紙層析法分離氨基酸

紙層析法分別氨基酸姓名：敖禮賢學(xué)號(hào)：5602212022班級(jí)：生物工程121一、前百1、爭(zhēng)論意義與前景層析法是采用混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差異（如吸附力、分子外形及大小、分子親和力、安排系數(shù)等），使各組分在兩相（一相為固定的，稱為固定相；另一相流過固定相，稱為流淌相）中的分布程度不同，從而使各組分以不同的速度移動(dòng)而達(dá)到分別的目的。[1]紙層析法（paperchromatography）是生物化學(xué)上分別、鑒定氨基酸混合物的常用技術(shù)，可用于蛋白質(zhì)的氨基酸成分的定性鑒定和定量測(cè)定；也是定性或定量測(cè)定多肽、核酸堿基、糖、有機(jī)酸、維生素、抗菌素等物質(zhì)的一種分別分析工具。紙層析法是用濾紙作為惰性支持物的安排層析法，其中濾紙纖維素上吸附的水是固定相，展層用的有機(jī)溶溶劑是流淌相?！?】安排層析法安排色譜系色譜法之一種，采用固定相與流淌相之間對(duì)待分別組分溶解度的差異來實(shí)現(xiàn)分別。安排色譜的固定相一般為液相的溶劑，依靠圖布、鍵合、吸附等手段分布于色譜柱或者擔(dān)體表面。安排色譜過程本質(zhì)上是組分分子在固定相和流淌相之間不斷達(dá)到溶解平衡的過程?！?】2、試驗(yàn)?zāi)康模?）把握安排層析的原理，學(xué)習(xí)氨基酸紙層析法的操作技術(shù)（包括點(diǎn)樣、平衡、展層、顯色、鑒定及定量）（2）學(xué)習(xí)未知樣品的氨基酸成分（水解、層析及鑒定）分析的方法。3、試驗(yàn)原理層析法也稱色譜法，是1906年俄國(guó)植物學(xué)家MichaelTswett發(fā)覺并命名的。他將植物葉子的色素通過裝填有吸附劑的柱子，各種色素以不同的速率流淌后形成不同的色帶而被分開,由此得名為“色譜法”（Chromatography）。后來無色物質(zhì)也可采用吸附柱層析分別。1944年消失紙層析。以后層析法不斷進(jìn)展，相繼消失氣相層析、高壓液相層析、薄層層析、親和層析、凝膠層析等。層析法是采用混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差異（如吸附力、分子外形及大小、分子親和力、安排系數(shù)等），使各組分在兩相（一相為固定的，稱為固定相；另一相流過固定相，稱為流淌相）中的分布程度不同，從而使各組分以不同的速度移動(dòng)而達(dá)到分別的目的。按層析過程的機(jī)理分類：吸附層析：采用吸附劑表面對(duì)不同組分吸附性能的差異，達(dá)到分別鑒定的目的。安排層析：采用不同組分在流淌相和固定相之間的安排系數(shù)不同，使之分別。離子交換層析：采用不同組分對(duì)離子交換劑親和力的不同。凝膠層析：采用某些凝膠對(duì)于不同分子大小的組分阻滯作用的不同紙層析法是用濾紙作為惰性支持物的安排層析法，它是采用不同的氨基酸在展層溶劑中的安排系數(shù)不同而得以分別的一種方法。惰性支持物是新華一號(hào)濾紙，其上含有許多的羥基，與水有較強(qiáng)的親和力因此把它看成是含有靜止水相的惰性支持物。水相因此稱為靜止相（固定相），有機(jī)溶劑稱為流淌相。展層溶劑由兩個(gè)互不相溶的有機(jī)溶劑和水組成，它們相互混合時(shí)便分成兩相：一相是以水飽和了的有機(jī)相，另一相是以有機(jī)溶劑飽和了的水相。安排系數(shù)（a）=溶質(zhì)在固定相的濃度（CS）/溶質(zhì)在流淌相的濃度（CL）當(dāng)用濾紙進(jìn)行安排層析時(shí)，流淌相流經(jīng)支持物時(shí)與固定相之間連續(xù)抽提，使氨基酸在兩相之間不斷安排而得以分別。安排層析的原理可用一個(gè)模式解釋（英國(guó)Martin等）：把濾紙看成是一個(gè)層析柱，可以分成若干層板，設(shè)層板的物質(zhì)為A、B；且A和B的安排系數(shù)（a）分別為1和1/3；又設(shè)固定相為S,流淌相為L(zhǎng),兩相相互接觸但不相混溶。當(dāng)?shù)谝粚恿魈氏嘀屑尤肟隙康腁、B兩項(xiàng)物質(zhì)后，溶質(zhì)依據(jù)各自的安排系數(shù)在第一層的兩相中安排，流淌相連續(xù)在流淌，此時(shí)第一層固定相與新流到的流淌相之間以及原來第一層流淌相與其次層固定相之間進(jìn)行其次次安排，以此類推三次安排即可看出A與B最濃部分以分開，A在其次層最濃，B在第三層最濃，假如連續(xù)抽提下去，經(jīng)過若干此后，A、兩物質(zhì)便可完全分開。明顯，安排系數(shù)越大的,則越易分開。物質(zhì)被分別后在紙層析圖譜上的位置是用Rf值（比移值）來表示的：1^=原點(diǎn)到層析點(diǎn)中心的距離/原點(diǎn)到溶劑前沿的距離在肯定的條件下某種物質(zhì)的Rf值是常數(shù)。Rf值的大小與物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、溶劑系統(tǒng)；層析濾紙的質(zhì)量和層析溫度等因素有關(guān)。本試驗(yàn)采用紙層析法分別氨基酸。無色物質(zhì)的層析圖譜可用光譜法或顯色法鑒定。本試驗(yàn)采納荀三酮為顯色劑。荀三酮顯色反應(yīng)受溫度、ph、時(shí)間影響較大。假如要使結(jié)果重復(fù)，必需嚴(yán)格掌握上述條件。二、試驗(yàn)材料與方法1、試驗(yàn)試劑.氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液（lmg/ml）四種氨基酸是甘氨酸、亮氨酸、肺氨酸、混合氨酸分別配置成肯定濃度的溶液.80%甲酸.0.5%前三酮溶液.氨基酸混合液.正丁醇2、試驗(yàn)器材.新華濾紙.培育皿.電熱鼓風(fēng)干燥箱.點(diǎn)樣管及點(diǎn)樣架.針、線、尺.燒杯.鐘罩3、試驗(yàn)操作（一）標(biāo)準(zhǔn)氨基酸紙上層析1、單向上行層析（1）氨基酸Rf值的測(cè)定A、濾紙：選用國(guó)產(chǎn)新華1號(hào)濾紙，28cmX28cm,在距紙邊2cm處，用鉛筆輕輕劃一條線，于線上每隔3cm處畫一小圓圈作為點(diǎn)樣處，圈直徑不超過O.ScmoB、點(diǎn)樣：點(diǎn)樣要合適，樣品點(diǎn)的太濃，斑點(diǎn)易集中或拉長(zhǎng)，以致分別不清，氨基酸的點(diǎn)

樣量以每種氨基酸含5-20ug為宜，將預(yù)備好的濾紙懸掛在點(diǎn)樣架上，濾紙垂直桌面，用點(diǎn)樣管吸取氨基酸樣品10ug,在濾紙垂直方向輕輕碰觸點(diǎn)樣中心，這時(shí)樣品就自動(dòng)流出。點(diǎn)樣的集中直徑掌握在0.5cm之內(nèi)，點(diǎn)樣過程中必需在第一滴樣品干后再點(diǎn)其次滴。C、將點(diǎn)好的樣品的濾紙倆側(cè)比齊，用線縫好，揉成筒狀。留意縫線處的紙的倆邊不要接觸，避開由于毛細(xì)管現(xiàn)象使溶劑沿倆邊移動(dòng)特殊快而造成溶劑前沿不齊，影響Rf值。D、酸溶劑系統(tǒng)：正丁醇：80%甲酸：水=15:3:2,前三酮2mL溫度25*C,時(shí)間訃。留意：使用的溶劑系統(tǒng)需新奇配制，并要搖勻。展層溶劑每張約需25ml。E、顯色：待展層基本結(jié)束后，置65.C鼓風(fēng)箱中10—20min,鼓風(fēng)保溫，濾紙上即顯出紫紅色\黃色斑點(diǎn)。F、Rf值的計(jì)算：用尺測(cè)量顯色斑點(diǎn)的中點(diǎn)與原點(diǎn)之間的距離和原點(diǎn)到溶劑前沿的距離，求出此值，即得氨基酸的Rf值，計(jì)算出4種氨基酸在酸系統(tǒng)中的Rf值。三、試驗(yàn)數(shù)據(jù)與分析甘氨酸甘氨酸甘氨酸亮氨酸脯氨霰混合氨酸原點(diǎn)到層析點(diǎn)甘氨酸亮氨酸脯氨霰混合氨酸原點(diǎn)到層析點(diǎn)14中點(diǎn)的距離(mm)原點(diǎn)到層析點(diǎn)14中點(diǎn)的距離原點(diǎn)到層析點(diǎn)14中點(diǎn)的距離(mm)6036原點(diǎn)到溶劑前70原點(diǎn)到溶劑前70原點(diǎn)到溶劑前707070沿的距離(mm)RfRfRf0.2000.8570.514Rf0.2000.8570.514四、爭(zhēng)論1、留意事項(xiàng).點(diǎn)樣時(shí)要避開手指或唾液等污染濾紙有效面(即展層時(shí)樣品可能達(dá)到的部分)。.點(diǎn)樣斑點(diǎn)不能太大，防止層析后氨基酸斑點(diǎn)過度集中和重疊，且點(diǎn)樣后吹風(fēng)溫度不宜過高，以免樣品變性(斑點(diǎn)發(fā)黃)。.展層開頭時(shí)切勿使樣品點(diǎn)浸入溶劑中。(4),展層劑要臨用前配制，以免發(fā)生酯化，影響層析結(jié)果。2、思索題(1)、紙層析法分別氨基酸為什么在展層時(shí)使用一種溶劑系統(tǒng)，有時(shí)使用倆種溶劑系統(tǒng)？這是依據(jù)Nernst在1891年提出的安排定律：一種溶質(zhì)在兩種給定的互不相溶的溶劑中安排時(shí)，在肯定溫度下達(dá)到平衡后，溶質(zhì)在兩相中的濃度比為一常數(shù)，即安排系數(shù)(Kd)。Kd=Ca/CbCa和Cb是互不相溶的兩相，即A相和B相的濃度。這里的兩相可以使固相、液相和氣相。意思就是溶質(zhì)在A和B兩種溶劑組成的混合溶劑里安排時(shí)，安排比是恒定的。(2)、酸性溶劑系統(tǒng)對(duì)氨基酸極性基團(tuán)的解離有何影響？酸性溶液中，