14、放射生物學基礎及免疫治療進展

放射生物學及腫瘤免疫學進展廣州醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院袁亞維教授博導主要內容放射生物學電離輻射對生物體的作用電離輻射的細胞效應分次放射治療的生物學基礎腫瘤放療中生物劑量等效換算腫瘤免疫治療進展放療激活免疫治療的機制亞臨床證據(jù)結局的臨床證據(jù)放射生物學物理階段化學階段電離輻射作用于生物體直接作用間接作用水分子的電離與激發(fā)擴散自由基生物效應突變輻射晚期損傷生物分子的電離與激發(fā)修復化學鍵斷裂并形成DNA殘基細胞死亡DNA損傷生物階段1.電離輻射對生物體的作用2.電離輻射的細胞效應輻射誘導的DNA損傷及修復輻射所致的細胞死亡細胞存活曲線細胞周期時相與放射敏感性放射線對DNA的損傷

輻射所致DNA損傷主要是DNA鏈的斷裂DNA損傷是射線殺滅細胞和導致細胞突變的關鍵。DNA修復意義維持DNA序列的保真性；通過多種修復機制來糾正DNA損傷；DNA修復失敗可能導致基因突變、疾病和腫瘤。輻射所致的細胞死亡染色體DNA是輻射引起細胞死亡的主要靶點細胞經過電離輻射后大多數(shù)死亡，也有少部分細胞存活，用什么來反應電離輻射后的細胞存活

情況呢？細胞存活曲線

細胞放射存活曲線

（cellsurvivalcurves）

描述放射線照射劑量和細胞存活分數(shù)之間的關系，用以評估電離輻射對哺乳動物細胞增殖能力即再繁殖完整性的影響。

鑒別細胞存活的唯一標準：受照射后細胞是否保留無限增殖的能力，即是否具有再繁殖完整性。

離體細胞存活曲線的實驗方法細胞培養(yǎng)：細胞培養(yǎng)—胰酶消化—含血清培養(yǎng)液—單細胞懸液測定克隆形成率：細胞計數(shù)—稀釋接種—培養(yǎng)2周—結晶紫染色、計數(shù)（>50個細胞的克?。y定存活分數(shù)：接種后照射—培養(yǎng)2周—染色計數(shù)（同上）存活分數(shù)計算公式克隆形成率PE＝細胞克隆數(shù)/接種細胞數(shù)細胞存活率SF(survivingfraction)＝受照射細胞的克隆形成率/對照組細胞的克隆形成率以不同的劑量照射細胞，得到各劑量組的細胞存活分數(shù)，以劑量為橫坐標，存活分數(shù)為縱坐標，用適宜的數(shù)學模型進行曲線擬合，可得到在半對數(shù)坐標系上的細胞存活曲線。X射線細胞存活曲線細胞周期時相與放射敏感性

細胞周期中不同時相細胞放射敏感性變化的主要特征可概括為：有絲分裂期（M期）或接近有絲分裂期（G2）的細胞是放射最敏感的細胞；晚S期（DNA合成期）通常具有較大的放射抗拒性；對于G1期細胞，早期表現(xiàn)相對輻射抗拒，其后逐漸敏感，G1末期相對更敏感。3.分次放療的生物學因素臨床醫(yī)生在設計分次治療方案時，應注意把握兩個要點，即生物學的合理性和處方劑量設定的科學性。影響分次放射治療的生物學因素主要包括以下“4Rs”概念，即：細胞放射損傷的修復（Repair）；周期內細胞的再分布（Redistribution）；氧效應及乏氧細胞的再氧合（Reoxygenation）；再群體化（Repopulation）。輻射誘導的細胞放射損傷類型致死損傷(lethaldamage,LD)：受照射后細胞完全喪失了分裂增殖能力，是一種不可修復的，不可逆的和不能彌補的損傷。亞致死損傷(sublethaldamage,SLD)：受照射后細胞的部分靶而不是所有靶內所累積的電離事件，通常指DNA的單鍵斷裂。是一種可修復的放射損傷，對細胞死亡影響不大。潛在致死損傷(potentialdamage,PLD)：正常狀態(tài)下應當在照射后死亡的細胞，若在照射后置于適當條件下，由于損傷的修復又可存活的現(xiàn)象。但若得不到適宜的環(huán)境和條件則轉化為不可逆的損傷，使細胞最終喪失分裂能力。亞致死損傷的修復亞致死損傷的修復是指，假如將某一即定單次照射劑量分成間隔一定時間的兩次時，所觀察到的存活細胞增加的現(xiàn)象單次照射15.58Gy的存活分數(shù)是0.005，如果把這個劑量分成相等的2次，間隔30分鐘，細胞的存活分數(shù)要比單次照射明顯高一些，隨著間隔時間的延長細胞存活分數(shù)會繼續(xù)增高，而在2小時左右達到平臺。防止細胞在這段時間內發(fā)生細胞周期的移動。亞致死損傷的修復亞致死損傷的修復影響因素：放射性的性質：高LET射線照射后細胞沒有亞致死損傷，因此不存在亞致死損傷的修復。細胞的氧合狀態(tài)：處于慢性乏氧環(huán)境的細胞比氧合狀態(tài)好的細胞對亞致死損傷的修復能力差。細胞群的增殖狀態(tài)：未增殖的細胞幾乎沒有亞致死損傷的修復。PS：臨床非常規(guī)分割照射過程中，兩次照射之間間隔時間應大于6小時，以利于亞致死損傷完全修復。周期內細胞的再分布分次照射期間，處于細胞周期相對放射抗拒時相的腫瘤細胞向放射敏感時相移動。氧固定假說在有氧的條件下，氧與自由基R?作用形成有機過氧基（RO2?），并最終在靶分子上形成ROOH，它是靶物質的不可逆形式，于是損傷被化學固定下來，稱為氧“固定”作用。照射后即刻的乏氧分數(shù)將會接近100%，然后逐漸下降接近初始值，這種現(xiàn)象稱為再氧合。乏氧細胞的再氧合足氧細胞15％乏氧細胞Ray100％乏氧細胞15％乏氧細胞再氧合乏氧細胞的再氧合圖中說明了大劑量分次照射氧合好的細胞和乏氧細胞的效應。假如沒有再氧合發(fā)生，則每分次劑量照射后只能期望殺死極小比例的乏氧細胞，乏氧細胞的存活曲線較氧合好的細胞存活曲線平坦。在療程后期，乏氧細胞群體的效應將占重要地位，分次照射有利于乏氧細胞的再氧合，因此可采用分次放射治療的方法使其不斷氧合并逐步殺滅。再群體化再群體化（正常組織）：損傷之后，組織的干細胞在機體調節(jié)機制的作用下，增殖、分化、恢復組織原來形態(tài)的過程稱做再群體化。加速再群體化（腫瘤組織）：照射或使用細胞毒性藥物后可啟動腫瘤內存活的克隆源細胞，使之比照射或用藥以前分裂更快。放射治療期間存活的克隆源性細胞的再群體化是造成早反應組織、晚反應組織及腫瘤之間效應差別的重要因素之一。大部分早反應組織有一定程度的快速再群體化，而晚反應組織由于它的生物學特性一般認為療程中不發(fā)生再群體化。如果療程太長，療程后期的分次劑量效應將由于腫瘤內存活干細胞已被啟動進入快速再群體化而受到影響。再群體化的意義4.腫瘤放療中生物劑量等效換算生物劑量：指生物體對輻射反應程度的測量“生物劑量”與“物理劑量”是不同的概念通過換算數(shù)學模型進行不同放療計劃比較在放療計劃中有三個因素應經常被注意的：當改變常規(guī)治療計劃時應計算保持相等生物效應所需要的總劑量；爭取一個合理的分次方案；比較不同分次劑量、分次數(shù)、總治療時間的治療技術。生物劑量的概念

線性二次模型LQ模型（linear-quadraticmodel）

(DNA雙鏈斷裂模型)

SF=exp(-αD-βD2)orE=αD+βD2

SF存活分數(shù)

e自然對數(shù)

D分次照射的劑量αβ

系數(shù)

E組織效應水平上述公式表明，某一劑量造成的細胞殺傷可由直接致死效應和間接致死效應組成，即α型和β型細胞殺傷。當單次照射引起上述兩種效應相等時，α/β值即為兩種效應相等時的劑量。即αD=βD2時α/β=Dα/β比值反映了不同組織分次照射敏感性的差異。線性二次模型正常早反應組織：α/β值較高（約為10），表明直接殺傷相對明顯，損傷后以活躍增殖來促使損傷修復，對治療時間敏感。正常晚反應組織：α/β值較低（約為3），表明直接殺傷要比早反應組織少，可修復損傷累積引起的殺傷較多，對分割劑量敏感。線性二次模型生物效應劑量E（組織效應水平）=αD+βD2E/α=D+(β/α)D2E/α被稱作生物效應劑量生物效應劑量（biologicaleffectivedose,BED）是指分次數(shù)無窮多，分次劑量無窮小時產生相等生物效應所需的理論總劑量，單位為Gy。若分次劑量為d，采用分隔時間大于6小時的分割照射，分次數(shù)為n，且允許亞致死損傷獲得完全修復，BED公式可改寫為：BED=nd×[1+d/(α

/β)]患者男性，診斷單個肺轉移瘤，放療方案8Gy/F×5F，相當于常規(guī)分割（2Gy/F）劑量下要進行多少次放療？設：腫瘤的α/β=10GyBED=nd×[1+d/(α

/β)]計算結果：30次BED公式應用患者男性,45歲,診斷中央型肺癌，上腔靜脈壓迫綜合癥(SVCS),擬定放療計劃60Gy/30F，為緩解SVCS，先給3Gy/F×5F，其后繼續(xù)2Gy/F。Q:保持與2Gy/F相等晚期反應后續(xù)應給多少次？設：肺纖維化α/β=3GyBED=nd×[1+d/(α

/β)]計算結果：21FBED公式應用腫瘤免疫治療進展為什么腫瘤免疫治療如此轟動？Science年度十大科學突破，癌癥免疫療法登榜首免疫治療顯著延長晚期腫瘤患者生存時間化療和小分子靶向治療-控制癥狀，提高生活質量-生存曲線無明顯“拖尾現(xiàn)象”免疫治療-生存曲線“拖尾現(xiàn)象”證據(jù)（1）

PD-1抗體Nivolumab二線治療轉移性肺鱗癌(CheckMate017)

1年生存率42%，2年生存率30%BrahmerJ.NEnglJMed.2015;373(2):123-35.證據(jù)（2）

PD-1抗體Keytruda二線治療NSCLC

（Keynote-010,鱗癌和腺癌各1/2）

全體患者PD-L1>50%患者

GaronEB.Lancet2016;387:1540–50腫瘤免疫治療的變遷年代治療原則治療策略轉移性腫瘤受益安全性2000年之前非特異性活化免疫系統(tǒng)，或建立抗原特異性免疫應答驅動免疫應答IL-2、IFN、疫苗、LAK/IL-2、TIL/IL-2、CIK、NK、?δT黑色素瘤腎癌≯20%良好2000年之后1.建立抗原特異性免疫應答2.誘導淋巴細胞浸潤腫瘤組織3.解除免疫抑制，使淋巴細胞在腫瘤微環(huán)境中保持細胞毒性免疫應答型腫瘤：免疫剎車1.免疫檢查點抑制劑2.免疫刪除+TIL/多克隆CTL/IL-23.免疫刪除+疫苗免疫應答缺乏型腫瘤：模擬免疫殺傷1.免疫刪除+TCT-T/CAR-T2.抗體-藥物偶合物3.多功能抗體廣譜20%-80%毒性與療效如影隨形FDA批準上市的免疫治療藥物(2016.5)分類藥物適應癥細胞因子白介素2/干擾素/胸腺肽黑色素瘤、腎癌治療性腫瘤疫苗Provenge(2010)前列腺癌免疫檢查點抑制劑CTLA-4抗體：Ipilimumab(2011)黑色素瘤PD-1抗體：Pembrolizumab（2014）Nivolumab(2014)黑色素瘤、非小細胞肺癌、腎癌PD-L1抗體Atezolizumab（2016.5）膀胱癌抗體-藥物偶合物TrastuzumabEmtansine(2013)Her2(+)乳腺癌BrentuximabVedotin(2011)CD30+淋巴瘤

多功能抗體和改型抗體Cetumaxomab(2009,歐盟)EpCAM（+）癌性腹水Blinatumomab(2014)CD19（+）白血病Elotuzumab(2015)CS1（+）多發(fā)性骨髓瘤Daratumumab（2015）CD38(+)多發(fā)性骨髓瘤溶瘤病毒T-vec（2015.10）黑色素瘤上市的免疫檢查點蛋白特異性抗體靶點藥物適應癥上市時間伴隨診斷CTLA-4Ipilimumab(Yervoy)轉移性黑色素瘤2011.3III期皮膚黑色素瘤輔助治療2015.11PD-1Nivolumab（Opdivo）轉移性黑色素瘤2014.7（二線）2015.10（一線，BRAF野生型）轉移性腎癌2015.11（二線）轉移性肺鱗癌2015.3（二線）轉移性非鱗非小細胞肺癌2015.10（二線）PD-L1IHC28-8pharmDxtest

Pembrolizumab（Keytruda)轉移性黑色素瘤2014.9（二線）轉移性非小細胞肺癌2015.10（二線）PD-L1IHC22C3pharmDxtestCTLA4+PD-1Nivo+ipi轉移性黑色素瘤2015.9（一線）PD-L1Atezolizumab（Tecentriq）轉移性膀胱癌2016.5（二線）如何才能觸發(fā)免疫應答？StimulatoryandInhibitoryFactors

intheCancer-ImmunityCycleCytotoxicTlymphocyteassociatedantigen4(CTLA4)靜止狀態(tài)：CTLA-4存在于T細胞的胞漿中majorhistocompatibilitycomplextumour-associatedantigensTcellreceptor活化狀態(tài)：表達于細胞表面，阻止CD28與APC表面B7的結合，抑制T細胞的增殖負向共刺激分子B7活化信號通路

第二信號通路有兩種受體存在于T細胞表面B7CD28低親和力受體

CTLA-4高親和力受體B7傳遞陽性或陰性信號決定于T細胞上的配基B7-CD28結合：產生陽性信號，增強免疫反應，阻斷CTLA-4。B7-CTLA-4結合：封閉CD28依賴的T細胞激活，

產生陰性信號，下調免疫反應。

PD-1inT-cellactivation,exhaustion,andeffectorfunctionB7分為：B7-1（又名為CD80）和B7-2（又名為CD86）如何提高腫瘤免疫應答？如何設計免疫治療方案？免疫治療聯(lián)合放射治療1.放療激活免疫反應的機制直接殺死靶區(qū)內的腫瘤細胞腫瘤細胞釋放出大量及多樣性的腫瘤相關抗原(TAA)釋放危險信號輻射誘導損傷相關模式分子（DAMPs）細胞因子的表達IL-2、IL1a、IL1b、IL12、GM-CSF，促進APCs、T細胞的活化和增殖放療所致腫瘤支持間質的破壞增強免疫識別腫瘤相關成纖維細胞，有利于效應T細胞進入腫瘤內部與腫瘤細胞直接接觸腫瘤相關巨噬細胞、髓源性抑制性細胞（MDSCs），解除間質細胞的對效應T細胞的免疫抑制活性血管內皮細胞。異常血管結構正?；?，改善氧合狀態(tài)，有利于淋巴細胞、藥物進入腫瘤組織。免疫調制抗凋亡和/或促存活基因的下調抗原加工處理相關蛋白的表達鈣網(wǎng)蛋白轉位到腫瘤的細胞表面，與一些固有免疫細胞表面的受體CD91/lRP1結合，如巨噬細胞，樹突狀細胞等免疫細胞，增強免疫系統(tǒng)對這些細胞的免疫應答

Friedman,

E.

J.,Curr.Pharm.Des.,2002Friedman,

E.

J.,Curr.Pharm.Des.,20022.亞臨床證據(jù)1）SABR不同分割模式對免疫系統(tǒng)激活的影響有效的免疫刺激在7.5-10Gy，使用更高劑量的照射，即>15Gy，卻增加了脾臟調節(jié)性T細胞（Treg）的比例。這些數(shù)據(jù)表明SABR對免疫系統(tǒng)的激活存在一個閾劑量，低于這個劑量免疫刺激可能不是最理想的，高于這個劑量免疫抑制可能占優(yōu)勢。

Aryankalayil,

M.

J.Radiat.Res.2014Fractionatedradiationaffectstumorcontrol,tumor-specificIFNγ+splenocytesandalterssplenicTregs.MicebearingB16-OVAtumorsof4mminsizeweregivenfractionatedradiationin6hintervalsofatotaldoseof15Gyandleftfor7daystorecover.Schaue,

D.,Int.J.

Radi.Oncol.Biol.Phys,2012InflectionpointkineticsofimmunegenesinmultifractionatedtreatedPC3andDU145cellsasassessedbyreal-timeRT-PCR.PC3andDU145cellswereexposedto1–10Gyofradiationdeliveredas1Gymultifractionatedtreatment.

Aryankalayil,

M.

J.Radiat.Res.2014RadiationinducesproinflammatoryDAMPsandpositivelymodulatesthecytokineenvironment.Prostatecarcinomacells(DU145,PC3,LNCaP)wereexposedto10Gyfractionatedtreatment(1Gy×10,multifractionated,graybars)or10Gysingle-dosetreatment(10Gy,singledose,blackbars)orweremockirradiated(0Gy,openbars).Aryankalayil,

M.

J.Radiat.Res.2014在進行至少10Gy照射處理之后，共刺激和共抑制T細胞信號分子可能被調節(jié)，以促進多效抗腫瘤免疫反應。Bernstein,

M.

B.CancerBiother.Radiopharm.2014IrradiatedPCacellsmodulatethebalanceofpositiveandnegativecostimulatorymolecules(B)DU145cellswereirradiatedwith10Gyorleftuntreated(0Gy).Numbersindicatepercent-positivecells,andeachmoleculeisgraphedonanindependentscale.(C)PC3cells,(D)LNCaPcells,and(E)PrECs.*Statisticalsignificancerelativetountreatedcells.PCa,prostatecancer;PrECs,prostateepithelialcells.Bernstein,

M.

B.CancerBiother.Radiopharm.2014IrradiatedPCacellsmodulatethebalanceofpositiveandnegativecostimulatorymoleculesinadose-dependentmanner.(A)DU145