生物技術(shù)制藥第二章基因工程制藥

生物技術(shù)制藥第二章基因工程制藥第1頁，共49頁，2023年，2月20日，星期一用途：主要用于癌癥、人類免疫缺陷病毒性疾病、心血管疾病、糖尿病、貧血和許多遺傳疾病的治療。獲取方式：生化提取基因工程表達(dá)

成本高產(chǎn)量低質(zhì)量難以保證成本低產(chǎn)量高活性強(qiáng)性質(zhì)優(yōu)實(shí)例：人生長(zhǎng)激素（侏儒癥）50

具新鮮尸體腦下垂體中提取采用基因工程從1～2

升細(xì)菌培養(yǎng)液中提取獲得=第2頁，共49頁，2023年，2月20日，星期一1982年世界上第一個(gè)基因工程藥物―重組人胰島素獲準(zhǔn)生產(chǎn)銷售，至今已有100多個(gè)生物技術(shù)藥物上市;促紅細(xì)胞生成素（EPO）以全球銷售額38億美元的業(yè)績(jī)，居全球最暢銷10種藥物的第6名；1989年我國(guó)第一個(gè)擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的基因工程藥物--重組人干擾素（IFN–α1b）上市以來，目前，世界上銷售額排前10位的生物技術(shù)藥物我國(guó)已能生產(chǎn)8種。國(guó)際生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展動(dòng)態(tài)第3頁，共49頁，2023年，2月20日，星期一第一節(jié)概述生物技術(shù)的核心就是基因工程，20世紀(jì)70年代基因工程誕生,最先應(yīng)用在醫(yī)藥科學(xué)領(lǐng)域。傳統(tǒng)生物藥物由于來源及制備上的困難、價(jià)格等因素的影響，此外在制備過程可能受到的病毒、衣原體、支原體等的感染等問題（如：生長(zhǎng)激素抑制素1mg傳統(tǒng)法：10萬只羊的下丘腦，現(xiàn)：10L大腸桿菌培養(yǎng)液，0.3美元/mg；尿激酶從男性尿中提??；胎盤丙種球蛋白從胎盤中提取。第4頁，共49頁，2023年，2月20日，星期一應(yīng)用基因工程技術(shù)可十分方便且有效地解決傳統(tǒng)生物制藥所遇到的問題如今，癌癥、病毒性疾病、心血管疾病以及內(nèi)分泌等方面的預(yù)防、治療和診斷藥物已可通過基因工程技術(shù)獲得。第5頁，共49頁，2023年，2月20日，星期一利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)藥品的優(yōu)點(diǎn)：（1）可以大量生產(chǎn)過去難以獲得的生理活性蛋白和多肽；（2）可以提供足夠數(shù)量的生理活性物質(zhì)；（3）利用基因工程技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)、挖掘更多的內(nèi)源性生理活性物質(zhì)；第6頁，共49頁，2023年，2月20日，星期一（4）基因工程和蛋白質(zhì)工程進(jìn)行改造和去除內(nèi)源性生理活性物質(zhì)的不足之處。（5）利用基因工程技術(shù)可獲得新型化合物，擴(kuò)大藥物篩選來源。第7頁，共49頁，2023年，2月20日，星期一第二節(jié)基因工程藥物生產(chǎn)的過程

基因工程技術(shù)是將所要重組對(duì)象的目的基因插入載體、拼接，轉(zhuǎn)入新的宿主細(xì)胞，構(gòu)建成工程菌(或細(xì)胞），實(shí)現(xiàn)遺傳物質(zhì)的重新組合，并使目的基因在工程菌(或細(xì)胞）內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)的技術(shù)。第8頁，共49頁，2023年，2月20日，星期一基因工程藥物生產(chǎn)的上游和下游上游階段：目的基因分離、工程菌（或細(xì)胞）構(gòu)建。上游階段的工作主要在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成；下游階段：主要指的是從工程菌（或細(xì)胞）的大規(guī)模培養(yǎng)一直到產(chǎn)品的分離純化、質(zhì)量控制第9頁，共49頁，2023年，2月20日，星期一獲得目的基因組建重組質(zhì)粒培養(yǎng)工程菌構(gòu)建基因工程菌或細(xì)胞產(chǎn)物分離純化除菌過濾半成品檢定包裝成品檢定基因工程藥物制備的一般過程第10頁，共49頁，2023年，2月20日，星期一基因工程基本過程切接轉(zhuǎn)增檢第11頁，共49頁，2023年，2月20日，星期一工程菌（或細(xì)胞）構(gòu)建中重要的工具工具：酶限制性內(nèi)切酶連接酶逆轉(zhuǎn)錄酶Klenow酶大片段（DNA聚合酶I）核酸酶S1第12頁，共49頁，2023年，2月20日，星期一第三節(jié)目的基因的獲得

克隆真核基因常用方法：逆轉(zhuǎn)錄法和化學(xué)合成法。（不能直接分離？）一、逆轉(zhuǎn)錄法逆轉(zhuǎn)錄法就是先分離純化目的基因的mRNA，再反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進(jìn)行cDNA的克隆表達(dá)。cDNA與模板mRNA序列嚴(yán)格互補(bǔ)，而不含內(nèi)含子。第13頁，共49頁，2023年，2月20日，星期一逆轉(zhuǎn)錄法的步驟

1、mRNA的純化

2、cDNA第一鏈的合成

3、cDNA第二鏈的合成

4、cDNA克隆

5、將重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞

6、cDNA文庫的鑒定

7、目的cDNA克隆的分離和鑒定第14頁，共49頁，2023年，2月20日，星期一cDNA克隆示意圖mRNA逆轉(zhuǎn)錄酶ss-DNADNA聚合酶IKlenow片段ds-cDNAds-cDNA核酸酶S1第15頁，共49頁，2023年，2月20日，星期一不需合成第二鏈mRNA逆轉(zhuǎn)錄酶ss-DNAPCR特異引物目的cDNA鏈1985，PCR發(fā)明以后，RT-PCR得到了廣泛的應(yīng)用。二、逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)法（RT-PCR）第16頁，共49頁，2023年，2月20日，星期一

三、化學(xué)合成法較小的蛋白質(zhì)或多肽的編碼基因可以用化學(xué)合成法合成。必須知道目的基因的核苷酸順序或目的蛋白質(zhì)的氨基酸順序。人工化學(xué)合成的限制：一不能合成太長(zhǎng)的基因，50～60bp；二是人工合成時(shí)，遺傳密碼的簡(jiǎn)并性可導(dǎo)致中性突變；三是費(fèi)用較高。第17頁，共49頁，2023年，2月20日，星期一四、篩選基因的新方法五、對(duì)已發(fā)現(xiàn)基因進(jìn)行改造第18頁，共49頁，2023年，2月20日，星期一第四節(jié)基因表達(dá)

基因表達(dá)：是指結(jié)構(gòu)基因在生物體中的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及所有加工過程。

基因高效表達(dá)：將外源基因片段拼接到另一個(gè)基因表達(dá)體系中，使既獲得原生物活性又可高產(chǎn)的表達(dá)產(chǎn)物。

最佳的基因表達(dá)體系：生物活性高、表達(dá)產(chǎn)量高、表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定、表達(dá)產(chǎn)物容易分離純化。第19頁，共49頁，2023年，2月20日，星期一一、宿主細(xì)胞的選擇好培養(yǎng)，快速長(zhǎng)，少危害，易重組，高量率，簡(jiǎn)提純。第20頁，共49頁，2023年，2月20日，星期一

宿主細(xì)胞常用兩大類：

原核細(xì)胞：常用有大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、鏈霉菌等；

真核細(xì)胞：常用有酵母、絲狀真菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等。第21頁，共49頁，2023年，2月20日，星期一原核細(xì)胞

⑴大腸桿菌：基因工程研究中采用最多的原核表達(dá)體系。

優(yōu)點(diǎn)：生長(zhǎng)快速、代謝簡(jiǎn)單、遺傳體系清楚、容易操作、細(xì)胞破碎容易。

缺點(diǎn)：①不存在導(dǎo)向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的信號(hào)序列，分泌能力不足，產(chǎn)品多為胞內(nèi)產(chǎn)物，提取困難；②蛋白表達(dá)后不能修飾加工（糖基化等）；③產(chǎn)物蛋白質(zhì)N端多余一個(gè)蛋氨酸殘基，能引起免疫反應(yīng)；④內(nèi)毒素存留。第22頁，共49頁，2023年，2月20日，星期一⑵枯草芽胞桿菌：分泌能力強(qiáng)，蛋白質(zhì)不形成包含體。產(chǎn)物蛋白質(zhì)不能糖基化。有很強(qiáng)的胞外蛋白酶對(duì)產(chǎn)物降解。⑶鏈霉菌：作為外源性基因表達(dá)受到重視。不致病、使用安全、分泌能力強(qiáng)、表達(dá)產(chǎn)物可糖基化。第23頁，共49頁，2023年，2月20日，星期一真核細(xì)胞

⑴酵母是研究基因表達(dá)最有效的單細(xì)胞真核微生物。其基因組小，世代時(shí)間短，有單倍體雙倍體兩種形式，繁殖迅速，無毒性。能外分泌，產(chǎn)物可糖基化。已有不少真核基因成功表達(dá)。第24頁，共49頁，2023年，2月20日，星期一⑵絲狀真菌

優(yōu)點(diǎn)：分泌能力強(qiáng)，能正確進(jìn)行翻譯后加工（肽剪切、糖基化）有成熟的發(fā)酵和后處理工藝。

⑶哺乳動(dòng)物細(xì)胞

優(yōu)點(diǎn)：表達(dá)產(chǎn)物可由重組轉(zhuǎn)化細(xì)胞分泌到培養(yǎng)液中，純化容易。產(chǎn)物是糖基化的接近天然物。

缺點(diǎn)：生長(zhǎng)慢，生產(chǎn)率低，培養(yǎng)條件苛刻，費(fèi)用高，培養(yǎng)液濃度稀。第25頁，共49頁，2023年，2月20日，星期一二、大腸桿菌體系中的基因表達(dá)（一）表達(dá)載體表達(dá)載體必須具備的條件（1）載體能獨(dú)立地進(jìn)行復(fù)制(復(fù)制起點(diǎn)，ori)（2）應(yīng)具有靈活的克隆位點(diǎn)和方便的篩選標(biāo)記（3）應(yīng)具有很強(qiáng)的啟動(dòng)子，能為大腸桿菌的RNA聚合酶所識(shí)別。第26頁，共49頁，2023年，2月20日，星期一（4）應(yīng)具有阻遏子，使啟動(dòng)子受到控制，只有當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)才進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。（5）應(yīng)具有很強(qiáng)的終止子，以便使RNA聚合酶集中力量轉(zhuǎn)錄克隆的外源基因.（6）所產(chǎn)生的mRNA必須具有翻譯的起始信號(hào)，即起始密碼AUG和SD序列,以便轉(zhuǎn)錄后能順利翻譯。第27頁，共49頁，2023年，2月20日，星期一常用表達(dá)載體pBV220系統(tǒng)啟動(dòng)子多克隆位點(diǎn)終止子阻遏子P23復(fù)制起始位點(diǎn)

它已成功地表達(dá)了人白細(xì)胞介素2，γ干擾素和腫瘤壞死因子等外源基因。

氨芐青霉素抗性基因

限制性內(nèi)切酶

SD序列第28頁，共49頁，2023年，2月20日，星期一pBG-2是由pBV220系統(tǒng)衍生的便于產(chǎn)物純化的融合表達(dá)載體。該質(zhì)粒在PRPL啟動(dòng)子下游插入G蛋白中與IgGFc段結(jié)合的結(jié)構(gòu)域基因片段180個(gè)核苷酸，下游是多克隆位點(diǎn)，引入了剪切融合蛋白的切點(diǎn)，具有與IgG結(jié)合的活性，可用親和層析。簡(jiǎn)化下游工藝。pBG-2第29頁，共49頁，2023年，2月20日，星期一（二）影響目的基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素⑴外源基因的劑量

外源基因拷貝到高拷貝數(shù)的表達(dá)質(zhì)粒上，總體表達(dá)水平提高⑵外源基因的表達(dá)效率與啟動(dòng)子強(qiáng)弱，核糖體結(jié)合位點(diǎn)的有效性，SD序列與起始密碼的間距，密碼子的組成等都影響其表達(dá)效率第30頁，共49頁，2023年，2月20日，星期一⑶表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性⑷細(xì)胞代謝負(fù)荷宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)與重組質(zhì)粒的復(fù)制分開細(xì)胞的生長(zhǎng)和外源基因的表達(dá)分成兩個(gè)階段⑸工程菌的培養(yǎng)條件優(yōu)化工程菌培養(yǎng)條件，提高基因表達(dá)水平第31頁，共49頁，2023年，2月20日，星期一（三）真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)形式

⑴以融合蛋白的形式表達(dá)藥物基因以原核多肽和真核蛋白結(jié)合在一起稱融合蛋白。優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，表達(dá)蛋白在菌體內(nèi)穩(wěn)定，易實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)；缺點(diǎn)：只能作抗原用。第32頁，共49頁，2023年，2月20日，星期一

⑵以非融合蛋白的形式表達(dá)藥物基因非融合蛋白指在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白質(zhì)以真核蛋白的mRNA的AUG為起始，在其氨基端不含細(xì)菌多肽序列。

優(yōu)點(diǎn)：保持原有蛋白活性；

缺點(diǎn)：易被蛋白酶破壞。第33頁，共49頁，2023年，2月20日，星期一⑶分泌型表達(dá)蛋白藥物基因

優(yōu)點(diǎn)：在周質(zhì)中穩(wěn)定，有活性，不含蛋氨酸殘基；

缺點(diǎn)：產(chǎn)量不高，信號(hào)肽不被切割。第34頁，共49頁，2023年，2月20日，星期一三、酵母中的基因表達(dá)（一）表達(dá)載體酵母載體是可以攜帶外源基因在酵母細(xì)胞內(nèi)保存和復(fù)制，并隨酵母分裂傳遞到子代細(xì)胞的DNA或RNA單位。1.載體的復(fù)制序列

①酵母附加體質(zhì)粒（yeastepisomalplasmid，Yep類）②酵母復(fù)制型質(zhì)粒（yeastreplicationplasmid，Ypp類）③酵母著絲粒質(zhì)粒（yeastcentromericplasmid，YCp類）④酵母整合型質(zhì)粒（yeastinteegrativeplasmid，YIp類）第35頁，共49頁，2023年，2月20日，星期一2.克隆載體酵母質(zhì)粒的加工和制備大部分是通過大腸桿菌進(jìn)行的，只有在最后階段才轉(zhuǎn)入酵母中，這就要求酵母載體也同時(shí)具有在大腸桿菌中復(fù)制和增殖的能力。

3.表達(dá)載體

將酵母菌的啟動(dòng)子和終止子等有關(guān)控制序列引入上述載體的適當(dāng)位點(diǎn)后，就構(gòu)成了酵母菌的表達(dá)載體。又分為普通表達(dá)載體和精確表達(dá)載體

第36頁，共49頁，2023年，2月20日，星期一①普通表達(dá)載體，只能方便地引入外源基因并進(jìn)行表達(dá)，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的組成，特別是對(duì)其N末端氨基酸是否增減并無嚴(yán)格要求。②精確表達(dá)載體，要求在啟動(dòng)子或信號(hào)肽編碼序列的適當(dāng)部位有內(nèi)切酶點(diǎn)，以利于接入外源基因，并使他在表達(dá)加工后N末端氨基酸序列與天然產(chǎn)物相同，既無多余的氨基酸，也無缺失的氨基酸。第37頁，共49頁，2023年，2月20日，星期一（二）影響目的基因在酵母菌中表達(dá)的因素⑴外源基因的劑量⑵外源基因的表達(dá)效率

第38頁，共49頁，2023年，2月20日，星期一⑶外源蛋白的糖基化⑷宿主菌株的影響(5)培養(yǎng)條件第39頁，共49頁，2023年，2月20日，星期一四、動(dòng)物細(xì)胞中的基因表達(dá)優(yōu)點(diǎn)：產(chǎn)物類似于天然產(chǎn)物，容易分離純化缺點(diǎn)：動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)慢，培養(yǎng)條件苛刻，費(fèi)用高培養(yǎng)液濃度較小。第40頁，共49頁，2023年，2月20日，星期一主要基因工程表達(dá)體系比較表達(dá)體系產(chǎn)物產(chǎn)生部位培養(yǎng)方式提純產(chǎn)物活性潛在危性大腸桿菌多肽蛋白質(zhì)菌體內(nèi)容易一般對(duì)原核好不大融合蛋白質(zhì)部分高產(chǎn)對(duì)真核差酵母多肽蛋白質(zhì)菌體內(nèi)容易菌體內(nèi)真核的接近不大糖基化蛋白外分泌可高產(chǎn)稍復(fù)雜天然產(chǎn)物哺乳動(dòng)物完整外分泌較難成本高簡(jiǎn)單可達(dá)天然需注意糖基化蛋白可高產(chǎn)產(chǎn)物致癌第41頁，共49頁，2023年，2月20日，星期一1、mRNA的純化真核細(xì)胞mRNA3’-polyA（20～250)采用OligodT-纖維素，以親和層析法將mRNA從細(xì)胞總RNA中分離出來。2、cDNA第一鏈的合成

可用寡聚dT作為引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下，開始cDNA鏈的合成。第42頁，共49頁，2023年，2月20日，星期一3、cDNA第二鏈的合成除去cDNA-mRNA雜交鏈中的mRNA鏈(堿解或RNaseH酶解)然后以cDNA第一鏈為模板合成第二鏈。由于第一鏈cDNA鏈3’-末端往往形成一個(gè)發(fā)夾形結(jié)構(gòu)，所以，可以從這一點(diǎn)開始合成cDNA第二鏈(常用Klenow酶或DNA聚合酶I)切除發(fā)夾結(jié)構(gòu)（核酸酶S1，專一性切除單鏈DNA）第43頁，共49頁，2023年，2月20日，星期一4、cDNA克隆用于cDNA克隆的載體有三類：

細(xì)菌質(zhì)粒（如pBR322、pUC等）插入片段<10kb

噬菌體（如gt10、gt11等）>10kb

動(dòng)植物病毒

根據(jù)重組后插入的cDNA能否經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯合成蛋白質(zhì)非表達(dá)型載體（pBR322及gt10）表達(dá)型載體（pUC及gt11）有利于目的基因的篩選第44頁，共49頁，2023年，2月20日，星期一5、將重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞1、轉(zhuǎn)化：指質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)入細(xì)菌的過程。

2、轉(zhuǎn)染：指病毒或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程。

脂質(zhì)體介導(dǎo)：原生質(zhì)體融合：電穿孔：顯微注射：基因槍：病毒介導(dǎo)：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染：第45頁，共49頁，2023年，2月20日，星期一6、cDNA文庫的鑒定1、表型改變：

抗生素抗性（抗性基因失活和菌落或