時間分辨熒光免疫技術培訓

時間分辨熒光免疫技術培訓第1頁/共32頁回顧標記免疫學發(fā)展放射免疫 （精度：10-12mol/L）酶聯(lián)免疫 （精度：10-9mol/L）膠體金標記 （金標：10-15mol/L）化學發(fā)光 （精度：10-15mol/L）電化學發(fā)光 （精度：10-17mol/L）時間分辨熒光（精度：10-18mol/L）生物芯片第2頁/共32頁時間分辨熒光技術

（Time-ResolvedFluorescence）時間分辨熒光免疫分析（TRFIA）時間分辨免疫熒光分析（TRIFMA）時間分辨熒光核酸探針分析時間分辨熒光細胞活性分析時間分辨熒光探針分析第3頁/共32頁時間分辨熒光技術原理（TRF）用三價稀土離子及其螯合物作為示蹤物，代替熒光物質、同位素、酶和化學發(fā)光物質，標記抗原、抗體、激素、核酸探針等物質；當免疫反應發(fā)生后，根據(jù)稀土離子螯合物的熒光光譜的特點（特異性強、熒光光譜的Stokes位移、壽命長），用時間分辨熒光分析儀，測定免疫反應最后產(chǎn)物的熒光強度。根據(jù)熒光強度和相對熒光強度比值，判斷反應體系中分析物的濃度，達到定量分析的目的。第4頁/共32頁時間分辨熒光免疫原理圖（Time-resolvedFluorescenceImmunoassay）第5頁/共32頁時間分辨熒光免疫試劑

工作原理示意圖第6頁/共32頁微量反應孔包被好的表面抗體第7頁/共32頁表面抗原第8頁/共32頁V標記物輕鏈螯合劑Eu重鏈第9頁/共32頁V第10頁/共32頁V第11頁/共32頁HHHHHHHHHHHHHH第12頁/共32頁H第13頁/共32頁第14頁/共32頁標記物為具有獨特熒光特性的稀土金屬---鑭系元素鑭系元素共有15種，應用在時間分辨熒光免疫技術中有四種：銪(Eu)、釤（Sm)、鏑(Dy)、锝(Te)鑭系元素熒光特點：熒光壽命極長鑭系元素螯合物（60~900us)<銪：714us>普通熒光免疫中熒光團：1~100us樣本中蛋白質熒光：1~10us，易猝滅。Stokes位移大（大約290nm）銪：發(fā)射光613nm、激發(fā)光340nm，熒光素的Stokes位移為28nm熒光特異性強。（發(fā)射光譜帶很窄：615±5nm）解離-增強技術可使其熒光性提高100萬倍第15頁/共32頁利用鑭系元素熒光物理特性，熒光激發(fā)后在固定時間段檢測特異性熒光而在此時間之前，非特異性熒光已完全衰減為0時間分辨熒光免疫原理圖第16頁/共32頁利用鑭系元素光譜特點，將發(fā)射熒光與激發(fā)熒光分辨開來，零本底的又一保障發(fā)射光譜與激發(fā)光譜間存在的巨大Stokes位移?？梢酝ㄟ^干涉濾光片將發(fā)射光譜與激發(fā)光譜完全分離。第17頁/共32頁DELFIA技術為臨床檢測帶來的先進性技術特點檢驗先進性時間分辨光譜分辨特異性熒光與非特異性熒光分離發(fā)射熒光與激發(fā)熒光分離零背景、高特異性解離-增強熒光性大大提高穩(wěn)定的熒光螯合物線性范圍更寬重復性更好原子標記

標記位點多，可達20個對標記物結構及活性影響小無衰變受環(huán)境影響小高穩(wěn)定性，高精確度試劑保質期至少一年標準曲線保留時間長同一批次只需兩點定標多標記單，雙，三，四標記同一試劑盒可同時測多個項目第18頁/共32頁靈敏度更高，檢測范圍更廣以下數(shù)據(jù)均出自于各制造廠家自己的產(chǎn)品說明書試劑 DELFIA ImmuliteACS-180 AFP 0.1-1000IU/ml 0.2-300IU/ml 1.0-1000IU/ml CEA 0.1-500ng/ml 0.2-500ng/ml 0.5-100ng/ml HCG 0.5-10000U/L 5-5000U/L 2-1000U/L

TSH 0.005-100μU/ml 0.002-75μU/ml 0.03-150μU/mlFSH 0.05-256mU/ml 0.1-170mU/ml 0.3-200mU/ml Prog 0.08-120nmol/L 無 0.1-40ng/ml

Prolactin 0.04-250ng/ml 0.5-150ng/ml 0.3-200ng/ml

第19頁/共32頁時間分辨熒光免疫檢測的標準曲線相當穩(wěn)定，同一批次的試劑盒可用兩點法加批次的參考曲線定標0.5125102050100200500 U/L51002000Cps.103DELFIAhFSHN=6標準曲線穩(wěn)定，試劑保質期時間長第20頁/共32頁放射性免疫分析法（RIA）應用放免自60年代問世以來對臨床診斷起了革命性的貢獻，是一項較為成熟的診斷技術。夾心法、競爭法的標記原理為以后的檢測技術的發(fā)展奠定了基礎。缺點放射性（125I），對環(huán)境的污染及對身體的危害，該方法已經(jīng)為重視環(huán)保的國家逐步取消。（如整個歐洲僅尚存幾個放免試驗室）125I的半衰期短而導致其試劑有效期短。標記物125I的穩(wěn)定性差，導致試劑盒批間、批內的變異較大；標準曲線有效期短，必須每次定標，造成浪費。操作繁瑣，出報告時間長。無法保存?zhèn)溆?。?1頁/共32頁酶免疫分析法（ELISA）應用酶免的最大優(yōu)勢在于避免了對環(huán)境和人體危害。試劑有效期較長。衍生技術：熒光酶免疫分析增強化學發(fā)光酶免疫技術曾經(jīng)一度被認為是取代放免的檢測手段。缺點靈敏度、重復性不及放免，易造成漏檢和假陽性。因酶的純度和反應過程容易受環(huán)境因素影響，導致穩(wěn)定性不好。第22頁/共32頁化學發(fā)光免疫分析法（CLIA）應用單個樣本檢測速度快，適合做急診。靈敏度較高。自動化程度高。分類：以丫啶酯直接標記—ACS180系統(tǒng)以HRP標記，魯米諾為發(fā)光底物—Amerlite系統(tǒng)以AP為標記物，AMPPD為發(fā)光底物—Immulite系統(tǒng)缺點發(fā)光過程短，樣品不能重復檢測。本底較高，易受環(huán)境物質干擾。儀器故障率較高。試劑穩(wěn)定性較差，需多次定標。檢測精度不高，在超微量分析及早期診斷方面能力不足。非開放性試劑；試劑價格高。第23頁/共32頁電化學發(fā)光免疫分析法（ECL）應用80年代末期問世的新型化學發(fā)光免疫分析方法?；驹恚焊鶕?jù)三聯(lián)吡啶釕[Ru(bpy)3]和三丙胺在電場觸發(fā)下產(chǎn)生發(fā)光的化學發(fā)光反應。本底較小、靈敏度較高、線性范圍較寬。缺點非開放性試劑系統(tǒng)、不能做科研。試劑價格過高。第24頁/共32頁時間分辨熒光免疫的試劑種類內分泌科檢查甲狀腺系列： TSH，UltraTSH，T3，T4，F(xiàn)T3，F(xiàn)T4，TBG，TG糖尿病系列： Insulin，C-Peptie生長激素類： hGH其他： Cortisol婦產(chǎn)科檢查FSH，LH，HCG，ProlactinE2，E3，Testo，Prog，SHBG腫瘤科檢查AFP，CEA，PSA，hTG，β-2Micro，NSE，PAP，PSA（Free/Total），PSAEQM，CA-50，CA-125，CA-199，CA-153*，CA-724*，CY-211*遺傳科檢查產(chǎn)前篩查： hAFP/HCG，PAPPA新生兒篩查： Neo-TSH，Neo-T4，Neo-IRT，Neo-17a-OHProg，PKU核酸探針及基因雜交檢測，多標記定量PCR檢測。肝炎系列甲肝，乙肝，丙肝血液科檢測貧血檢查： Ferritin，VitB12，F(xiàn)olicacid白血?。? 免疫細胞分型等細胞學檢查細胞毒試驗等多種檢測項目，細胞質及組織化學分析等多種檢測項目酶類檢測及細胞受體檢測（包括MHC，HLA等多種檢測）科研工具單標記檢測，雙標記檢測，三標記檢測，四標記檢測第25頁/共32頁時間分辨熒光免疫---突出優(yōu)點零本底、靈敏度高線性范圍寬試劑有效期長標準曲線穩(wěn)定性好易于自動化TRFIA作為一項具有廣闊發(fā)展?jié)摿Φ男屡d生物學技術，將會給標記免疫學帶來一場革命。第26頁/共32頁時間分辨熒光與化學發(fā)光方法學比較

時間分辨熒光

化學發(fā)光發(fā)光效率 95%

1% 重復檢測 可無數(shù)次 不可重復 本底噪聲 零本底 干擾大靈敏級數(shù) 10-18

10-15標記物 原子 大分子化合物 標記位點 可達20個/抗體 1個/抗體 標準曲線 穩(wěn)定達一年以上 穩(wěn)定2到4周 多標記 有，最多可達四標記 無科研開發(fā) 有 無第27頁/共32頁時間分辨熒光和電化學發(fā)光的比較

時間分辨熒光

電化學發(fā)光標記物 四種原子:Eu,Sm,Te,Dy 一種原子:釕多標記技術 有 無做科研 能(1000多種科研項目) 無試劑種類 58種臨床,24種科研,共82種 28種臨床,無科研試劑試劑價格 低 高第28頁/共32頁泰萊—I時間分辨熒光免疫分析系統(tǒng)第29頁/共32頁泰萊—I時間分辨熒光免疫分析系統(tǒng)高靈敏度

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