蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能及研究方法

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能為什么研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和作用機理的深層次理解對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造的基礎(chǔ)對蛋白質(zhì)功能的控制“隨心所欲”創(chuàng)造具有新功能的蛋白質(zhì)血紅蛋白的結(jié)構(gòu)、功能及鐮刀形貧血病血紅蛋白（Hemoglobin,Hb)Hb(Mr64500)幾乎呈球形(d=5.5nm)，四聚體，每個亞基含一個血紅素(heme)輔基，2個亞基(141AAs)和2個亞基(146AAs)。亞基的三維結(jié)構(gòu)相似(與肌球蛋白的一致)。血紅蛋白的四級結(jié)構(gòu)顯示了不同亞基間強的相互作用。11界面(22)間存在強相互作用，即使用尿素處理，得到的是完整的二聚體，界面間是明顯的疏水作用，但也存在許多氫鍵和一些離子對作用。結(jié)合氧后引起結(jié)構(gòu)改變

血紅蛋白有兩個主要的構(gòu)象：R態(tài)(relaxed)和T態(tài)(tense)，氧可以與兩種狀態(tài)結(jié)合，但對R態(tài)的親和力更大。無氧結(jié)合時，T態(tài)更穩(wěn)定，表現(xiàn)出去氧血紅蛋白的主要的構(gòu)象。T態(tài)因更多的離子對作用更為穩(wěn)定，其中的多數(shù)存在于12（及21)界面間。氧與Hb一個亞基的T態(tài)結(jié)合，引起構(gòu)象改變?yōu)镽態(tài)，當(dāng)整個蛋白質(zhì)發(fā)生這樣的構(gòu)象改變，單個亞基的結(jié)構(gòu)幾乎沒有改變。但亞基對相互滑動和旋轉(zhuǎn)，使得亞基間的口袋變窄。這一過程中，穩(wěn)定T構(gòu)象的一些離子對被打破，同時產(chǎn)生一些新的離子對。去氧血紅蛋白的T狀態(tài)??TR轉(zhuǎn)變。帶正電荷的側(cè)鏈（藍(lán)色）和帶負(fù)電荷的側(cè)鏈（粉紅色）形成離子對。每個亞基的LysC5和每個亞基的AspFG1能夠看到，未作標(biāo)記。結(jié)合氧的血紅素附近的構(gòu)象變化。MaxPerutz假定TR的轉(zhuǎn)變是由于血紅素周圍幾個關(guān)鍵氨基酸側(cè)鏈位置的改變所引起的。T態(tài)的血紅素輕微皺褶，引起血紅素鐵突出His的側(cè)鏈。氧的結(jié)合引起血紅素呈現(xiàn)更平坦的構(gòu)象，將His側(cè)鏈改變而接觸F螺旋。S形（協(xié)同）結(jié)合曲線?？梢钥闯煞从车陀H和與高親和狀態(tài)轉(zhuǎn)變的雜合曲線。表明血紅蛋白在組織和肺之間對氧濃度微小差異更為敏感，使得血紅蛋白在高氧分壓的肺中能夠結(jié)構(gòu)氧，在低分壓的組織釋放出氧。pH對氧與血紅蛋白結(jié)合的影響。肺中血液的pH為7.6，組織的血液pH為7.2，實驗測定血紅蛋白與氧的結(jié)合在pH7.4。氧與血紅蛋白的結(jié)合受

2,3-二磷酸甘油酸（BPG）的調(diào)控2,3-二磷酸甘油酸(BPG)與Hb的作用表現(xiàn)為一種向異性的變構(gòu)調(diào)控行為。紅細(xì)胞中BPG的濃度相對較高。BPG能大大降低Hb對氧的親和力。

HbBPG+O2HbO2+BPGBPG結(jié)合Hb的位點與氧的不同，可以調(diào)控肺中與氧分壓相關(guān)的氧與Hb的親和力。高緯度時，BPG對于較低氧分壓的生理適應(yīng)起著重要作用。健康人體在海面上能釋放40%的氧進(jìn)入組織，如果被迅速轉(zhuǎn)移到4500米的山上(pO2低)，其向組織釋放氧的能力降低。幾個小時后血液BPG的濃度上升，降低Hb與氧的親和力，這種調(diào)節(jié)對于肺中氧的結(jié)合影響不大，但對組織中氧的釋放影響很大，可以恢復(fù)釋放血液攜帶氧的40%進(jìn)入組織。正常人位于海平面時血液中的BPG約為5mM，高緯度時約為8mM。BPG與去氧血紅蛋白的結(jié)合。BPG的結(jié)合穩(wěn)定去氧Hb的T態(tài)(a)，BPG所帶負(fù)電荷與T態(tài)亞基口袋周圍的正電荷側(cè)鏈作用(b)，由于氧的結(jié)合，T態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)镽態(tài)，BPG結(jié)合的口袋消失(c)。血紅蛋白分子病MolecularDiseaseofHemoglobin有時候蛋白質(zhì)上的一個點突變會造成對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的巨大影響鐮刀狀細(xì)胞貧血?。⊿ickle-CellAnemia）基因變異直接影響蛋白質(zhì)特性，表現(xiàn)出不同遺傳性狀。例如人的鐮形紅血球貧血癥。紅血球碟形HbA

HbS

突變

HbC

紅血球鐮刀形血紅蛋白分子有四條多肽鏈：兩條α鏈(141個氨基酸/條)；兩條β鏈(146個氨基酸/條)。

HbA、Hbs

、Hbc氨基酸組成的差異在于β鏈上第6位上氨基酸（亞基完全相同）：

HbA第6位為谷氨酸（GAA、GAG)；

HbS第6位為纈氨酸（GUA、GUG)；

HbC

第6位為賴氨酸（AAA、AAG）由于鏈一個氨基酸的突變（6Glu6Val），去氧血紅蛋白S的表面換成了一個疏水側(cè)鏈，進(jìn)一步引起分子發(fā)生線性締合，形成長鏈，多條長鏈進(jìn)一步聚集成多股螺旋的不溶性纖維。HbS與HbA的四級結(jié)構(gòu)差別不大，但在低氧（脫氧）時，HbS的溶解度急劇下降（為正常脫氧Hb的1/25）。產(chǎn)生貧血癥的原因：

單個堿基的突變引起氨基酸的改變導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，直接產(chǎn)生性狀變化。正常碟形紅血球轉(zhuǎn)變?yōu)殓牭缎渭t血球缺氧時表現(xiàn)貧血癥。HbA

HbS

HbC蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的

關(guān)系及其研究方法X-Ray衍射NMR(核磁共振)MolecularModelingMutation/Function(分子生物學(xué))結(jié)晶困難分子量不能太大理論不太完善費時費力內(nèi)容1、免疫體系中分子間的識別機制2、DNA與蛋白質(zhì)的相互作用3、蛋白水解酶與疾病4、膜蛋白、受體與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)5、酶抑制劑與藥物開發(fā)6、新技術(shù)與新方法

免疫體系分子的相互識別HelperTcell

--免疫體系的關(guān)鍵細(xì)胞

輔助T細(xì)胞巨噬細(xì)胞-吞噬抗原-加工抗原-遞呈給休止的輔助T細(xì)胞-輔助T細(xì)胞被活化-（1）激活免疫系統(tǒng)攻擊已識別的抗原；（2）激活B細(xì)胞；（3）增生殺傷T細(xì)胞MHCIIKillerTCell

--保衛(wèi)我們的主要戰(zhàn)士殺傷T細(xì)胞對抗入侵細(xì)胞的衛(wèi)士，但必須激活，首先要識別和結(jié)合特定的抗原片段-遞呈抗原-MHCI-激活的殺傷T細(xì)胞進(jìn)攻帶有識別抗原的病毒并消滅之。MHCI兩種T細(xì)胞上的MHC分子是特異性識別的關(guān)鍵主要組織相容性復(fù)合體

(MajorpatibilityComplex，MHC) 早期從組織器官移植實驗中發(fā)現(xiàn)，也是當(dāng)今免疫遺傳學(xué)的主要內(nèi)容。已發(fā)現(xiàn)，在人群或同種動物不同個體間進(jìn)行皮膚移植時出現(xiàn)的排斥反應(yīng)，具有記憶性、特異性和可轉(zhuǎn)移性等免疫反應(yīng)的基本特征，故從廿世紀(jì)40年代起就確認(rèn)移植排斥反應(yīng)是一種典型的免疫現(xiàn)象。引起排斥反應(yīng)的抗原稱移植抗原(transplantationantigen)或組織相容性抗原(patibilityantigen)。此等抗原存在于細(xì)胞表面，無器官特異性，不同個體間其抗原特異性互不相同，但同卵雙生及純系動物不同個體之間，其抗原特異性完全一致。Ⅰ類分子構(gòu)槽(A)和Ⅱ類分子構(gòu)槽(B)示意圖人類白細(xì)胞抗原(humanleucocyteantigen，HLA)。HLAI類分子HLAII類分子MHCIⅠ類抗原分子頂部α1和α2區(qū)組成的抗原肽結(jié)合區(qū)呈溝槽狀結(jié)構(gòu)，α1和α2區(qū)各含4股β片層和1個α螺旋，呈對稱排列而連接成一個溝槽，β片層組成槽底，其兩側(cè)由α螺旋組成。溝槽大小為2.5nm×1.0nm×1.1nm，可容納8-12個氨基酸殘基組成的短肽。溝槽內(nèi)氨基酸變化大，是Ⅰ類抗原多態(tài)性的基礎(chǔ)。雖然抗原肽與Ⅰ類分子的結(jié)合有一定的選擇性，但并不像抗原與抗體那樣高度特異地結(jié)合，只要被結(jié)合的多肽有2-3個關(guān)鍵的氨基酸能恰當(dāng)?shù)剡B接到溝槽內(nèi)的多肽結(jié)合基序(bindingmotif)的相應(yīng)位置上，多肽即可與之結(jié)合，并被運送到細(xì)胞表面遞呈給T細(xì)胞。所以每個Ⅰ類抗原分子能與一定廣度的多肽譜結(jié)合。α鏈由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)組成。胞外區(qū)可進(jìn)一步分為α1、α2和α3三個功能區(qū)?？缒^(qū)含疏水性氨基酸，排列成α螺旋跨越脂質(zhì)雙分子層。胞內(nèi)的氨基酸被磷?；笥欣诩?xì)胞外信息向胞內(nèi)傳遞。β2m無同種特異性，與α3功能區(qū)連接，其功能為有助于Ⅰ類抗原的表達(dá)和穩(wěn)定性。MHC1分子的結(jié)構(gòu)容納抗原的口袋MHCII，α1和β1區(qū)各自盤繞成一個α螺旋和β片層構(gòu)成溝槽的一個側(cè)壁和半個底面。由于它的末端是開放的，故可容納較長的多肽(約12-20個氨基酸)。該溝槽與多肽結(jié)合的特點基本上與Ⅰ類抗原相似，但被結(jié)合的多肽一般來自外源性抗原經(jīng)加工處理降解的產(chǎn)物。。Ⅱ類抗原是由Ⅱ類基因編碼的α鏈(34kD)和β鏈(29kD)非共價連接的糖蛋白。α鏈和β鏈在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分別合成后，很快與第3條鏈—γ鏈(或稱Ii鏈)結(jié)合成αβγ復(fù)合體，當(dāng)復(fù)合體到達(dá)（內(nèi)體/溶酶體樣結(jié)構(gòu))，γ鏈解離、降解。γ鏈的存在，使α、β鏈不能與其他胞內(nèi)蛋白結(jié)合，并協(xié)助αβ復(fù)合體轉(zhuǎn)運到MHC，使之與抗原結(jié)合。α鏈和β鏈，均由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)組成。胞外區(qū)各含兩個功能區(qū)α1、α2和β１、β2蛋白質(zhì)與DNA的相互作用Helix-Turn-Helix(HTH)Helix-Loop-Helix(HLH)Zinc-fingerLeucinezipper非特異性:特異性:HistonesDNA-蛋白質(zhì)相互作用的化學(xué)鍵1、氫鍵:具有識別功能蛋白質(zhì)的螺旋結(jié)構(gòu)常與DNA的大溝相互作用。2、疏水鍵：暴露于大溝側(cè)緣的T-CH3基團(tuán)是疏水性的，可與疏水氨基酸殘基側(cè)鏈相互作用。3、離子鍵：蛋白質(zhì)的帶電的氨基酸殘基的側(cè)鏈與DNA分子上的帶電基團(tuán)形成離子鍵。組蛋白（Histone)

組蛋白（與DNA非特異性結(jié)合）組蛋白帶正電荷，含Arg、Lys，堿性蛋白，含量恒定，真核細(xì)胞中組蛋白共有5種，分為兩類：一類是高度保守的核心組蛋白（corehistone）包括H2A、H2B、H3、H4四種；另一類是可變的連接組蛋白（linkerhistone）即H1。核心組蛋白的結(jié)構(gòu)是非常保守，特別是H4，牛和豌豆H4的102個氨基酸中僅有2個不同。核心組蛋白高度保守的原因可能有兩個：其一是核心組蛋白中絕大多數(shù)氨基酸都與DNA或其它組蛋白相互作用，可置換而不引起致命變異的氨基酸殘基很少；其二是在所有的生物中與組蛋白相互作用的DNA磷酸二酯骨架都是一樣的。

四種核心組蛋白通過C端疏水的氨基酸相互結(jié)合，N端帶正電荷的氨基酸向外伸出，與DNA分子結(jié)合，使DNA分子纏繞在組蛋白核心周圍，形成核小體。尾部含有大量Lys和Arg殘基，為組蛋白翻譯后進(jìn)行修飾的部位，如乙?；?、甲基化、磷酸化等。

H1不僅具有屬特異性，而且還有組織特異性，所以H1是多樣性的。核小體的結(jié)構(gòu)要點

每個核小體單位包括約200bp的DNA、一個組蛋白核心和一個H1。由H2A、H2B、H3、H4各兩分子形成八聚體，構(gòu)成盤狀核心顆粒；H3、H4形成4聚體，位于顆粒中央；H2A、H2B二聚體分別位于兩側(cè)。

DNA分子以左手螺旋纏繞在核心顆粒表面，每圈80bp，共1.75圈，約146bp，兩端被H1鎖合，H1

結(jié)合20bpDNA.

相鄰核心顆粒之間為一段60bp的連接線DNA(linkerDNA)，典型長度60bp。組蛋白與DNA是非特異性結(jié)合，核小體具有自主裝性質(zhì)。非組蛋白

非組蛋白是染色體上與特異DNA序列結(jié)合的蛋白質(zhì)，又稱序列特異性DNA結(jié)合蛋白（凝膠遲滯電泳實驗）。包括多種參與核酸代謝與修飾的酶類、核質(zhì)蛋白、骨架蛋白、基因表達(dá)和染色體結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)蛋白等。（1）非組蛋白的特性①含有較多的Asp和Glu，酸性蛋白質(zhì)；②整個細(xì)胞周期都進(jìn)行合成，不象組蛋白只在S期合成，并與DNA復(fù)制同步進(jìn)行；③能識別特異的DNA序列，識別信息存在于DNA本身，位點在大溝部分，識別與結(jié)合靠氫鍵和離子鍵；④具有多樣性和異質(zhì)性；⑤具有多種功能，如幫助DNA分子折疊，以形成不同的結(jié)構(gòu)域，從而有利于DNA的復(fù)制和基因的轉(zhuǎn)錄，協(xié)助啟動DNA復(fù)制，控制基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)基因表達(dá)。（2）序列特異性DNA結(jié)合蛋白的不同結(jié)構(gòu)模式①螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋模式（HTH)

蛋白質(zhì)形成對稱的同型二聚體，每個單位由20個氨基酸的小肽組成，兩個螺旋相互連接成β轉(zhuǎn)角。羧基端的螺旋負(fù)責(zé)識別DNA大溝的特異堿基信息，另一個螺旋與磷酸戊糖鏈骨架接觸。②鋅指模式

(ZincFinger)

每個鋅指單位是一個DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，由30個左右氨基酸殘基組成，其中一對Cys和一對His與Zn2+形成配位鍵，鋅指的C端形成

螺旋負(fù)責(zé)與DNA結(jié)合。③亮氨酸拉鏈?zhǔn)侥Ｊ?LeucineZipper)

蛋白質(zhì)肽鏈的羧基端約35個氨基酸殘基有形成a螺旋的特點，每兩圈（7個氨基酸殘基）有一個Leu殘基。螺旋一側(cè)的Leu排成一列，兩個蛋白質(zhì)分子的螺旋間靠Leu間疏水作用力形成一條拉鏈狀結(jié)構(gòu)。HTHMotif

最初發(fā)現(xiàn)于λ噬菌體的阻遏蛋白中，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)在很多原核及真核DNA結(jié)合蛋白中存在。由兩個較短的α螺旋與其間含Gly殘基的絞鏈組成。如大腸桿菌的CAP蛋白含一HTH結(jié)構(gòu)域，HTH通過DNA雙螺旋大溝識別、結(jié)合反向重復(fù)序列TGTG/CACA。蛋白質(zhì)與DNA的相互作用Helix-turn-helix，HTHHTH的分子識別機制鋅指結(jié)構(gòu)(ZincFingerStructure)

鋅指結(jié)構(gòu)：基因調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子存在于致癌基因、果蠅控制發(fā)育的基因、受生長因子和分化信號誘導(dǎo)合成的蛋白質(zhì)序列中。

鋅指區(qū)域：由四個Cys或二個Cys及二個His組成；保守序列Cys-N2-4-Cys-N12-14-His-N3-His。

鋅指蛋白：2~13個手指，各由23氨基酸組成，并由7~8個氨基酸連接；與DNA大溝結(jié)合并環(huán)繞DNA分子，大溝與特異DNA堿基互作。Zinc-finger蛋白結(jié)構(gòu)特征指狀結(jié)構(gòu)約含23個氨基酸殘基，鋅以4個配價鍵與4個Cys或2個Cys和2個His相結(jié)合。整個蛋白質(zhì)分子可有2-9個這樣的鋅指重復(fù)單位。每一個單位可以其指部伸入DNA雙螺旋的深溝，接觸5個核苷酸。如與GC框結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子SP1中就有連續(xù)的3個鋅指重復(fù)結(jié)構(gòu)。Cys2/His2鋅指結(jié)構(gòu)12AAs堿性亮氨酸拉鏈

(bZIP)

可形成蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)二聚體的亮氨酸拉鏈

(leucinezipper，LP)；具有35個氨基酸殘基，其中有4個亮氨酸，每7個氨基酸出現(xiàn)一次，形成α-螺旋時，每兩圈伸出一個亮氨酸，由亮氨酸殘基間的疏水作用力形成一條拉鏈，產(chǎn)生蛋白質(zhì)二聚體； 堿性α-螺旋與DNA磷酸殘基和堿基互作，二聚體剪刀結(jié)構(gòu)。Leucine-zipper的結(jié)構(gòu)特征蛋白質(zhì)分子的肽鏈上每隔6個氨基酸就有1個亮氨酸殘基，結(jié)果就導(dǎo)致這些亮氨酸殘基都在螺旋的同一個方向出現(xiàn)。兩個相同結(jié)構(gòu)的兩排亮氨酸殘基就能以疏水鍵結(jié)合成二聚體，該二聚體的另一端的肽段富含堿性氨基酸殘基，借其正電荷與DNA雙螺旋鏈上帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)結(jié)合。若不形成二聚體則對DNA的親和結(jié)合力明顯降低。這類蛋白質(zhì)能夠與CAAT框和病毒增強子結(jié)合，其特征就聚體形成域是能形成bZIP二聚體結(jié)構(gòu)。LeucineZipper蛋白的剪刀型結(jié)合模式足跡法研究DNA結(jié)合蛋白的結(jié)合位點

DNAFootPrinting

足跡法技術(shù)用于測定與特殊蛋白質(zhì)結(jié)合在DNA上的結(jié)合位點和相應(yīng)的核苷酸順序。如該技術(shù)提供了RNA聚合酶與啟動子之間相互作用的信息并確定了作用位點（啟動子）的核苷酸順序。研究蛋白質(zhì)在DNA上的結(jié)合位點的FootPrinting由含70RNA多聚酶全酶識別的典型大腸桿菌啟動子蛋白水解酶與人體疾病Cardiovasculardiseases心血管疾病HemophiliaA/B血友病Programmedcelldeath/appotosis細(xì)胞凋亡Alzheimerdisease癡呆Cancermetastasis癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移Pulmonaryemphysema/pancreatitis/arthritis

肺氣腫/胰腺炎/關(guān)節(jié)炎Parasitedisease:malaria/Tcruzain瘧疾InfluenzaA&AIDS甲型流感與愛滋病細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)有確定的壽命

Proteosome是蛋白質(zhì)降解的專業(yè)機構(gòu)蛋白質(zhì)降解的泛素—蛋白酶體途徑

泛素(ubiquitin，Ub)是76個氨基殘基組成的小分子多肽，可以以共價結(jié)合的方式與蛋白質(zhì)的賴氨酸相連。蛋白質(zhì)一旦接有泛素，稱為發(fā)生泛素化(uhiquitylation)。泛素化在ATP的參與下被三種酶依序催化，形成蛋白質(zhì)與一條泛素聚合鏈相結(jié)合的復(fù)合結(jié)構(gòu)，進(jìn)入蛋白酶體，然后降解為肽段。此為生物大分子在胞質(zhì)中降解的泛素—蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteosomepathway)。泛素化是一個具有普遍意義的免疫生物學(xué)現(xiàn)象。蛋白質(zhì)降解的泛素—蛋白酶體途徑

蛋白質(zhì)泛素化系統(tǒng)由3個組分構(gòu)成，一個稱為泛素激活酶E1，它可利用水解ATP釋放的能量以其Cys的巰基與泛素C端的Gly形成高能硫酯鍵。然后連接在其上的泛素被轉(zhuǎn)移到另一個泛素結(jié)合酶E2上，同時，被選中的靶蛋白與第三個組分即靶蛋白泛素連接酶E3結(jié)合。E2然后將與其連接的泛素轉(zhuǎn)移到靶蛋白上，并與靶蛋白Lys-NH2基團(tuán)形成異肽鍵(isopeptidebond)，E2被釋放。選擇什么樣的蛋白質(zhì)進(jìn)行泛素化主要取決于E2和E3。血栓形成（Thrombosis）

活體心臟、血管內(nèi)血液的某些成分析出，凝集形成固體質(zhì)塊的過程稱血栓形成，形成的固體質(zhì)塊叫血栓。內(nèi)膜損傷后血小板粘集，形成血小板小堆；以后內(nèi)源性凝血系統(tǒng)、外源性凝血系統(tǒng)激活，形成纖維蛋白，血小板與纖維蛋白等形成血小板血栓，阻礙血流，血流下游形成漩渦，形成新的血小板血栓，如此往復(fù)形成不規(guī)則梁索狀或珊瑚狀突起，稱為血小板小梁，在小梁間則由網(wǎng)有大量紅細(xì)胞的纖維蛋白網(wǎng)填充。后血栓逐漸增大，阻塞血管，血流停止，血液發(fā)生凝固，形成更大血栓。血栓形成與消除1.溶解吸收

2.機化→再通

3.軟化脫落→栓子→栓塞→梗死組織型纖溶酶原激活劑纖溶酶原激活物抑制物血纖維蛋白溶酶原溶纖酶甲型流感病毒與艾滋病毒流行性感冒病毒簡稱流感病毒，是引起流感的病原體。流感是一種上呼吸道急性傳染病，它傳染性強、傳播快、潛伏期短、發(fā)病率高。已引起數(shù)次世界性大流行，僅1918～1919年的世界大流行，死亡人數(shù)就達(dá)2000萬，對人類的生命健康危害極大。InfluenzaVirus流感病毒（Influenzavirus）屬正粘液病毒科，流感病毒屬，包括甲、乙、丙三型，甲型抗原變異性最強，感染人類和其他動物，引起中、重度疾病，侵襲所有年齡組人群，常引起世界性大流行。乙型變異性較弱，僅感染人類，一般引起輕微的疾病，主要侵襲兒童，可引起局部爆發(fā)。丙型抗原性比較穩(wěn)定，僅引起嬰幼兒感染和成人散發(fā)病例。甲型流感病毒根據(jù)H和N抗原不同，又分為許多亞型，H可分為15個亞型（H1～H15），N有9個亞型（N1～N9）。其中僅H1N1、H2N2、H3N2主要感染人類，其它許多亞型的自然宿主是多種禽類和動物。其中對禽類危害最大的為H5、H7和H9亞型毒株。LifeCycleofInfluenzaAvirusA型流感病毒的H抗原蛋白的結(jié)構(gòu)域受蛋白水解酶活化后才有感染細(xì)胞的能力艾滋病（AIDS)艾滋病的醫(yī)學(xué)全稱是“獲得性免疫缺陷綜合征（AcquiredImmunodeficiencySyndrome，縮寫AIDS）”，其病原為“人類免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyVirus，縮寫HIV）”。HIV專門攻擊人體的T淋巴細(xì)胞，致使人體免疫功能缺陷，進(jìn)而導(dǎo)致人體喪失了對各種病原體的抵抗能力而發(fā)生多種機會性感染、惡性腫瘤和多系統(tǒng)損害的綜合征，最終導(dǎo)致死亡。外界環(huán)境中的生存能力較弱，對物理因素和化學(xué)因素的抵抗能力較低。對熱很敏感，56℃處理30min可使其在體外對人的T淋巴細(xì)胞失去感染性，但不能完全滅活血清中的HIV，100℃處理20min可將其完全滅活。除此之外，75%的酒精也可滅活，但紫外線不能滅活。變異強：艾滋病毒的變異性很強，給研制預(yù)防性疫苗和治療性藥物帶來了極大困難。易感性：人群普遍易感，無國界、無季節(jié)性。HIV感染與人類的行為密切相關(guān)，如：多性伴、吸毒等。AIDS病毒生活史有個必須的Protease癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移需要蛋白水解酶的幫助膜蛋白、受體與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)

細(xì)胞來源:主要由單核巨噬細(xì)胞、Th2細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞產(chǎn)生。主要功能

（1）刺激活化Ｂ細(xì)胞增殖，分泌抗體；

（2）刺激Ｔ細(xì)胞增殖及CTL活化；

（3）刺激肝細(xì)胞合成急性期蛋白，參與炎癥反應(yīng)；

（4）促進(jìn)血細(xì)胞發(fā)育。白介素-6(Interleukin-6)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)纖維細(xì)胞生長因子（FGFs）

主要來自牛腦和腦垂體的提取液，是大約150個氨基酸結(jié)構(gòu)的酸性或堿性成纖維細(xì)胞生長因子（FGF：FGF1或FGF：FGF2），氨基酸的同源性為20%~50%。其后分離的癌基因產(chǎn)物的細(xì)胞增殖因子與上述FGFs結(jié)構(gòu)類似，也被分類在FGFs家族，并依次命名為FGF3~9。目前已發(fā)現(xiàn)23種FGFs。

FGFs作為細(xì)胞間信號分子在胚胎發(fā)生和分化過程中起重要作用。FGF的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)幾條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑酶抑制劑與藥物開發(fā)真正意義上的抗流感病毒藥物ZanamivirSialicacidGS4104NA抑制劑類藥物扎那米韋（Zanamivir，瑞沙）

GG167（Glaxo），為神經(jīng)氨酸酶(NA)抑制物，主要用于早期流感(發(fā)病兩天內(nèi))治療，尚未被批準(zhǔn)用于流感預(yù)防。對甲、乙型流感均有效。然而，對具有合并癥的流感療效較差，對全身性感染幾乎無效。1999年美國政府正式批準(zhǔn)其使用。奧司他韋（Oseltamivir，Tamiflu，達(dá)菲)

一種有效的抗病毒藥物，用于由A型流行性感冒和B型流行性感冒病毒感染導(dǎo)致的流感的預(yù)防和治療。是流感病毒神經(jīng)氨酸酶(Neuramindase)的特異性抑制劑，通過抑制神經(jīng)氨酸酶的作用,抑制成熟的流感病毒脫離宿主細(xì)胞，從而抑制流感病毒在人體內(nèi)的傳播，而起到預(yù)防和治療流行性感冒的作用。Oseltamivir本身屬于前體藥（Prodrug），在肝臟內(nèi)被水解后產(chǎn)生的活性代謝物自由羥基Oseltamivir才是神經(jīng)氨酸酶抑制物。Oseltamivir分子結(jié)合在神經(jīng)氨酸酶活性中心的X光衍射3維晶體圖金剛烷(Amantadine)的結(jié)構(gòu)作用于MatrixProtein2(M2)蛋白鹽酸金剛乙胺井岡烷胺作用于DNA聚合酶的抗病毒藥物病毒DNA聚合酶的抑制劑，真核生物的DNA聚合酶不敏感阿昔洛韋更昔洛韋噴昔洛韋法昔洛韋嘌呤核苷類似物，轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的三磷酸核苷酸，參入復(fù)制到DNA，導(dǎo)致鏈終止，抑制DNA依賴的DNA聚合酶活性。嘧啶核苷類似物，抑制病毒DNA復(fù)制，進(jìn)而導(dǎo)致RNA合成受阻，感染細(xì)胞DNAPol是其作用的靶部位。(E)-5-(2-溴乙烯基)-2'-脫氧尿苷氟阿糖碘胞苷氟碘阿糖尿嘧啶S-9-（3-羥基-2-磷?；籽醣┫汆堰饰鞫喔ｍf（嘌呤類）抗AIDS病毒

的藥物（I）膦甲酸作用機制為直接抑制病毒特異的DNA多聚酶和逆轉(zhuǎn)錄酶碘脫氧尿苷利巴韋林阿糖腺苷疊氮胸苷扎西他濱2,3-二脫氧胞苷去羥肌苷二脫氧肌苷核苷類抗AIDS藥物作用原理HIVprotease

作用于AIDS病毒專有的蛋白水解酶抗AIDS病毒的藥物（II）Viracept(Nelfinavir,Agouron,1998)Crivivian(Indinavir,Merck,1997)Invirase(Sequinavir,Roche,1995)Norvir(Ritonavir,Abbot,1997)茚地那韋利托那韋奈非那韋沙喹納韋計算機輔助藥物設(shè)計

是新藥研發(fā)的制高點特別適合抗結(jié)核病，抗愛滋病毒等藥物的研發(fā)Aspirin(水楊酸)的作用靶位COX1和COX2計算機設(shè)計的Celecoxib只抑制COX2抗病毒感染藥物的開發(fā)抗癌藥物的研究動態(tài)化療（Chemotherapy）藥物抗轉(zhuǎn)移藥物單克隆抗體藥物血管生成抑制藥物免疫增強藥物增敏藥物基因治療腫瘤疫苗PEG化的Asparaginase,等化療藥物講究靶向特異性MMP（基質(zhì)金屬蛋白酶）inhibitorCdk（周期素依賴性激酶）2/cdk4inhibitor,EGFR/KInhibitorPoly(ADP-ribose)polymerase(PARP)inhibitorGlycinamideRibonucleotideformyltransferase(GRFT)inhibitorTelomerase（端粒酶）inhibitorappotosisblockerinhibitorArtemisinin(青蒿素),等等新方向與新技術(shù)1、Proteomics2、Proteinchips3、Display/molecularevolutionengineering4、Two-hybridsystem5、Geneknockoutmice

WhatisProteomics?

(Genome+Protein

=proteinsexpressedbyagenome)一個細(xì)胞或一個組織基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)ProteomeandProteomics

蛋白質(zhì)組是澳大利亞學(xué)者Williams和Wilkins于1994年首先提出。對應(yīng)于基因組的所有蛋白質(zhì)構(gòu)成的整體，不是局限于一個或幾個蛋白質(zhì)。同一基因組在不同細(xì)胞、不同組織中的表達(dá)情況各不相同。在空間和時間上動態(tài)變化著的整體。

蛋白質(zhì)組學(xué)指應(yīng)用各種技術(shù)手段來研究蛋白質(zhì)組的一門新興科學(xué)，其目的是從整體的角度分析細(xì)胞內(nèi)動態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成份、表達(dá)水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，揭示蛋白質(zhì)功能與細(xì)胞生命活動規(guī)律。

發(fā)展簡史

1994年，澳大利亞學(xué)者Williams和Wilkins首先提出蛋白質(zhì)組。

1996年，澳大利亞建立了世界上第一個蛋白質(zhì)組研究中心。

NCI投資1000萬美元建立肺、直腸、乳腺、卵巢腫瘤的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫。

NCI和FDA共同投資數(shù)百萬美元建立癌癥不同階段的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫。英國建立三個蛋白質(zhì)組研究中心對已完成或即將完成全基因組測序的生物體進(jìn)行蛋白質(zhì)組研究。

Celera公司投資上億美元獨自啟動了全面鑒定和分類匯總?cè)祟惤M織、細(xì)胞和體液中的蛋白質(zhì)及其異構(gòu)體，構(gòu)建新一代的蛋白質(zhì)表達(dá)數(shù)據(jù)庫的工作。

1997年召開了第一次國際“蛋白質(zhì)組學(xué)”會議

1998年在美國舊金山召開了第二屆國際蛋白質(zhì)組學(xué)會議

1999年1月在英國倫敦舉行了應(yīng)用蛋白質(zhì)組會議

1998年，我國也于啟動了蛋白質(zhì)組學(xué)研究

2003，成立了中國人類蛋白質(zhì)組組織，03-04召開國內(nèi)第二及第三屆蛋白質(zhì)組學(xué)會議及國際蛋白質(zhì)組學(xué)大會，并將其納入863及973發(fā)展規(guī)劃。FunctionalanalysisState1State22DEPMFMS/MSLC-MS/MSDatabasesearchDifferentialanalysis?PMF:peptideMassFingerprinting(肽質(zhì)量指紋圖譜）蛋白質(zhì)組學(xué)的重要技術(shù)雙向凝膠電泳（2-DE）以質(zhì)譜為代表的蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)，樣品分子離子化后，根據(jù)離子間質(zhì)荷比（m/z）的差異來分離并確定樣品的分子量。

LC（分離）-MS（分子量）/MS（部分序列）多維色譜技術(shù)『LC/LC-MS/MS』，根據(jù)蛋白質(zhì)帶電性及疏水性不同，用MS分離多肽復(fù)合物。肽質(zhì)譜指紋圖（peptidemassfingerprinting，PMF）和數(shù)據(jù)庫搜尋。生物信息學(xué)分析。質(zhì)譜分析法（Spectrometry）質(zhì)譜分析法是通過對被測樣品離子的質(zhì)荷比的測定來進(jìn)行分析的一種分析方法。被分析的樣品首先要離子化，然后利用不同離子在電場或磁場的運動行為的不同，把離子按質(zhì)荷比（m/z）分開而得到質(zhì)譜，通過樣品的質(zhì)譜和相關(guān)信息，可以得到樣品的定性定量結(jié)果。MSidentifiesanalytesby:ProducinggasphaseionsSeparatingtheseionsaccordingtom/zratioDetectingtheionsSensitive:Detectattomole(10-18)concentrations質(zhì)譜是分子離子及碎片離子的質(zhì)量與其相對強度的譜,譜圖與分子結(jié)構(gòu)有關(guān)。質(zhì)譜是唯一可以給出分子量,確定分子式的方法,而分子式的確定對化合物的結(jié)構(gòu)鑒定是至關(guān)重要的。離子化的方法電子轟擊電離

ElectronImpactIonization,EI化學(xué)離子化ChemicalIonization,CI場電離，場解吸FieldIonizationFD,FieldDesorption，F(xiàn)D快原子轟擊

FastAtomBombardment,FAB基質(zhì)輔助激光解析電離

Matrix-AssistedLaserDesorptionIonization,MALDI電噴霧電離

ElectrosprayIonization,ESI大氣壓化學(xué)電離

AtmosphericPressureChemicalIonization,APCI聯(lián)合技術(shù)精確鑒定蛋白質(zhì)技術(shù)組織切片或印片原位質(zhì)譜分析技術(shù)

兩級飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜（MALDI-TOF/TOF）傅里葉轉(zhuǎn)換-回旋共振質(zhì)譜（FTMS）表面增強激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜（SELDI-TOF-MS）基質(zhì)輔助激光解析電離

Matrix-AssistedLaserDesorptionIonization

(MALDI)MALDI可使熱敏感或不揮發(fā)的化合物由固相直接得到離子。待測物質(zhì)的溶液與基質(zhì)的溶液混合后蒸發(fā)，使分析物與基質(zhì)成為晶體或半晶體，用一定波長的脈沖式激光進(jìn)行照射時，基質(zhì)分子能有效的吸收激光的能量，使基質(zhì)分子和樣品分子進(jìn)入氣相并得到電離。MALDI適用于生物大分子，如肽類、核酸類化合物?？傻玫椒肿与x子峰，無明顯碎片峰。此電離方式特別適合于飛行時間質(zhì)譜計。飛行時間質(zhì)量分析器

MassAnalysers:TimeofFlight(TOF)Developedin1950’sPopularisedin1980’sAdvantage:nouppermasslimitDisadvantage:poorresolutionR?2-5,000Timebetweeniongeneration&detectionApproximately10-7secondsVeryfastelectronicsrequiredVerylowmaintenanceItisjustanemptytube!飛行時間質(zhì)量分析器SchematicDiagramofaTOFIonsacceleratedbyelectricfieldAllowedtodrifttodetector傅立葉變換質(zhì)譜計

FourierTransform–MassSpectrometer,FT-MS

傅立葉變換質(zhì)譜計是傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜計，是受FT-NMR的啟迪。利用不同m/z的離子，在磁場的作用下，各自產(chǎn)生不同的回旋頻率。若施加一射頻場，使其頻率等于某一m/z離子的回旋頻率，則離子就會吸收能量而激發(fā)。離子從射頻場吸收能量，稱之離子的回旋共振。激發(fā)的離子運動速度(v)增大，運動軌道半徑(r)增大，稱之離子的回旋運動的激發(fā)。

如果磁場強度（B）一定，改變射頻場的頻率（）即可激發(fā)不同m/z的離子而得到質(zhì)譜。

FT-MS的核心為分析室，分析室由三對平行的極板構(gòu)成。磁力線沿z軸方向，離子的回旋運動垂直于z軸，在與x軸方向垂直的兩極板上施加激發(fā)射頻，在與y軸方向垂直的兩極板上檢測信號。

FT-MS分辨率極高，目前可得到精確度最高的精確質(zhì)量。

FT-MS靈密度高，質(zhì)量范圍寬，速度快，性能可靠。生物芯片(Biochip)的定義生物芯片（Biochip或Bioarray）是指包被在固相載體上的高密度DNA、抗原、抗體、細(xì)胞或組織的微點陣(microarray）。生物芯片包括DNA芯片、抗原芯片、抗體芯片、細(xì)胞芯片、組織芯片等。1998年世界十大科技突破之一。未來十年最具發(fā)展?jié)摿Φ募夹g(shù)。廣義上：矩陣型芯片、處理型芯片固化材料：基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、細(xì)胞芯片、組織芯片。研究歷史(ResearchHistory)1991Affymatrix公司StephenFodor:光刻與光化學(xué)技術(shù)、多肽和寡聚核苷酸微陣列。DNAChip概念Stanford大學(xué)Brown實驗室：預(yù)先合成，機械手陣列1995Schena等：基因表達(dá)譜1996Chee等：DNA測序1996Cronin等：突變檢測1996Sapolsley&Lipshutz：基因圖克隆1996Shalon等：復(fù)雜DNA樣本分析1996Shoemaker等：缺省突變定量表型分析根據(jù)應(yīng)用的分類基因變異檢測芯片疾病檢測(如HIV、P53基因、結(jié)核桿菌)法醫(yī)鑒定(如DNA指紋圖譜)表達(dá)譜芯片腫瘤相關(guān)基因(正常與腫瘤組織表達(dá)差異)藥物篩選(培養(yǎng)細(xì)胞藥物刺激前后表達(dá)差異)發(fā)育(同一組織不同發(fā)育時期基因表達(dá)差異)組織發(fā)生(不同組織或器官的基因表達(dá)差異)什么是生物芯片技術(shù)？以微點陣排列技術(shù)（MicroarrayTechnology）將生物大分子固定到適當(dāng)?shù)墓腆w載體上，方便各種生化和分子生物學(xué)的操作。蛋白質(zhì)芯片（ProteinChips，ProteinArray）技術(shù)基本原理：將高度密集排列的蛋白質(zhì)分子作為探針點陣固定在固相支持物上，當(dāng)與待測蛋白樣品反應(yīng)時，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測系統(tǒng)對靶蛋白進(jìn)行定性和定量分析。依據(jù)的雜交反應(yīng)原理:抗原-抗體反應(yīng)配體-受體反應(yīng)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用蛋白質(zhì)芯片的操作過程1.將抗原或抗體交聯(lián)（UV）或吸附在膜上；2.抗體或抗抗體標(biāo)記示蹤①酶：HRPO、AP②膠體金③熒光素：Cy3、Cy5、FITC、RB200、藻膽蛋白等3.檢測標(biāo)本中的抗體或抗原點抗原測抗體點抗原測抗體點抗體測抗體-捕獲法點抗體測抗原蛋白質(zhì)芯片篩選新藥的原理受體、酶的微點陣與中草藥抽提物反應(yīng)后再與受熒光標(biāo)記的配體或底物結(jié)合以激光進(jìn)行檢測不出現(xiàn)熒光的點表明中草藥樣品中含有與這些點上的蛋白質(zhì)相互作用的物質(zhì)，因此是作用于這些位點的新藥候補熒光基因芯片操作程序經(jīng)典的DNA芯片數(shù)據(jù)DNA芯片的操作過程利用半導(dǎo)體技術(shù)的DNA芯片酵母雙雜交(YeastTwoHybrid)

技術(shù)

蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用是很多生命現(xiàn)象的基礎(chǔ)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，特別是人類基因組計劃的完成，使人類對基因的結(jié)構(gòu)和功能的認(rèn)識不斷加深，但基因編碼的蛋白質(zhì)的功能研究尚是一個難題。酵母雙雜交系統(tǒng)利用酵母遺傳學(xué)方法分析蛋白質(zhì)之間的相互作用，該方法建立以來，經(jīng)過不斷的完善和發(fā)展，不但可以檢測已知蛋白質(zhì)之間的相互作用，更重要的在于發(fā)現(xiàn)新的與已知蛋白相互作用的未知蛋白質(zhì)。酵母雙雜交的原理利用酵母作為真核蛋白質(zhì)相互作用的模型利用誘餌質(zhì)粒篩選文庫或者單個已知蛋白通過報告基因的轉(zhuǎn)錄鑒定蛋白的相互作用使用不同的培養(yǎng)基篩選陽性克隆酵母雙雜交體系

酵母雙雜交由Fields等在1989年提出，是基于對真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子特別是酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4性質(zhì)的研究。GAL4包括兩個彼此分離的但功能必需的結(jié)構(gòu)域，位于N端1-174位氨基酸殘基區(qū)段的DNA結(jié)合域(DNA-BD)和位于C端768-881位氨基酸殘基區(qū)段的轉(zhuǎn)錄激活域(Activationdomain，AD)。DNA-BD能夠識別位于GAL4效應(yīng)基因(GAL4-responsivegene)的上游激活序列(Upstreamactivatingsequence,UAS)，并與之結(jié)合。而AD則是通過與轉(zhuǎn)錄機構(gòu)(transcriptionmachinery)中的其他成分之間的結(jié)合作用，以啟動UAS下游的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。DNA-BD和AD單獨分別作用并不能激活轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，但是當(dāng)二者在空間上充分接近時，則呈現(xiàn)完整的GAL4轉(zhuǎn)錄因子活性并可激活UAS下游啟動子，使啟動子下游基因得到轉(zhuǎn)錄。

酵母雙雜交系統(tǒng)利用雜交基因通過激活報道基因的表達(dá)探測蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)的相互作用。主要有二類載體:a.含DNA-bindingdomain的載體;b.含DNA-activatingdomain的載體。上述二類載體在構(gòu)建融合基因時，測試蛋白基因與結(jié)構(gòu)域基因必須在閱讀框內(nèi)融合。融合基因在報告株中表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物只有定位于核內(nèi)才能驅(qū)動報告基因的轉(zhuǎn)錄。例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localizationsequence,NLS)，而GAL4-ad沒有。因此在GAL4-ad氨基端或羧基端應(yīng)克隆來自SV40的T-抗原的一段序列作為核定位的序列。

另一個重要的元件是報道株，報道株指經(jīng)改造的、含報道基因(reportergene)的重組質(zhì)粒的宿主細(xì)胞。最常用的是酵母細(xì)胞，酵母細(xì)胞作為報道株的酵母雙雜交系統(tǒng)具有許多優(yōu)點:〈1〉易于轉(zhuǎn)化、便于回收擴(kuò)增質(zhì)粒。〈2〉具有可直接進(jìn)行選擇的標(biāo)記基因和特征性報道基因?！?〉酵母的內(nèi)源性蛋白不易與來源于哺乳動物的蛋白結(jié)合。一般編碼一個蛋白的基因融合到明確的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的DNA－結(jié)合結(jié)構(gòu)域(如GAL4-bd，LexA-bd)；另一個基因融合到轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(如GAL4-ad，VP16)。激活結(jié)構(gòu)域融合基因轉(zhuǎn)入表達(dá)結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合基因的酵母細(xì)胞系中，蛋白間的作用使得轉(zhuǎn)錄因子重建導(dǎo)致相鄰的報道基因表達(dá)(如lacZ)，從而可分析蛋白間的結(jié)合作用。酵母雙雜交模型DNA-BindingDomain誘餌蛋白BaitProtein捕獲（獵物）蛋白PreyProteinTranscriptionActivatingRegionReporterGeneDNA-BindingSite模型文庫篩選的步驟將待測基因與Gal4或LexA或其他合適蛋白的DNA結(jié)合域融合構(gòu)建誘餌質(zhì)粒。將誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化缺乏報告基因啟動子的酵母細(xì)胞株中，選擇被轉(zhuǎn)化的酵母。再將文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到酵母中。通過報告基因的功能篩選相互作用的蛋白。轉(zhuǎn)基因動物TransgenicAnimals什么是轉(zhuǎn)基因動物

將克隆的外源基因注射到一個受精卵的細(xì)胞核中；接種后的受精卵移植到雌性受體的子宮，使其順利完成胚胎發(fā)育；移植后的受精卵發(fā)育生長為后代，其中的部分后代其細(xì)胞中都攜帶有轉(zhuǎn)入的外源基因；利用這些能產(chǎn)生外源蛋白的動物作為種畜或種禽，培育新的純合系-轉(zhuǎn)基因動物。將特定的目的基因從某一生物體分離出來，進(jìn)行擴(kuò)增和加工，再導(dǎo)入另一動物的早期胚胎細(xì)胞中，使其整合到宿主動物的染色體上，在動物的發(fā)育過程中表達(dá)，并通過生殖細(xì)胞傳給后代。這種在基因組中穩(wěn)定整合有人工導(dǎo)入外源基因的動物-轉(zhuǎn)基因動物。轉(zhuǎn)基因動物的制備程序外源目的基因的制備外源目的基因有效導(dǎo)入生殖細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞選擇獲得攜有目的基因的細(xì)胞選擇合適的體外培養(yǎng)系統(tǒng)和宿主動物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞胚胎發(fā)育及鑒定篩選所得的轉(zhuǎn)基因動物品系轉(zhuǎn)基因鼠的制備-微注射法1980年，Gordon等人首先報道利用顯微注射純化DNA的方法獲得了世界上第一只轉(zhuǎn)基因鼠。1982年，美國科學(xué)家使用顯微注射技術(shù)將外源的大鼠生長激素基因?qū)胄∈蟮纳臣?xì)胞，發(fā)育成的轉(zhuǎn)基因小鼠比對照鼠要大上2倍，被稱為“超級鼠”1983年先后獲得了轉(zhuǎn)基因豬、羊、雞、兔、牛等。人和鼠有百分之九十九的基因相同1987年，首次報告從轉(zhuǎn)基因鼠的乳汁中可獲得有活性的人組織纖溶酶原激活劑和羊β乳球蛋白以來，通過轉(zhuǎn)基因動物的乳汁獲得異源性蛋白成為人們考慮生產(chǎn)治療性蛋白的潛在體系。1987年，Thomas等基因定點點突變轉(zhuǎn)基因鼠誕生。1988年，USPTO批準(zhǔn)了專利歷史上第一件哺乳動物專利—哈佛鼠專利，這是一只利用遺傳工程方法改變了特征的轉(zhuǎn)基因鼠。1989年，卡佩奇發(fā)表了里程碑式的論文，第一只基因敲除小鼠

1989年，精子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移方法制備轉(zhuǎn)基因鼠和轉(zhuǎn)基因豬。1991-1992，綿陽及牛乳腺生物反應(yīng)器。1995年，美國學(xué)者secheler建立轉(zhuǎn)基因鼠動物模型。1997年，Wilmsut等克隆綿羊（Dolly)1999年，基因打