生化儀器中的空白定標(biāo)和質(zhì)控

生化儀器中的空白定標(biāo)和質(zhì)控第1頁/共45頁第二，標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度與試劑空白的吸光度一定要準(zhǔn)確。吸光度受儀器狀況、試劑狀況的影響，如果您的儀器相當(dāng)穩(wěn)定，試劑是影響K值的一個(gè)主要因素。如何確定K值是正確的？一般我們用質(zhì)控血清來檢查，最好是兩種水平的質(zhì)控來檢查，如果質(zhì)控結(jié)果很好，可以說K值是準(zhǔn)確的，用這個(gè)K值計(jì)算出來病人的結(jié)果也是準(zhǔn)確的，所以K值非常關(guān)鍵。K值的真面目：K值實(shí)際上代表了斜率，截距代表試劑空白，試劑空白每天都在變化，所以K值的穩(wěn)定性決定您的儀器與試劑，如果儀器與試劑都十分穩(wěn)定，那K值也很穩(wěn)定。多長時(shí)間定一次標(biāo)合適？這要看您試劑的穩(wěn)定性，質(zhì)控結(jié)果不好，有些項(xiàng)目做試劑空白可以解決，有些項(xiàng)目要做兩點(diǎn)定標(biāo)。酶的項(xiàng)目如何確定K值：一是計(jì)算出來的理論K值；K=(TV×1000)/(SV×L×ε)二是用有酶項(xiàng)目的定標(biāo)液得出K值：目前各公司可以提供多項(xiàng)目的定標(biāo)液，不僅有底物類的項(xiàng)目，也有酶類的項(xiàng)目。第2頁/共45頁生化檢驗(yàn)中的各種空白概念1、試劑空白：由于生化測試測量的吸光度為相對吸光度，所以從理論上說，所有終點(diǎn)法的測試都需要把試劑本身的吸光度扣除。試劑本身的吸光度就是試劑空白。測量方法是按照正常測試的試劑和樣本量第3頁/共45頁把樣本換成蒸餾水來測量。在傳統(tǒng)手工方法中,每次測定都要做至少三個(gè)管:測定管、標(biāo)準(zhǔn)管、空白管。其中空白管是試劑加蒸餾水，測出來也就是試劑空白。因?yàn)椴僮鳝h(huán)境、儀器狀態(tài)、試劑穩(wěn)定性等變異，所以要求每次都要測定試劑空白，稱為實(shí)時(shí)試劑空白。在全自動(dòng)分析儀上，大體上是模擬手工操作。但許多全自動(dòng)分析儀為追求速度，在設(shè)計(jì)上采用一些折中方法來測定試劑空白。以日立全系列生化儀為例。該系列分析儀是做不了實(shí)時(shí)試劑空白，因?yàn)樗鼈內(nèi)窍燃尤霕颖竞蠹釉噭瑸榱苏壑?，只好在定?biāo)時(shí)做一個(gè)試劑空白，保存起來，需要扣除試劑空白時(shí)再減這個(gè)預(yù)先保存的值。這種做法，對于比較穩(wěn)定的試劑來講，對結(jié)第4頁/共45頁果影響不大。通俗的講，日立的儀器工作流程中首先是將標(biāo)本加入到比色杯中，然后依次加入R1試劑、R2試劑，所以試劑空白在每個(gè)測定項(xiàng)目曲線中是無法看到的。但是7600從CALIBRATION中是可以看到的，S1ABS就是代表試劑空白吸光度，在CALIBRATION畫面里的下方找到ReactionMonitor（反應(yīng)監(jiān)察），其中STD(1)就是代表試劑空白反應(yīng)曲線.為了減小誤差，日立儀器會連續(xù)做兩次測定，所以你看到FIRST和SECOND兩條，計(jì)算時(shí)是取他們的平均值。做試劑空白目的之一就是觀察試劑是否穩(wěn)定，積極采取措施糾正。對于日立的這種試劑空白測定很多儀器都采用這種方法，也叫做試劑空白校準(zhǔn)。總的說來，自動(dòng)生化儀上的試劑空白一般表現(xiàn)為零點(diǎn)吸光度，該吸光度是通過校準(zhǔn)確立的。第5頁/共45頁2、樣本空白：由于溶血、脂血、黃疸等情況，會導(dǎo)致樣本本身的吸光度對測試結(jié)果造成影響。所以對樣本本身吸光度的測量，即樣本空白，可以去除這方面的影響。測量方法是按照正常測試的試劑和樣本量，把試劑換成蒸餾水或生理鹽水來進(jìn)行測量。自動(dòng)生化儀上，很難界定樣本空白。與消除樣本空白有關(guān)的大約有如下幾點(diǎn):a).在雙試劑測定時(shí)，加入試劑1和樣品后的吸光度可一定程度上扣除樣本空白，所以有單試劑不能扣除樣本空白的說法。b).現(xiàn)在優(yōu)質(zhì)的試劑的抗干擾能力都比較強(qiáng)，比如有些雙試劑，R1加入后先和樣本孵育一段時(shí)間，將血紅蛋白、脂肪第6頁/共45頁膽紅素等反應(yīng)掉，再加入R2開始測定反應(yīng)。在一定范圍內(nèi)都可以消除樣本空白。c).現(xiàn)代全自動(dòng)生化儀大多采用雙波長測定.雙波長測定的原則是根據(jù)干擾組分和待測物質(zhì)吸收光譜的峰形特征，選擇兩個(gè)波長和，使干擾組分在這兩個(gè)波長處的吸光系數(shù)相等，而使待測物質(zhì)在兩波長處的吸光系數(shù)有顯著差別。以兩波長分別測定分析溶液的吸光度，以兩個(gè)吸光度值之差(△A)計(jì)算。這也可以扣除一部分樣本空白.d).有些儀器,例如日立系列,有專門的“血清信息”功能的設(shè)置。做法都是單獨(dú)占用一個(gè)空白通道來計(jì)算，這也叫做樣品空白校準(zhǔn)。3、水空白：比色杯在加入水以后的吸光度。水空白的意義主要是對光路系統(tǒng)進(jìn)行檢查和校正，如光源，比色杯等，同時(shí)在計(jì)算中起到消除“杯差”的作用。日立7060中的CellBlank（杯空白）測定的就是水空白。第7頁/共45頁全面質(zhì)量控制的內(nèi)容全面質(zhì)量控制的內(nèi)容主要包括分析前、分析中、分析后這三個(gè)主要過程的質(zhì)控。只有認(rèn)真的檢測和控制這三個(gè)過程中各個(gè)環(huán)節(jié)可能出現(xiàn)的誤差，才能保證最后檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，才能達(dá)到我們的質(zhì)量要求。第8頁/共45頁（一）分析前質(zhì)控人員培訓(xùn)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置（水、電、相關(guān)設(shè)備、用具等）實(shí)驗(yàn)儀器的質(zhì)量保證

(儀器的精度、波長的準(zhǔn)確度)檢測方法的選擇和評價(jià)（重復(fù)實(shí)驗(yàn)、回收實(shí)驗(yàn)、干擾實(shí)驗(yàn)、方法比較實(shí)驗(yàn)）試劑和標(biāo)準(zhǔn)品的選擇和評價(jià)

（線性范圍測定、反應(yīng)曲線的觀察、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)）標(biāo)本準(zhǔn)備（血清、血漿、胸腹水等)第9頁/共45頁（二）分析中質(zhì)控建立項(xiàng)目操作程序標(biāo)準(zhǔn)化的操作規(guī)程（SOP文件）。室內(nèi)質(zhì)控和結(jié)果分析

對各個(gè)項(xiàng)目進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)量控制，并對質(zhì)控結(jié)果進(jìn)行分析與處理。第10頁/共45頁（三）分析后質(zhì)控審核實(shí)驗(yàn)結(jié)果室內(nèi)質(zhì)控的數(shù)據(jù)管理參加室間質(zhì)量評價(jià)建立投訴調(diào)查與反饋機(jī)制第11頁/共45頁二、臨床生化檢驗(yàn)室內(nèi)質(zhì)量控制（一）、概念與意義室內(nèi)質(zhì)量控制：指各實(shí)驗(yàn)室為了監(jiān)測和評價(jià)本實(shí)驗(yàn)室工作質(zhì)量，以決定常規(guī)檢驗(yàn)報(bào)告能否發(fā)出，而采取的一系列檢查，控制手段，包括實(shí)驗(yàn)室工作的全過程。意義：是檢測常規(guī)工作中的精密度，并觀察準(zhǔn)確度的改變，提高本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)工作中天內(nèi)與天間標(biāo)本檢測的一致性。第12頁/共45頁要進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)量控制就必須要有指示物對各項(xiàng)目的質(zhì)量進(jìn)行指示和判斷，來說明質(zhì)量好壞的情況，指示物就是我們需要的控制物（也稱質(zhì)控物）。

控制物定義（也稱質(zhì)控物）：含有被檢測的化學(xué)成份，用于監(jiān)測實(shí)驗(yàn)室的精密度和準(zhǔn)確度的一種指示血清（溶液）稱之為控制物。

標(biāo)準(zhǔn)品定義（參考物）：是指它的一種或幾種物理或化學(xué)性質(zhì)已經(jīng)充分被確定，被用于校準(zhǔn)儀器或證實(shí)一種測定方法的物質(zhì)。第13頁/共45頁2質(zhì)控品應(yīng)具備的特性人血清基質(zhì)，因它的基質(zhì)效應(yīng)小.無傳染性.添加劑和調(diào)制物的數(shù)量盡可能少.瓶間變異小，（1）酶類項(xiàng)目瓶CV應(yīng)小于2％，其它分析物CV％應(yīng)小于l％（2）某些不穩(wěn)定成分(如膽紅素、ALP等)在復(fù)溶后前4小時(shí)的變異應(yīng)小于2％.（3）凍干品其復(fù)溶后，2～8℃環(huán)境中穩(wěn)定不少于24h，－20℃環(huán)境中穩(wěn)定不少于20天，到實(shí)驗(yàn)室后的有效期應(yīng)在1年以上.第14頁/共45頁室內(nèi)質(zhì)控血清濃度水平要求１、三級以上醫(yī)院的臨床實(shí)驗(yàn)室，定量測定每批(不超過24小時(shí))至少使用兩個(gè)濃度水平的質(zhì)控血清。２、二級、一級醫(yī)院臨床實(shí)驗(yàn)室，至少使用一個(gè)濃度水平(醫(yī)學(xué)決定水平)的質(zhì)控血清。３、醫(yī)學(xué)決定水平：是指某項(xiàng)待測物的含量，圍繞該濃度的升高或降低，對確定疾病的診斷或治療起幫助甚至關(guān)鍵的作用。第15頁/共45頁統(tǒng)計(jì)學(xué)的基本概念１、精密度：測定值與均值之間的差值情況稱為精密度，差值越大精密度越差，反之越好。

２、準(zhǔn)確度：測定值與真實(shí)值之間的差值情況稱為準(zhǔn)確度，越接近真值準(zhǔn)確度也好，反之就越差。第16頁/共45頁第17頁/共45頁室內(nèi)質(zhì)量控制的主要方法常規(guī)質(zhì)控圖（ｘ±S）法Westgard多規(guī)測質(zhì)控法6西格瑪質(zhì)控圖法4.日常標(biāo)本測定結(jié)果均值圖法

第18頁/共45頁常規(guī)質(zhì)控圖（ｘ±S）法這種方法操作簡單，直觀，易懂，它具有成熟的理論和實(shí)際經(jīng)驗(yàn)，它只需要單一濃度的質(zhì)控血清就可實(shí)現(xiàn)對臨床進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)量控制，是目前國內(nèi)外采用最廣泛的一種常規(guī)室內(nèi)質(zhì)量控制的方法。也稱為均值-標(biāo)準(zhǔn)差質(zhì)控圖法，也稱levey-Jenning質(zhì)控圖法。第19頁/共45頁①在縱坐標(biāo)上標(biāo)出X、X±2SD、X±3SD的標(biāo)志，橫縱標(biāo)上標(biāo)出日期或次數(shù)。②用紅筆劃出X±2SD作為警告線；用藍(lán)筆劃出X±3SD作為出控線。這樣稱為一張空OCV或RCV圖。③質(zhì)控圖上所包括的內(nèi)容第20頁/共45頁常規(guī)靶值、控制限的確定：一個(gè)月結(jié)束后,將該月的在控結(jié)果與前20個(gè)質(zhì)控測定結(jié)果匯集在一起，計(jì)算累積X、S、CV,再作為第二個(gè)月的IQC的暫定靶值和控制限，觀測第二個(gè)月的IQC。以此重復(fù)３～５個(gè)月建立常規(guī)的靶值、控制限。在計(jì)算累積值的時(shí)候需去掉超過±3SD的數(shù)據(jù)第21頁/共45頁室內(nèi)質(zhì)控的結(jié)果分析（1）測定值的分布規(guī)律①95%的測定結(jié)果應(yīng)落在X±2SD范圍內(nèi)。②不能有連續(xù)5次結(jié)果逐漸上升或下降。③不能有連續(xù)5次結(jié)果在均值的同一側(cè)。④不能有連續(xù)2次結(jié)果在X±2SD以外。⑤不能有數(shù)據(jù)落在X±3SD外。

如違反上述規(guī)律時(shí)，稱為失控。第22頁/共45頁（２）質(zhì)控圖的幾種失控表現(xiàn)

①曲線漂移：是由于系統(tǒng)誤差造成，準(zhǔn)確度發(fā)生了一次性的向上或向下的改變，這種往往是由于一個(gè)突然出現(xiàn)的新的情況引起。如更換質(zhì)控血清、試劑及操作人員。第23頁/共45頁②趨勢性變化：質(zhì)控圖趨勢性向下或向上變化。表明檢測的準(zhǔn)確度發(fā)生逐漸的變化，這種變化多發(fā)生是由于一個(gè)逐漸改變的因素造成的。如試劑的揮發(fā)、吸水、沉淀等。第24頁/共45頁③精密度變化：儀器、試劑或方法學(xué)不穩(wěn)定第25頁/共45頁8、失控后處理①迅速回顧，檢查整個(gè)操作過程。是否有發(fā)生錯(cuò)誤的環(huán)節(jié)，包括試劑、方法、波長，以及程序等出現(xiàn)差錯(cuò)。②如操作步驟均無問題，可重復(fù)試驗(yàn)一次，如有改進(jìn)，說明誤差很可能操作錯(cuò)誤所致，標(biāo)本量，試劑量的錯(cuò)誤，或波長選擇錯(cuò)誤所致。③如仍不能更正，可取一份新鮮的控制血清重作。④仍不能解決問題，取一份定值血清重做。⑤仍不能解決，應(yīng)仔細(xì)檢測儀器。⑥仍未得到糾正，試劑、質(zhì)控血清重新配制和溶解，儀器保養(yǎng)檢修，全部重新查找原因直到問題解決。第26頁/共45頁1、方法：要求在常規(guī)條件，同時(shí)測定2份不同濃度的定值質(zhì)控血清，所含測定物濃度最好分別為醫(yī)學(xué)決定水平的上限或下限。Westgard多規(guī)則法第27頁/共45頁2

常用的質(zhì)控規(guī)則質(zhì)控規(guī)則以符號AL表示：(1)A是指超過質(zhì)控限(L)的質(zhì)控測定值的個(gè)數(shù)(2)L是質(zhì)控界限。(3)

1

2s質(zhì)控規(guī)則,A=1,L=2s當(dāng)質(zhì)控測定值超過了規(guī)定某規(guī)則要求時(shí)，應(yīng)判該批分析違背此規(guī)則。第28頁/共45頁12s：有1個(gè)質(zhì)控測定值超過X±2s，該規(guī)則稱為“警告規(guī)則”。第29頁/共45頁13s規(guī)則：1個(gè)質(zhì)控測定值超過X±3s質(zhì)控限。此規(guī)則多由隨機(jī)誤差造成第30頁/共45頁22s規(guī)則:2個(gè)連續(xù)的質(zhì)控測定值同時(shí)超過X＋2s或X－2s質(zhì)控限。此規(guī)則主要由系統(tǒng)誤差造成第31頁/共45頁R4s規(guī)則：在同一批內(nèi)進(jìn)行兩種不同濃度質(zhì)控品監(jiān)測時(shí),高濃度測定值與低濃度測定值之間的差值超過4s。此規(guī)則多由隨機(jī)誤差造成。第32頁/共45頁41s規(guī)則：4個(gè)連續(xù)的質(zhì)控測定值同時(shí)超過X＋1s或X－1s。此規(guī)則主要由系統(tǒng)誤差造成。第33頁/共45頁10x規(guī)則：10個(gè)連續(xù)的質(zhì)控測定值同時(shí)落在均值（X）的同一側(cè)。此規(guī)則主要由系統(tǒng)誤差造成。第34頁/共45頁Westgard多規(guī)則的主要特點(diǎn)是：①是在Levey-Jennings方法基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，因此,它很容易與常用的Levey-Jennings質(zhì)控圖進(jìn)行比較并涵括后者的結(jié)果；②通過單值質(zhì)控圖進(jìn)行簡單的數(shù)據(jù)分析和顯示③具有低的假失控或假報(bào)警概率；④當(dāng)失控時(shí)，能確定產(chǎn)生失控的分析誤差的類型，由此可幫助確定失控的原因以尋找解決問題的辦法。第35頁/共45頁最初的Westgard多規(guī)則通常有六個(gè)質(zhì)控規(guī)則，即12s、13s、22s、R4s、41s、10x。其中12s規(guī)則是是一種警告規(guī)則也是Westgard法的啟動(dòng)規(guī)則，它有助于對質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)的快速判斷。為了表達(dá)的方便，通常以“／”符號將各項(xiàng)質(zhì)控規(guī)則聯(lián)接起來，如13s/22s/R4s／41s／10x。第36頁/共45頁在實(shí)踐中13s或R4s規(guī)則常檢出隨機(jī)誤差，而22s

、41s

、10x質(zhì)控規(guī)則檢出系統(tǒng)誤差。第37頁/共45頁第38頁/共45頁IQC中需要注意存在的問題注意的問題：（1）質(zhì)控血清必須完全溶解和融化后才能使用，同時(shí)，（2）必須有準(zhǔn)確的加樣器，而且水的質(zhì)量一定要得到保證。（3）質(zhì)控血清必須與常規(guī)標(biāo)本同等對待，不得特殊處理，只有這樣才能真正反映常規(guī)工作的質(zhì)量。第39頁/共45頁（4）質(zhì)控血清測得值應(yīng)及時(shí)在質(zhì)控圖上。確認(rèn)沒有失控后，再填發(fā)當(dāng)天的檢驗(yàn)報(bào)告。（5）通過質(zhì)控圖尋找出現(xiàn)誤差規(guī)律。在失控時(shí)查找原因，均需要各方面詳細(xì)記錄，才能進(jìn)行正常分析，因此必須養(yǎng)成良好的實(shí)驗(yàn)記錄習(xí)慣。（6）單純依靠質(zhì)量控制制圖監(jiān)測工作質(zhì)量是不夠的。特別是對于過失誤差，是無法用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法去發(fā)現(xiàn)的。第40頁/共45頁存在的問題（１）質(zhì)控標(biāo)本對質(zhì)控過程的監(jiān)控不夠，一般只在早晨調(diào)機(jī)時(shí)做一次質(zhì)控標(biāo)本。（２）將質(zhì)控血清反復(fù)測定多次，取其結(jié)果均值作為當(dāng)天質(zhì)控血清的檢測值。因在取均值過程中抵消了大部分隨機(jī)誤差，使結(jié)果反映出的精密度比實(shí)際情況好得多，起不到控制常