，如突變、正常變異（多態(tài)性）第四十七頁，共75頁。點樣預(yù)先合成好的探針通過類似于噴墨打印機的技術(shù)噴射到玻璃基片表面，或者用針頭點在片基上。全部或部分cDNA：約5005000個核苷酸堿基，通常用于兩種或以上樣本的相關(guān)基因表達分析。第四十八頁，共75頁。點樣儀第四十九頁，共75頁。核酸提純（mRNA分離）與富集（PCR）根據(jù)樣品來源、基因含量及檢測方法和分析目的不同，采用的基因分離、擴增及標(biāo)記方法各異。當(dāng)然，常規(guī)的基因分離、擴增及標(biāo)記技術(shù)完全可以采用，但操作繁瑣且費時。高度集成的微型樣品處理系統(tǒng)如細(xì)胞分離芯片及基因擴增芯片等是實現(xiàn)上述目的的有效手段和發(fā)展方向。樣品制備第五十頁，共75頁。cDNA“A”Cy5

labeledcDNA“B”Cy3

labeledHybridizationScanningLaser1Laser2+AnalysisImageCapture樣品標(biāo)記

為了獲得基因的雜交信號必須對目的基因進行標(biāo)記，目前采用的最普遍的熒光標(biāo)記方法。第五十一頁，共75頁。

表達檢測需要長的雜交時間，更高的嚴(yán)謹(jǐn)性，更高的樣品濃度和低溫度，這有利于增加檢測的特異性和低拷貝基因檢測的靈敏度。突變檢測，要鑒別出單堿基錯配，需要更高的雜交嚴(yán)謹(jǐn)性和更短的時間！雜交第五十二頁，共75頁。Ayellow

spot→agenethathybridizedtobothgreenandredcDNA:expressedbothinhealthycellsandcancercells!檢測用計算機控制的高分辨熒光掃描儀可獲得結(jié)合于芯片上目的基因的熒光信號，通過計算機處理即可給出目的基因的結(jié)構(gòu)或表達信息。第五十三頁，共75頁。生物芯片檢測原理雜交信號的檢測是DNA芯片技術(shù)中的重要組成部分。由于DNA芯片本身的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)，需要確定雜交信號在芯片上的位置，尤其是大規(guī)模DNA芯片由于其面積小，密度大，點樣量很少，所以雜交信號較弱，需要使用光電倍增管或冷卻的電荷偶連照相機(charged-coupleddevicecamera，CCD)攝像機等弱光信號探測裝置。此外，大多數(shù)DNA芯片雜交信號譜型除了分布位點以外還需要確定每一點上的信號強度，以確定是完全雜交還是不完全雜交，因而探測方法的靈敏度及線性響應(yīng)也是非常重要的。雜交信號探測系統(tǒng)主要包括雜交信號產(chǎn)生、信號收集及傳輸和信號處理及成像三個部分組成。第五十四頁，共75頁。熒光標(biāo)記雜交信號的檢測方法生物素標(biāo)記方法中的雜交信號探測第五十五頁，共75頁。熒光標(biāo)記雜交信號的檢測方法激光掃描熒光顯微鏡:將雜交后的芯片經(jīng)處理后固定在計算機控制的二維傳動平臺上，并將一物鏡置于其上方，由氬離子激光器產(chǎn)生激發(fā)光經(jīng)濾波后通過物鏡聚焦到芯片表面，激發(fā)熒光標(biāo)記物產(chǎn)生熒光，光斑半徑約為5－10μm。同時通過同一物鏡收集熒光信號經(jīng)另一濾波片濾波后，由冷卻的光電倍增管探測，經(jīng)模數(shù)轉(zhuǎn)換板轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號。通過計算機控制傳動平臺X－Y方向上步進平移，DNA芯片被逐點照射，所采集熒光信號構(gòu)成雜交信號譜型，送計算機分析處理，最后形成20μm象素的圖像。這種方法分辨率高、圖像質(zhì)量較好。第五十六頁，共75頁。

激光掃描共焦顯微鏡與激光掃描熒光顯微鏡結(jié)構(gòu)非常相似，但是由于采用了共焦技術(shù)因而更具優(yōu)越性。這種方法可以在熒光標(biāo)記分子與DNA芯片雜交的同時進行雜交信號的探測，而無須清洗掉未雜交分子，從而簡化了操作步驟大大提高了工作效率。通過計算機控制激光束或樣品池的移動，便可實現(xiàn)對芯片的二維掃描，移動步長與芯片上寡核苷酸的間距匹配，在幾分鐘至幾十分鐘內(nèi)即可獲得熒光標(biāo)記雜交信號圖譜。其特點是靈敏度和分辨率較高，掃描時間長，比較適合研究用?，F(xiàn)在Affymetrix公司已推出商業(yè)化樣機，整套系統(tǒng)約12萬美元。第五十七頁，共75頁。采用了CCD相機的熒光顯微鏡這種探測裝置與以上的掃描方法都是基于熒光顯微鏡，但是以CCD相機作為信號接收器而不是光電倍增管，因而無須掃描傳動平臺。由于采用了CCD相機，因而大大提高了獲取熒光圖像的速度，曝光時間可縮短至零點幾秒至十幾秒。其特點是掃描時間短，靈敏度和分辨率較低，比較適合臨床診斷用

第五十八頁，共75頁。②生物素標(biāo)記方法中的雜交信號探測

第五十九頁，共75頁。5.基因芯片的應(yīng)用基因功能分析研究檢測與疾病相關(guān)的基因,進而用于疾病診斷藥物篩選,檢測基因突變其他(環(huán)境化學(xué)毒物的篩選

\體質(zhì)醫(yī)學(xué)的研究)第六十頁，共75頁。目前市場情況:基因芯片:>90%藥物篩選:40%診斷:10%基因型檢測:25%其他:<1%第六十一頁，共75頁?；蚬δ芊治鲅芯繉⒊汕先f個我們克隆到的特異性靶基因固定在一塊芯片上，對來源于不同個體不同組織不同細(xì)胞周期不同發(fā)育階段不同分化階段不同病變不同刺激（包括不同誘導(dǎo)不同治療手段）下細(xì)胞內(nèi)的mRNA或逆轉(zhuǎn)錄所得的cDNA進行檢測，從而對這些基因表達的個體特異性組織特異性發(fā)育階段特異性分化階段特異性。進行綜合評定與判斷，極大加快這些基因功能的確立。第六十二頁，共75頁。癌癥、心血管疾病、血液病、遺傳性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、感染性疾病、免疫反應(yīng)相關(guān)性疾病毒物引起的損傷個體化醫(yī)學(xué)等檢測與疾病相關(guān)的基因,

進而用于疾病診斷第六十三頁，共75頁。第六十四頁，共75頁。藥物篩選

在基因功能研究基礎(chǔ)上，特別是確立了與某些疾病相關(guān)基因的表達變化情況后，就可針對疾病發(fā)生機理進行藥物篩選工作。將這些基因特異性片段固定在芯片上，研究病變組織和正常組只在某些藥物刺激下這些基因表達的變化，可快速判斷藥物作用的效果，并進行高通量篩選（highthroughoutscreening），可使新藥開發(fā)獲得技術(shù)上的突破。第六十五頁，共75頁?；蛐酒陌l(fā)展方向進一步提高探針陣列的集成度，如有多家公司的芯片陣列的集成度已達1.0×105左右，這樣基因數(shù)量在1.0×105以下的生物體（大多數(shù)生物體）的基因表達情況只用一塊芯片即可包括。

提高檢測的靈敏度和特異性。如檢測系統(tǒng)的優(yōu)化組合和采用高靈敏度的熒光標(biāo)志。多重檢測以提高特異性，減少假陽性。高自動化、方法趨于標(biāo)準(zhǔn)化、簡單化，成本降低。價格高昂是目前推廣應(yīng)用的主要障礙之一，但隨著技術(shù)的革新，基因芯片的價格將會大大降低。第六十六頁，共75頁。高穩(wěn)定性。寡核苷酸探針、RNA均不穩(wěn)定，易受破壞。而肽核酸（PNA）有望取代普通RNA/DNA探針，可以確保探針的高穩(wěn)定性。研制新的應(yīng)用芯片，如1999年美國環(huán)保局(EPA)組織專家研討會，討論了毒理學(xué)芯片的發(fā)展策略。近來多種新的生物芯片不斷問世，這是物理學(xué)、生物學(xué)與計算機科學(xué)共同的結(jié)晶。研制芯片新檢測系統(tǒng)和分析軟件，