外周血DNA的提取課件

外周血中DNA的提取與鑒定實(shí)驗?zāi)康?.

掌握人全血DNA提取的原理和操作步驟。2.

了解DNA基本理化性質(zhì)。3.3.初步了解DNA瓊脂糖電泳鑒定的方法。實(shí)驗原理DNA提取總的原則1保證DNA一級結(jié)構(gòu)的完整性；2其他生物分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類等分子的污染應(yīng)盡量降低到最低；3盡量去除對后續(xù)分子實(shí)驗有抑制作用的有機(jī)溶劑和重金屬離子；4其他核酸分子RNA，應(yīng)根據(jù)實(shí)際需要處理。實(shí)驗原理樣本來源?

理論上所有真核細(xì)胞、原核細(xì)胞、病毒等都可以提取DNA。?

樣本選擇取決于實(shí)驗?zāi)康摹?

全血是基因組提取中最常見的樣本之一。理化性質(zhì)核酸是由堿基、戊糖及磷酸組成的生物大分子，分為脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）兩類。1.酸堿性核酸分子中有酸性的磷酸基和堿性的含氮堿基，屬于兩性化合物，但是磷酸基的酸性較強(qiáng)，所以核酸總體上表現(xiàn)為酸性，帶負(fù)電荷。2.溶解度與粘度核酸是極性化合物，微溶于水，其鈉易鹽溶于水，而不溶于乙醇、苯酚、氯仿、乙醚等有機(jī)溶劑。核酸是高分子化合物，粘度很大。3.紫外吸收核酸有強(qiáng)烈的紫外吸收，其最大吸收峰在260nm處，常以A

表示。260實(shí)驗原理生物的大部分或幾乎全部的DNA都集中在細(xì)胞核或核質(zhì)體中，人與動物的DNA主要存在于細(xì)胞核中，并與蛋白質(zhì)結(jié)合的構(gòu)成大小不一的染色體。所以蛋白質(zhì)是DNA提取過程中常見的污染之一，而且蛋白質(zhì)污染常常影響到以后的DNA操作過程，因此提取過程中要把蛋白質(zhì)去除。實(shí)驗原理本實(shí)驗中DNA提取采用的是苯酚/氯仿抽提的方法。基本原理就是苯酚、氯仿對蛋白質(zhì)有極強(qiáng)的變性作用，而對DNA卻沒有影響。經(jīng)苯酚/氯仿抽提后，酚/氯仿相與水相完全分層，蛋白質(zhì)變性而被離心沉降到酚/氯仿相和水相的界面，DNA則留在水相。標(biāo)本中的脂類雜質(zhì)溶解于酚/氯仿相，從而與水相分離得以去除。實(shí)驗原理此方法提取得到的DNA可能會有RNA雜質(zhì)，但是RNA極易降解。而且少量的RNA對DNA的后續(xù)操作沒有大的影響，如有必要可以加入不含DNA酶的RNA酶去除RNA的污染。實(shí)驗步驟1.首先取EDTA抗凝的人外周血2mL,按照1:5～1:10的比例加入去離子水裂解8min，然后1700rpm/min離心，去掉含有紅細(xì)胞碎片的上清液，重復(fù)裂解一次，留取白細(xì)胞沉淀。實(shí)驗步驟2.加入0.5mL的DNA細(xì)胞裂解液來懸浮白細(xì)胞沉淀。實(shí)驗步驟3.

懸浮后的溶液中添加蛋白酶K20μL，65℃水浴0.5h，期間輕緩地倒轉(zhuǎn)幾次。。4.

室溫下，添加0.5mL的苯酚/氯仿/異戊醇混合抽提液，劇烈地震蕩混合10min，然后8000rpm/min離心10分鐘，然后將水相移至新的離心管中。實(shí)驗步驟5.添加1mL的預(yù)冷的無水乙醇到水相中，混勻，8000rpm/min離心3分鐘。6.沉淀用70%的預(yù)冷乙醇洗滌兩次，然后干燥，最后用50μ