人類基因組DNA提取

人類基因組DNA第一頁，共29頁。人類基因組DNA提取的原理●哺乳動物的一切有核細(xì)胞都可以用來制備DNA，除特殊要求外，白細(xì)胞、肝或脾組織是最常用的材料。原始材料較少或較難獲得時(shí)（如羊水細(xì)胞），還必須經(jīng)過細(xì)胞培養(yǎng)來獲得足夠量的細(xì)胞；有時(shí)為了簡便易行起見，還可以無創(chuàng)傷地采集材料，如用口腔上皮脫落細(xì)胞、發(fā)根細(xì)胞。產(chǎn)前診斷所用的材料則為胎兒的羊水細(xì)胞或者絨毛膜細(xì)胞。第二頁，共29頁。人類基因組DNA提取的原理●根據(jù)材料來源不同，采取不同的材料處理方法，而后的DNA提取方法大體類似，但都應(yīng)考慮以下原則：（1）防止和抑制DNase對DNA的降解；（2）盡量減少對溶液中DNA的機(jī)械剪切破壞，保持DNA分子的完整；（3）將蛋白質(zhì)、脂類、糖類等物質(zhì)分離干凈。第三頁，共29頁。人類基因組DNA提取的原理●制備基因組DNA是進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)和功能研究的重要步驟，通常要求得到的片段的長度不小于100-200kb。在DNA提取過程中應(yīng)盡量避免使DNA斷裂和降解的各種因素，以保證DNA的完整性，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。一般真核細(xì)胞基因組DNA有107-9bp，可以從新鮮組織、培養(yǎng)細(xì)胞或低溫保存的組織細(xì)胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等試劑存在下用蛋白酶K消化細(xì)胞，隨后用酚抽提而實(shí)現(xiàn)的。這一方法獲得的DNA不僅經(jīng)酶切后可用于Southern分析，還可用于PCR的模板、文庫構(gòu)建等實(shí)驗(yàn)。第四頁，共29頁。人類基因組DNA提取的原理●SDS是一種去污劑，破壞細(xì)胞膜的脂質(zhì)膜?！竦鞍酌窴是一種很強(qiáng)的蛋白水解酶，能消化各種蛋白質(zhì)（包括糖蛋白和肽類）及脂類和胺類物質(zhì)，但糖蛋白的降解物常與DNA一同沉淀下來，干擾酶的活性，消化后需要用酚、氯仿抽提純化?！穹幽茏冃缘鞍踪|(zhì)而且還能將變性的蛋白質(zhì)溶解在其中。（加入1/3體積的飽和NaCl溶液，也可較好地祛除細(xì)胞降解物而純化DNA，可以避免酚的污染。）第五頁，共29頁。人類基因組DNA提取的方法●從全血中提取●從口腔上皮脫落細(xì)胞，發(fā)根細(xì)胞中提取●從胎兒的羊水細(xì)胞或者絨毛膜細(xì)胞中提?。ǔＳ糜诋a(chǎn)前診斷）根據(jù)來源：第六頁，共29頁。人類基因組DNA提取的方法●從全血中提取細(xì)胞裂解液：裂解細(xì)胞膜，收集細(xì)胞核SDS：破裂核膜蛋白酶K：使核蛋白降解成小片段并從DNA上解離下來苯酚﹑氯仿：抽提去除蛋白質(zhì)無水乙醇：沉淀DNA75%乙醇：洗滌DNA沉淀真空干燥后，溶解于TE(Tris(三羥甲基氨基甲烷)+EDTA)中即得到高分量的DNA第七頁，共29頁。人類基因組DNA提取的方法●從全血中提取裂解與RNase/蛋白酶K消化1.取100μl抗凝全血置于1.5mlEppendorf離心管中，再加入100μl裂解液和20μlRNaseA/蛋白酶K液，用移液器來回吹打混勻，室于55℃溫浴35分鐘，其間來回顛倒離心管幾次，直至溶液呈水溶狀。2.加入10μl3M的NaAc(pH4.8)，隨后加入1250μl結(jié)合緩沖液，充分振蕩混勻，12，000rpm離心30秒。第八頁，共29頁。人類基因組DNA提取的方法●從全血中提取裂解DNA與吸附柱結(jié)合3．用移液器Tip轉(zhuǎn)移上清并加入到離心吸附柱（套好收集管）中，放置1分鐘，12，000rpm離心30秒，倒掉收集管中的廢液。!注意!待轉(zhuǎn)移上清約1300μl，離心吸附柱容量約650μl，故需每次轉(zhuǎn)移上清650μl到離心吸附柱中，離心，倒掉收集管中的廢液，重復(fù)實(shí)驗(yàn)操作步驟3。第九頁，共29頁。人類基因組DNA提取的方法●從全血中提取裂解DNA的純化4.再加入600μl洗滌緩沖液（washingbuffer）到離心吸附柱（套好收集管）中，12，000rpm離心30秒。5．重復(fù)步驟4一次，12，000rpm離心3分鐘以充分除去洗滌緩沖液。6．小心取出離心吸附柱，棄收集管，將離心吸附柱套入一個(gè)干凈的1.5mlEppendorf離心管，并加入50μl洗脫緩沖液(elutionbuffer)到離心吸附柱中(洗脫緩沖液一定要加在離心吸附柱的正中)，放置1分鐘，于12，000rpm離心30秒。7．取出Eppendorf離心管，其中便是所提取基因組NA。第十頁，共29頁。人類基因組DNA提取的方法●從口腔上皮脫落細(xì)胞中提取裂解與裂解液消化1、用舌頭舔頰粘膜上顎、用牙刮頰部，嘬咀，用分泌出的唾液反復(fù)漱口；將唾液吐到杯中。用生理鹽水洗滌，2000rpm離心10分鐘，倒掉上清液；重復(fù)1次。2、沉淀中加1ml1×細(xì)胞核裂解液(STE)，打散細(xì)胞團(tuán)、混勻，再加酶解混合液（含350μlSTE、150μl10%SDS和10μl20mg/ml蛋白酶K），搖勻，至出現(xiàn)粘稠透明狀。37℃溫箱過夜或50℃3~4小時(shí)。第十一頁，共29頁。人類基因組DNA提取的方法●從口腔上皮脫落細(xì)胞中提取裂解離心除雜質(zhì)3、加等體積飽和酚（或1/3體積的飽和NaCl），輕搖混勻10分鐘，室溫2000rpm離心10分鐘，去除蛋白和SDS的沉淀。4、小心移上清至另一離心管（盡量避免吸取中間層），加等體積氯仿混勻5分鐘，室溫2000rpm離心5分鐘。5、重復(fù)步驟4一次。第十二頁，共29頁。人類基因組DNA提取的方法●從口腔上皮脫落細(xì)胞中提取裂解DNA的純化6、將上清移入另一離心管中，沿離心管壁向DNA溶液中加入2.5倍體積的無水乙醇，輕輕搖動離心管混和至體系完全均一，見白色絮狀DNA。用移液器吸頭挑出DNA沉淀，在新配制的70%乙醇洗二次，室溫干燥5分鐘，再將DNA溶于20-100μlTE中。7、TE溶解的DNA，在4℃下可保存一年，如要求長期保存，則需加2倍體積無水乙醇置-70℃保存。第十三頁，共29頁。人類基因組DNA提取的方法●酚、氯仿萃取法●酶學(xué)法●飽和鹽析法根據(jù)原理：第十四頁，共29頁。人類基因組DNA提取的方法●酚、氯仿萃取法苯酚/氯仿提取DNA是利用酚是蛋白質(zhì)的變性劑，反復(fù)抽提，使蛋白質(zhì)變性，SDS(十二烷基磺酸鈉)將細(xì)胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白質(zhì)或多肽或小肽分子，核蛋白變性降解，使DNA從核蛋白中游離出來。DNA易溶于水，不溶于有機(jī)溶劑。蛋白質(zhì)分子表面帶有親水基團(tuán)，也容易進(jìn)行水合作用，并在表面形成一層水化層，使蛋白質(zhì)分子能順利地進(jìn)入到水溶液中形成穩(wěn)定的膠體溶液。當(dāng)有機(jī)溶液存在時(shí)，蛋白質(zhì)的這種膠體穩(wěn)定性遭到破壞，變性沉淀。離心后有機(jī)溶劑在試管底層(有機(jī)相)，DNA存在于上層水相中，蛋白質(zhì)則沉淀于兩相之間。酚-氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白質(zhì)。氯仿的作用是有助于水相與有機(jī)相分離和除去DNA溶液中的酚。抽提后的DNA溶液用2倍體積的無水乙醇在NaCl存在下沉淀DNA，回收DNA用70%乙醇洗去DNA沉淀中的鹽，真空干燥，用TE緩沖液溶解DNA備用。第十五頁，共29頁。人類基因組DNA提取的方法●飽和鹽析法蛋白質(zhì)在低鹽濃度下的溶解度隨鹽液濃度升高而增加。球蛋白當(dāng)鹽濃度不斷上升時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度又以不同程度下降并先后析出（鹽析）。這是由于蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的電荷的極性基團(tuán)有靜電引力。當(dāng)水中加入少量鹽時(shí)，鹽離子與水分子對蛋白質(zhì)分子一的極性基團(tuán)的影響，使蛋白質(zhì)在水中溶解度增大。但鹽濃度增加一定程度時(shí)，水的活度降低，蛋白質(zhì)表面的電荷大量被中和，水化膜被破壞，于是蛋白質(zhì)相互聚集而沉淀析出。鹽析法是根據(jù)不同蛋白質(zhì)在一定濃度鹽溶液中溶解度降低程度不同達(dá)到彼此分離的方法。第十六頁，共29頁。人類基因組DNA提取的結(jié)果分析●聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)●紫外分光光度法●瓊脂糖凝膠電泳法●限制性內(nèi)切酶酶切法第十七頁，共29頁。人類基因組DNA提取的結(jié)果分析●聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)

PCR是利用DNA在體外攝氏95°高溫時(shí)變性會變成單鏈，低溫（經(jīng)常是60°C左右）時(shí)引物與單鏈按堿基互補(bǔ)配對的原則結(jié)合，再調(diào)溫度至DNA聚合酶最適反應(yīng)溫度（72°C左右），DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補(bǔ)鏈?；诰酆厦钢圃斓腜CR儀實(shí)際就是一個(gè)溫控設(shè)備，能在變性溫度，復(fù)性溫度，延伸溫度之間很好地進(jìn)行控制。第十八頁，共29頁。人類基因組DNA提取的結(jié)果分析●聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)第十九頁，共29頁。人類基因組DNA提取的結(jié)果分析●紫外分光光度法

提取得到的DNA的濃度和純度都是未知的，在后續(xù)的DNA酶切、連接及轉(zhuǎn)化等實(shí)驗(yàn)中需要一定的濃度和純度要求，因此要測定DNA的濃度和純度。組成DNA的堿基均具有一定的吸收紫外線特性，最大吸收值在波長為250～270nm之間，腺嘌呤的最大紫外線吸收值在260.5nm，胞嘧啶：267nm，鳥嘌呤：276nm，胸腺嘧啶：264.5nm，尿嘧啶：259nm。這些堿基與戊糖、磷酸形成核苷酸后其最大吸收峰不會改變，但核酸的最大吸收波長是260nm，吸收低谷在230nm。這個(gè)物理特性為測定核酸溶液濃度提供了基礎(chǔ)。在波長260nm紫外線下，10OD值的光密度相當(dāng)于雙鏈DNA濃度為50μg/ml，單鏈DNA或RNA為40μg/ml；單鏈寡聚核苷酸為20μg/ml第二十頁，共29頁。人類基因組DNA提取的結(jié)果分析●紫外分光光度法分光光度法不但能夠確定核酸的濃度，還可以通過測定在260nm和280nm的紫外線吸收值的比值（A260/A280）估計(jì)核酸的純度。DNA的比值為1.8，RNA的比值為2.0。若DNA比值高于1.8，說明制劑中RNA尚未除盡。RNA、DNA溶液中含有酚和蛋白質(zhì)將導(dǎo)致比值降低。270nm存在高吸收表明有酚的干擾。當(dāng)然也會出現(xiàn)既含蛋白質(zhì)又含RNA的DNA溶液比值為1.8的情況，所以有必要結(jié)合凝膠電泳等方法鑒定有無RNA，或用測定蛋白質(zhì)的方法檢測是否存在蛋白質(zhì)。紫外分光光度法只用于測定濃度大于0.25μg/ml的核酸溶液。第二十一頁，共29頁。人類基因組DNA提取的結(jié)果分析●限制性內(nèi)切酶酶切法限制性內(nèi)切酶(RE)是由細(xì)菌自己產(chǎn)生的能識別雙鏈DNA分子中的特定堿基順序，并以內(nèi)切方式水解核酸中的磷酸二酯鍵的核酸水解酶。它可分為三種類型：Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，Ⅱ型酶就是通常所指的RE，能識別雙鏈DNA的特異順序，并在這個(gè)順序內(nèi)進(jìn)行切割。同一DNA用不同的限制酶進(jìn)行切割，從而獲得各種限制酶的切割位點(diǎn)，由此建立的位點(diǎn)圖譜有助于對DNA的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。限制性核酸內(nèi)切酶分析技術(shù)是病原變異、毒株鑒別、分型及了解基因結(jié)構(gòu)和進(jìn)行流行病學(xué)研究的有效方法，對動物檢疫有很重要的實(shí)用意義，尤其對區(qū)別進(jìn)出境動物及動物產(chǎn)品攜帶病毒是疫苗毒還是野毒，以及推論其是本地毒還是外來毒有很重要的意義。第二十二頁，共29頁。人類基因組DNA提取的結(jié)果分析●瓊脂糖凝膠電泳法

瓊脂糖凝膠電泳是用于分離、鑒定和提純DNA片段的標(biāo)準(zhǔn)方法。瓊脂糖是從瓊脂中提取的一種多糖，具親水性，但不帶電荷，是一種很好的電泳支持物。DNA在堿性條件下（pH8.0的緩沖液）帶負(fù)電荷，在電場中通過凝膠介質(zhì)向正極移動，不同DNA分子片段由于分子和構(gòu)型不同，在電場中的泳動速率液不同。溴化乙錠（EB）可嵌入DNA分子堿基對間形成熒光絡(luò)合物，經(jīng)紫外線照射后，可分出不同的區(qū)帶，達(dá)到分離、鑒定分子量，篩選重組子的目的。第二十三頁，共29頁。人類基因組DNA提取的應(yīng)用1、人類基因組測序2、疾病基因的定位克隆3、多基因病的研究第二十四頁，共29頁。人類基因組DNA提取的應(yīng)用1、人類基因組測序1990年～1998年，人類基因組序列已完成和正在測序的共計(jì)約330Mb，占人基因組的11%左右；已識別出人類疾病相關(guān)的基因200個(gè)左右。此外，細(xì)菌、古細(xì)菌、支原體和酵母等17種生物的全基因組的測序已經(jīng)完成。1998年9月14日美國國家人類基因組計(jì)劃研究所（NHGRI）和美國能源部基因組研究計(jì)劃的負(fù)責(zé)人在一次咨詢會議上宣布，美國政府資助的人類基因組計(jì)劃將于2001年完成大部分蛋白質(zhì)編碼區(qū)的測序，約占基因組的三分之一，測序的差錯(cuò)率不超過萬分之一。同時(shí)還要完成一幅“工作草圖”，至少覆蓋基因組的90%，差錯(cuò)率為百分之一。2003年完成基因組測序，差錯(cuò)率為萬分之一。這一時(shí)間表顯示，計(jì)劃將比開始的目標(biāo)提前兩年完成。

第二十五頁，共29頁。人類基因組DNA提取的應(yīng)用2、疾病基因的定位克隆人類基因組計(jì)劃的直接動因是要解決包括腫瘤在內(nèi)的人類疾病的分子遺傳學(xué)問題。6000多個(gè)單基因遺傳病和多種大面積危害人類健康