如何進(jìn)行序列分析課件

序列分析一、堿基組成DNA序列一個(gè)顯而易見(jiàn)的特征是四種堿基類(lèi)型的分布。盡管四種堿基的頻率相等時(shí)對(duì)數(shù)學(xué)模型的建立可能是方便的，但幾乎所有的研究都證明堿基是以不同頻率分布的。表1包含了9個(gè)完整DNA分子序列的資料，表2的數(shù)據(jù)來(lái)自?xún)蓚€(gè)胎兒球蛋白基因(Gr和Ar)，每個(gè)基因具有三個(gè)外顯子和兩個(gè)內(nèi)含子(shen等1981)。這兩個(gè)例子說(shuō)明序列內(nèi)和序列間堿基具有不同的頻率。在基因每一側(cè)的500個(gè)任意堿基區(qū)域被稱(chēng)為“側(cè)翼”，基因間區(qū)域是指兩個(gè)基因間的其余序列。表2人類(lèi)胎兒球蛋白基因不同區(qū)段的堿基組成二．堿基相鄰頻率分析DNA序列的主要困難之一是堿基相鄰的頻率不是獨(dú)立的。堿基相鄰的頻率一般不等于單個(gè)堿基頻率的乘積例：雞血紅蛋白β鏈的mRNA編碼區(qū)的438個(gè)堿基圖1雞β球蛋白基因編碼區(qū)的DNA序列(GenBank：CHKHBBM，記錄號(hào)J00860)在編碼區(qū)，存在某種約束來(lái)限制DNA序列編碼氨基酸。在密碼子水平上，這一約束與堿基相鄰頻率有關(guān)。表4列出了遺傳密碼和圖1序列中各密碼子數(shù)量。盡管數(shù)目很小，難以作出有力的統(tǒng)計(jì)結(jié)論，但編碼同一氨基酸的不同密碼子(同義密碼子)好像不是等同存在的。這種密碼子偏倚必定與兩堿基相鄰頻率水平有關(guān)。表4還清楚地表明，由于密碼子第3位置上堿基的改變常常不會(huì)改變氨基酸的類(lèi)型，因而對(duì)第3位置上堿基的約束要比第2位堿基小得多。表464種可能的堿基三聯(lián)體密碼子及相應(yīng)的氨基酸數(shù)（據(jù)圖1序列）相鄰堿基之間的關(guān)聯(lián)將導(dǎo)致更遠(yuǎn)堿基之間的關(guān)聯(lián)，這些關(guān)聯(lián)延伸距離的估計(jì)可以從馬爾科夫鏈(Markovchain)理論得到(Javare和Giddings，1989)

例如：5字碼TGACC的值為1+3×44+2×43+0×42+1×41+1×40=459?？上葟牡蚹值的字碼開(kāi)始搜索。記錄序列中每一個(gè)位置k字碼的字碼值。只有在發(fā)現(xiàn)k字碼長(zhǎng)度重復(fù)的那些位置考慮進(jìn)行長(zhǎng)度大于k的字碼搜索。序列TGGAAATAAAACGTAAGTAG中所有堿基2字碼(k=2)的初始位置和字碼值。對(duì)于完全重復(fù)、長(zhǎng)度大于2的同向重復(fù)或亞序列的搜索可只限于2字碼重復(fù)的初始位置。在本例中只有4個(gè)重復(fù)的2堿基重復(fù)序列。例如，在位置4、5、8、9、10和15均發(fā)現(xiàn)了字碼值為1的堿基重復(fù)序列。從有重復(fù)的2堿基為起點(diǎn)的3字碼值中發(fā)現(xiàn)字碼值為1、45和49的序列有重復(fù)；以每一重復(fù)的3堿基為起點(diǎn)的4字碼搜索未能發(fā)現(xiàn)更長(zhǎng)的重復(fù)序列。表5序列TGGAAATAAAACGTAAGTAG的3字碼值和位置(Karlin,1983)四、RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)盡管現(xiàn)有一些RNA折疊程序可以預(yù)測(cè)RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，但這類(lèi)分析仍然是一門(mén)藝術(shù)。RNA折疊有助于找出RNA分子中可能的穩(wěn)定莖區(qū)，但對(duì)給定的RNA分子來(lái)說(shuō)，這一結(jié)果的生物學(xué)意義究竟有多大，還是一個(gè)未知數(shù)。即使有此局限性，二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)還是有助于找出mRNA控制區(qū)以及RNA分子中可能形成穩(wěn)定折疊結(jié)構(gòu)的區(qū)段。一種典型的真核蛋白質(zhì)編碼基因的結(jié)構(gòu)示意圖。其編碼序列（外顯子）是不連續(xù)的，被非編碼區(qū)（內(nèi)含子）隔斷。所謂基因區(qū)域預(yù)測(cè)，一般是指預(yù)測(cè)DNA序列中編碼蛋白質(zhì)的部分，即外顯子部分。不過(guò)目前基因區(qū)域的預(yù)測(cè)已從單純外顯子預(yù)測(cè)發(fā)展到整個(gè)基因結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)。這些預(yù)測(cè)綜合各種外顯子預(yù)測(cè)的算法和人們對(duì)基因結(jié)構(gòu)信號(hào)(如TATA盒等)的認(rèn)識(shí)，預(yù)測(cè)出可能的完整基因基因區(qū)域的預(yù)測(cè)是一個(gè)活躍的研究領(lǐng)域，先后有一大批預(yù)測(cè)算法和相應(yīng)程序被提出和應(yīng)用，其中有的方法對(duì)編碼序列的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率高達(dá)90%以上，而且在敏感性和特異性之間取得了很好的平衡預(yù)測(cè)方法中，最早是通過(guò)序列核苷酸頻率、密碼子等特性進(jìn)行預(yù)測(cè)(如最長(zhǎng)ORF法等)，隨著各類(lèi)數(shù)據(jù)庫(kù)的建立和完善，通過(guò)相似性列線(xiàn)比對(duì)也可以預(yù)測(cè)可能的基因。同時(shí)，一批新方法也被提了出來(lái)，如隱馬爾可夫模型(HiddenMarkovModel,HMM)、動(dòng)態(tài)規(guī)劃法(dynamicprogramming)、法則系統(tǒng)(ruled-basedsystem)、語(yǔ)言學(xué)(linguistic)方法、線(xiàn)性判別分析(LinearDiscriminantAnalysis,LDA)、決策樹(shù)(decisiontree)、拼接列線(xiàn)(splicedalingment)、博利葉分析(Fourieranalysis)等。下表列出了claverie(1997)對(duì)部分程序預(yù)測(cè)基因區(qū)域能力的比較結(jié)果，表中同時(shí)列出了相應(yīng)算法和程序的網(wǎng)址。目前基因區(qū)域預(yù)測(cè)的各種算法均存在以下2個(gè)問(wèn)題（1）目前算法對(duì)基因中的非編碼區(qū)和基因間序列不加任何區(qū)別，所以預(yù)測(cè)出的基因仍然是不完全的，對(duì)5‘和3‘非編譯區(qū)（UTR，untranslatedregion）的預(yù)測(cè)基本上還是空白；（2）目前大多數(shù)算法都是基于已知基因序列。如相似性列線(xiàn)比較算法是完全依賴(lài)于已知的序列，而象HMM之類(lèi)的算法都需要對(duì)已知的基因結(jié)構(gòu)信號(hào)進(jìn)行學(xué)習(xí)或訓(xùn)練，由于訓(xùn)練所用的序列畢竟是有限的，所以對(duì)那些與學(xué)習(xí)過(guò)的基因結(jié)構(gòu)不太相似的基因，這些算法的預(yù)測(cè)效果就要大打折扣了要解決以上兩個(gè)問(wèn)題，需要對(duì)基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行更深入的研究，尋找隱藏在基因不同結(jié)構(gòu)中的內(nèi)在統(tǒng)計(jì)規(guī)律。

2．發(fā)現(xiàn)基因的一般過(guò)程從序列中發(fā)現(xiàn)基因可以理解為基因區(qū)域預(yù)測(cè)和基因功能預(yù)測(cè)2個(gè)層次第一步：獲取DNA目標(biāo)序列①如果你已有目標(biāo)序列，可直接進(jìn)入第2步；②可通過(guò)PubMed查找你感興趣的資料；通過(guò)GenBank或EMBL等數(shù)據(jù)庫(kù)查找目標(biāo)序列第二步：查找ORF并將目標(biāo)序列翻譯成蛋白質(zhì)序列利用相應(yīng)工具，如ORFFinder、Genefeature(BaylorCollegeofMedicine)、GenLang(UniversityofPennsylvania)等，查找ORF并將DNA序列翻譯成蛋白質(zhì)序列第三步：在數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列搜索可以利用BLAST進(jìn)行ORF核苷酸序列和ORF翻譯的蛋白質(zhì)序列搜索第四步：進(jìn)行目標(biāo)序列與搜索得到的相似序列的整體列線(xiàn)(globalalignment)雖然第三步已進(jìn)行局部列線(xiàn)(localalignment)分析，但整體列線(xiàn)有助于進(jìn)一步加深目標(biāo)序列的認(rèn)識(shí)第八步：獲取相關(guān)蛋白質(zhì)的功能信息為了了解目標(biāo)序列的功能，收集與目標(biāo)序列和結(jié)構(gòu)相似蛋白質(zhì)的功能信息非常必要?？衫肞ubMed進(jìn)行搜索第九步：把目標(biāo)序列輸入“提醒”服務(wù)器如果有與目標(biāo)序列相似的新序列數(shù)據(jù)輸入數(shù)據(jù)庫(kù)，提醒(alert)服務(wù)會(huì)向你發(fā)出通知?？蛇x用SequenceAlerting(EMBL)、Swiss-Shop(Switzerland)等服務(wù)器3．解讀序列(makingsenseofthesequence)大致有2條途徑可以發(fā)現(xiàn)基因：(1)基于同源性的方法，包括已知mRNA序列的應(yīng)用；(2)基因家族和特殊序列間的比較。最初的方法包括利用各種計(jì)算機(jī)手段分析外顯子和其它序列信號(hào)，如酶切位點(diǎn)最長(zhǎng)ORF法：在細(xì)菌基因組中，蛋白質(zhì)編碼基因從起始密碼ATG到終止密碼平均有100bp，而300bp長(zhǎng)度以上的ORF平均每36Kb才出現(xiàn)一次，所以只要找出序列中最長(zhǎng)的ORF(>300bp)就能相當(dāng)準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)出基因利用編碼區(qū)與非編碼區(qū)密碼子選用頻率的差異進(jìn)行編碼區(qū)的統(tǒng)計(jì)學(xué)鑒別方法：由于內(nèi)含子的進(jìn)化不受約束，而外顯子則受到選擇壓力，因此內(nèi)含子的序列要比外顯子更隨機(jī)。這是目前各種預(yù)測(cè)程序中被廣泛應(yīng)用的一種方法，如GCG(GeneticComputerGroup研制，一種通用核酸、蛋白質(zhì)分析軟件包)的TestCode、美波士頓大學(xué)GeneID和BaylorMedcineCollege的BCMGeneFinder等程序均利用了這一方法CpG島：CpG島(CpGisland)一詞是用來(lái)描述哺乳動(dòng)物基因組DNA中的一部分序列，其特點(diǎn)是胞嘧啶(C)與鳥(niǎo)嘌呤(G)的總和超過(guò)4種堿基總和的50%，即每10個(gè)核苷酸約出現(xiàn)一次雙核苷酸序列CG。具有這種特點(diǎn)的序列僅占基因組DNA總量的10%左右。從已知的DNA序列統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，幾乎所有的管家基因(House-Keepinggene)及約占40%的組織特異性基因的5‘末端含有CpG島，其序列可能包括基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子及第一個(gè)外顯子。因此，在大規(guī)模DNA測(cè)序計(jì)劃中，每發(fā)現(xiàn)一個(gè)CpG島，則預(yù)示可能在此存在基因。另外，AT含量也可以作為編碼區(qū)的批示指標(biāo)之一七、序列比對(duì)相似性和同源性局部相似性和整體相似性相似性分?jǐn)?shù)矩陣概念：數(shù)據(jù)庫(kù)的搜索FastABLAST數(shù)據(jù)庫(kù)搜索的基礎(chǔ)是序列的相似性比對(duì)，而尋找同源序列則是數(shù)據(jù)庫(kù)搜索的主要目的之一。所謂同源序列，簡(jiǎn)單地說(shuō)，是指從某一共同祖先經(jīng)趨異進(jìn)化而形成的不同序列。同源性可以用來(lái)描述染色體—“同源染色體”、基因—“同源基因”和基因組的一個(gè)片斷—“同源片斷”必須指出，相似性(similarity)和同源性(homology)是兩個(gè)完全不同的概念。

相似性和同源性

相似性是指序列比對(duì)過(guò)程中用來(lái)描述檢測(cè)序列和目標(biāo)序列之間相同DNA堿基或氨基酸殘基順序所占比例的高低。相似性本身的含義，并不要求與進(jìn)化起源是否同一，與親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近、甚至于結(jié)構(gòu)與功能有什么聯(lián)系。當(dāng)相似程度高于50%時(shí)，比較容易推測(cè)檢測(cè)序列和目標(biāo)序列可能是同源序列；而當(dāng)相似性程度低于20%時(shí)，就難以確定或者根本無(wú)法確定其是否具有同源性?？傊?，不能把相似性和同源性混為一談。所謂“具有50%同源性”，或“這些序列高度同源”等說(shuō)法，都是不確切的，應(yīng)該避免使用。而同源又有兩種不同的情況即垂直方向的(orthology)與水平方向的(paralogy)。直系同源(orthology)是比較基因組學(xué)中最重要的定義。直系同源的定義是：(1)在進(jìn)化上起源于一個(gè)始祖基因并垂直傳遞(verticaldescent)的同源基因；(2)分布于兩種或兩種以上物種的基因組；(3)功能高度保守乃至于近乎相同，甚至于其在近緣物種可以相互替換；(4)結(jié)構(gòu)相似；(5)組織特異性與亞細(xì)胞分布相似鑒定直系同源的實(shí)際操作標(biāo)準(zhǔn)(practicalcriteria)為：如基因組Ⅰ中的A基因與基因組Ⅱ中的A‘基因被認(rèn)為是直系同源，則要求：(1)A‘的產(chǎn)物比任何在基因組Ⅱ中所發(fā)現(xiàn)的其它基因產(chǎn)物都更相似于A產(chǎn)物；(2)A‘與A的相似程度比在任何一個(gè)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的基因組中的任一基因都要高；(3)A編碼的蛋白與A‘編碼的蛋白要從頭到尾都能并排比較，即含有相似以至于相同的模序(motif)旁系同源(paralogy)基因是指同一基因組(或同系物種的基因組)中，由于始祖基因的加倍而橫向(horizontal)產(chǎn)生的幾個(gè)同源基因。直系與旁系的共性是同源，都源于各自的始祖基因。其區(qū)別在于：在進(jìn)化起源上，直系同源是強(qiáng)調(diào)在不同基因組中的垂直傳遞，旁系同源則是在同一基因組中的橫向加倍；在功能上，直系同源要求功能高度相似，而旁系同源在定義上對(duì)功能上沒(méi)有嚴(yán)格要求，可能相似，但也可能并不相似(盡管結(jié)構(gòu)上具一定程度的相似)，甚至于沒(méi)有功能(如基因家族中的假基因)。旁系同源的功能變異可能是橫向加倍后的重排變異或進(jìn)化上獲得了另一功能，其功能相似也許只是機(jī)械式的相關(guān)(mechanisticallyrelated)，或非直系同源基因取代新產(chǎn)生的非親緣或遠(yuǎn)緣蛋白在不同物種具有相似的功能。局部相似性和整體相似性序列比對(duì)的基本思想，是找出檢測(cè)序列和目標(biāo)序列的相似性。比對(duì)過(guò)程中需要在檢測(cè)序列或目標(biāo)序列中引入空位，以表示插入或刪除（圖2）。圖2序列比對(duì)，圖中“-”表示插入和刪除，用字符表示相同的殘基，“+”表示相似殘基序列比對(duì)的最終實(shí)現(xiàn)，必須依賴(lài)于某個(gè)數(shù)學(xué)模型。不同的模型，可以從不同角度反映序列的特性，如結(jié)構(gòu)、功能、進(jìn)化關(guān)系等。很難斷定，一個(gè)模型一定比另一個(gè)模型好，也不能說(shuō)某個(gè)比對(duì)結(jié)果一定正確或一定錯(cuò)誤，而只能說(shuō)它們從某個(gè)角度反映了序列的生物學(xué)特性。此外，模型參數(shù)的不同，也可能導(dǎo)致比對(duì)結(jié)果的不同。序列比對(duì)的數(shù)學(xué)模型大體可以分為兩類(lèi)，一類(lèi)從全長(zhǎng)序列出發(fā)，考慮序列的整體相似性，即整體比對(duì)；第二類(lèi)考慮序列部分區(qū)域的相似性，即局部比對(duì)。局部相似性比對(duì)的生物學(xué)基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)功能位點(diǎn)往往是由較短的序列片段組成的，這些部位的序列具有相當(dāng)大的保守性，盡管在序列的其它部位可能有插入、刪除或突變。此時(shí)，局部相似性比對(duì)往往比整體比對(duì)具有更高的靈敏度，其結(jié)果更具生物學(xué)意義。區(qū)分這兩類(lèi)相似性和這兩種不同的比對(duì)方法，對(duì)于正確選擇比對(duì)方法是十分重要的。應(yīng)該指出，在實(shí)際應(yīng)用中，用整體比對(duì)方法企圖找出只有局部相似性的兩個(gè)序列之間的關(guān)系，顯然是徒勞的；而用局部比對(duì)得到的結(jié)果也不能說(shuō)明這兩個(gè)序列的三維結(jié)構(gòu)或折疊方式一定相同。BLAST和FastA等常用的數(shù)據(jù)庫(kù)搜索程序均采用局部相似性比對(duì)的方法，具有較快的運(yùn)行速度，而基于整體相似性比對(duì)的數(shù)據(jù)庫(kù)搜索程序則需要超級(jí)計(jì)算機(jī)或?qū)Ｓ糜?jì)算機(jī)才能實(shí)現(xiàn)。有2種經(jīng)典方法可以計(jì)算兩條序列間的最適聯(lián)配。Needleman-Wunsch算法是一種整體聯(lián)配(globalalignment)算法，最佳聯(lián)配（兩條蛋白質(zhì)序列具有最多匹配殘基）中包括了全部的最短匹配序列。Smith-Wateman算法是在Needleman-Wunsch算法基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的，它是一種局部聯(lián)配(Localalignment)算法。這二種算法均可以用于核酸和蛋白質(zhì)序列。在給定空位罰值和替換矩陣情況下，它們總是能給出具有最高聯(lián)配值的聯(lián)配。但是，這個(gè)聯(lián)配并不需要達(dá)到生物學(xué)意義上的顯著水平。許多程序可通過(guò)匿名ftp服務(wù)用于兩條序列的聯(lián)配計(jì)算。GCG軟件包中，BESFIT和GAP程序便是用于兩對(duì)序列的聯(lián)配。在一些網(wǎng)站可以進(jìn)行兩條序列的聯(lián)配分析，例如：ALIGN()/Align()。ALIGN允許用戶(hù)提供序列進(jìn)行聯(lián)配，允許選擇替換矩陣，但不能設(shè)置空位罰值。Align只能進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)中已有序列間的聯(lián)配分析。從整體上分析兩個(gè)序列的關(guān)系，即考慮序列總長(zhǎng)的整體比較，用類(lèi)似于使整體相似(globalsimilarity)最大化的方式，對(duì)序列進(jìn)行聯(lián)配。兩個(gè)不等長(zhǎng)度序列的聯(lián)配分析必需考慮在一個(gè)序列中圈掉一些堿基或在另一序列作空位(gap)處理。Needleman和Wunsch(1970)的法則為這些步驟提供了實(shí)例。這一算法是為氨基酸序列發(fā)展的，但也可以用于核苷酸序列。算法最初尋求的是使兩條序列間的距離最小。盡管這類(lèi)距離的元素是以一種特定的方式定義的，但該算法的良好特性在于它確定了最短距離。這是一個(gè)動(dòng)態(tài)規(guī)劃(dynamicprogramming)的方法。Needleman-Wunsch算法Needleman-Wunsch算法將兩條聯(lián)配的序列沿雙向表的軸放置。從任一堿基對(duì)，即表中的任一單元開(kāi)始，聯(lián)配可延三種可能的方式延伸：如果堿基不匹配，則每一序列加上一個(gè)堿基，并給其增加一個(gè)規(guī)定的距離權(quán)重；或在一個(gè)序列中增加一個(gè)堿基而在另一序列中增加一個(gè)空位或反之亦然。引入一個(gè)空位時(shí)也將增加一個(gè)規(guī)定的距離權(quán)重。Needleman-Wunsch算法因此，表中的一個(gè)單元可以從(至多)三個(gè)相鄰的單元達(dá)到。我們把到左上角單元距離最小的方向看作相似序列延伸的方向。等距離時(shí)意味著存在兩種可能的方向。將這些方向記錄下來(lái)，并在研究了所有的單元之后，沿著記錄的方向就有一條路徑可從右下角(兩個(gè)序列的末端)追蹤到左上角(兩個(gè)序列的起點(diǎn))。由此所產(chǎn)生的路徑將給出具有最短距離的序列聯(lián)配。Needleman-Wunsch算法以?xún)蓚€(gè)短序列CTGTATC和CTATAATCCC為例：設(shè)堿基錯(cuò)配時(shí)距離權(quán)重為1，引入一個(gè)空位時(shí)距離權(quán)重為3。該圖邊緣的行和列作為起始條件增加到表中。在單元5行3列，即相應(yīng)較短序列(第二序列)的第2個(gè)T堿基和較長(zhǎng)序列(第一序列)的第1個(gè)T堿基位置，有三種可能的距離增量。設(shè)在各序列中增加堿基T時(shí)(從4行2列移動(dòng))對(duì)距離的貢獻(xiàn)為0。從5行2列的位置作水平移動(dòng)(等價(jià)于增加第二序列的堿基T而在第一序列引入一個(gè)空位)，在本例中增加一個(gè)罰值3。從3列4行向該單元作垂直移動(dòng)，使第一序列增加堿基T而第二序列引入一個(gè)空位，結(jié)果也得到一個(gè)罰值3。因此從該單元(5行3列)所得到的最小距離的延伸方向是沿對(duì)角線(xiàn)和水平方向。在表中這兩個(gè)方向用箭頭表示。這兩種最短方向都使從左上角到該單元的距離為6。沿箭頭所指方向在表中從右下角向左上角追蹤，得到6種可能的聯(lián)配：在上述6種聯(lián)配中，距離均為10，即在較短序列中有6個(gè)匹配堿基、1個(gè)錯(cuò)配堿基和3個(gè)空位Needleman-Wunsch算法當(dāng)兩個(gè)序列被聯(lián)配時(shí)，通過(guò)計(jì)算其重排序列(shuffedversion)的聯(lián)配距離，可以得到這兩個(gè)序列間的最小距離估計(jì)。如果實(shí)際得到的聯(lián)配距離小于重排序列距離的95%，則表明實(shí)際的聯(lián)配距離達(dá)到了5%的顯著水平，是不可能由機(jī)誤造成的。Smith-Waterman算法由于親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的蛋白質(zhì)序列可能只有一些相互獨(dú)立的相同片段，所以進(jìn)行局部相似性分析有時(shí)可能比整體相似性分析更合理。Smith和Waterman描述了一種查找具有最高相似性片段的算法。對(duì)于序列A=(a1,a2,…,am)和B=(b1,b2,…,bn)，Hij被定義為以ai和bj堿基對(duì)結(jié)束的片段(亞序列)的相似性值。與Needle-Wunsch算法一樣，Smith-Waterman算法也要利用遞推關(guān)系來(lái)確定相似性計(jì)算中包括2個(gè)統(tǒng)計(jì)量：堿基對(duì)(序列因子)的相似性值和空位權(quán)重(k為空位長(zhǎng)度)。Smith-Waterman算法可以給出2條序列的最大相似性值。Smith-Waterman算法相似性分?jǐn)?shù)矩陣在對(duì)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索時(shí)，可采用不同的相似性分?jǐn)?shù)矩陣，以提高搜索的靈敏度和準(zhǔn)確率。常用的相似性矩陣有突變數(shù)據(jù)矩陣(MutationDataMatrix，簡(jiǎn)稱(chēng)MD)和模塊替換矩陣(BLOcksSubstitutionMatrix，簡(jiǎn)稱(chēng)BLOSUM)。在序列比對(duì)中，通常希望使用能夠反映一個(gè)氨基酸發(fā)生改變的概率與兩個(gè)氨基酸隨機(jī)出現(xiàn)的概率的比值的矩陣。這些比值可以用相關(guān)幾率（relatednessodds）矩陣表示。這就是突變數(shù)據(jù)相似性分?jǐn)?shù)矩陣產(chǎn)生的基礎(chǔ)，在序列比對(duì)過(guò)程中，兩個(gè)序列從頭到尾逐個(gè)殘基進(jìn)行比對(duì)，所得幾率值的乘積就是整個(gè)比對(duì)的分值。在實(shí)際使用時(shí)，通常取幾率值的對(duì)數(shù)以簡(jiǎn)化運(yùn)算。因此，常用的突變數(shù)據(jù)矩陣PAM250實(shí)際上是幾率值的對(duì)數(shù)矩陣（圖3）。矩陣中值大于0的元素所對(duì)應(yīng)的兩個(gè)殘基之間發(fā)生突變的可能性較大，值小于0的元素所對(duì)應(yīng)的兩個(gè)殘基之間發(fā)生突變的可能性較小圖3突變數(shù)據(jù)相似性分?jǐn)?shù)矩陣PAM250突變數(shù)據(jù)矩陣PAM即可接受點(diǎn)突變(PointAcceptedMutation，簡(jiǎn)稱(chēng)PAM)。1個(gè)PAM的進(jìn)化距離表示100個(gè)殘基中發(fā)生一個(gè)殘基突變的概率。對(duì)應(yīng)于一個(gè)更大進(jìn)化距離間隔的突變概率矩陣，可以通過(guò)對(duì)初始矩陣進(jìn)行適當(dāng)?shù)臄?shù)學(xué)處理得到[Dayhoff等，1978]，如常用的PAM250矩陣，PAM250相似性分?jǐn)?shù)矩陣相當(dāng)于在兩個(gè)序列之間具有20%的殘基匹配(圖3)。主對(duì)角線(xiàn)上分?jǐn)?shù)值是指兩個(gè)相同殘基之間的相似性分?jǐn)?shù)值，有些殘基的分值較高，如色氨酸W為17、半胱氨酸C為12，說(shuō)明它們比較保守，不易突變；有的殘基的分值較低，如絲氨酸S、丙氨酸A、門(mén)冬酰氨N三種氨基酸均為2，這些氨基酸則比較容易突變。不同氨基酸之間的分?jǐn)?shù)值越高，它們之間的相似性越高，進(jìn)化過(guò)程中容易發(fā)生互相突變，如苯丙氨酸F和酪氨酸Y，它們之間的相似性分?jǐn)?shù)值是7。而相似性分?jǐn)?shù)值為負(fù)數(shù)的氨基酸之間的相似性則較低，如甘氨酸和色氨酸之間為-7，它們?cè)谶M(jìn)化過(guò)程中不易發(fā)生互相突變。此外，表中把理化性質(zhì)相似的氨基酸按組排列在一起，如堿性氨基酸組氨酸H、精氨酸R和賴(lài)氨酸K。突變數(shù)據(jù)矩陣的產(chǎn)生基于相似性較高（通常為85%以上）的序列比對(duì)，那些進(jìn)化距離較遠(yuǎn)的矩陣（如PAM250）是從初始模型中推算出來(lái)而不是直接計(jì)算得到的，其準(zhǔn)確率受到一定限制。而序列分析的關(guān)鍵是檢測(cè)進(jìn)化距離較遠(yuǎn)的序列之間是否具有同源性，因此突變數(shù)據(jù)矩陣在實(shí)際使用時(shí)存在著一定的局限性。而模塊替換矩陣BLOSUM則以序列片段為基礎(chǔ)，它是基于蛋白質(zhì)模塊數(shù)據(jù)庫(kù)BLOCKS，Henikoff夫婦（Henikoff和Henikoff，1992）從蛋白質(zhì)模塊數(shù)據(jù)庫(kù)BLOCKS中找出一組替換矩陣，用于解決序列的遠(yuǎn)距離相關(guān)。在構(gòu)建矩陣過(guò)程中，通過(guò)設(shè)置最小相同殘基數(shù)百分比將序列片段整合在一起，以避免由于同一個(gè)殘基對(duì)被重復(fù)計(jì)數(shù)而引入的任何潛在的偏差。在每一片段中，計(jì)算出每個(gè)殘基位置的平均貢獻(xiàn)，使得整個(gè)片段可以有效地被看作為單一序列。通過(guò)設(shè)置不同的百分比，產(chǎn)生了不同矩陣。由此，例如高于或等于80%相同的序列組成的串可用于產(chǎn)生BLOSUM80矩陣（BlOcksSUbstitutionMatrix發(fā)音為blossom）；那些有62%或以上相同的串用于產(chǎn)生BLOSUM62矩陣，依此類(lèi)推。BLOSUM與BLOCKS對(duì)于同樣的序列比對(duì)產(chǎn)生的結(jié)果在局部有所不同，可能是一個(gè)認(rèn)為不相似不可以替換而另一個(gè)認(rèn)為相似可以替換。必須說(shuō)明，如果比對(duì)這兩個(gè)序列高度相似，這些細(xì)微的差別對(duì)整個(gè)序列比對(duì)結(jié)果的影響不大，但在序列比對(duì)的邊界區(qū)可能產(chǎn)生顯著影響，此時(shí)增強(qiáng)微弱信號(hào)以探測(cè)遠(yuǎn)距離相關(guān)變得十分重要。數(shù)據(jù)庫(kù)的搜索簡(jiǎn)介數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)?yōu)樯飳W(xué)研究提供了一個(gè)重要工具，在實(shí)際工作中經(jīng)常使用。然而，在分子生物學(xué)研究中，對(duì)于新測(cè)定的堿基序列或由此翻譯得到的氨基酸序列，往往需要通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，找出具有一定相似性的同源序列，以推測(cè)該未知序列可能屬于哪個(gè)基因家族，具有哪些生物學(xué)功能。對(duì)于氨基酸序列來(lái)說(shuō)，有可能找到已知三維結(jié)構(gòu)的同源蛋白質(zhì)而推測(cè)其可能的空間結(jié)構(gòu)。因此，數(shù)據(jù)庫(kù)搜索與數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)一樣，是生物信息學(xué)研究中的一個(gè)重要工具。數(shù)據(jù)庫(kù)搜索的基礎(chǔ)是序列的相似性比對(duì)，即雙序列比對(duì)(pairwisealignment)。新測(cè)定的、希望通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索確定其性質(zhì)或功能的序列稱(chēng)作檢測(cè)序列(probesequence)；通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索得到的和檢測(cè)序列具有一定相似性的序列稱(chēng)目標(biāo)序列(subjectsequence)。為了確定檢測(cè)序列和一個(gè)已知基因家族之間的進(jìn)化關(guān)系，在通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索得到某些相似序列后，還需要判斷其序列相似性程度。如果檢測(cè)序列和目標(biāo)序列的相似性程度很低，還必須通過(guò)其它方法或?qū)嶒?yàn)手段才能確定其是否屬于同一基因家族比對(duì)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的評(píng)價(jià)--E值(E-Value)P值(P-Value)(概率值)BLAST程序中使用了E值而非P值，這主要是從直觀和便于理解的角度考慮。比如E值等于5和10，總比P值等于0.993和0.99995更直觀。但是當(dāng)E<0.01時(shí)，P值與E值接近相同參數(shù)K和λ可分別被簡(jiǎn)單地視為搜索步長(zhǎng)(searchspacesize)和計(jì)分系統(tǒng)(scoringsystem)的特征數(shù)BLAST和FASTA數(shù)據(jù)庫(kù)搜索策略

一種思路是把數(shù)據(jù)庫(kù)中的所有蛋白序列與待查序列的關(guān)系都視為相同重要，也就是說(shuō)對(duì)于E值均較低的短和長(zhǎng)序列，它們是等同重要的。FASTA程序近期版本便是采用這一策略

另一種思路是把長(zhǎng)序列視為比短序列更重要，因?yàn)殚L(zhǎng)序列往往包括更多的特異功能域(domain)。如果對(duì)序列長(zhǎng)度上進(jìn)行相關(guān)優(yōu)先處理，則在計(jì)算數(shù)據(jù)庫(kù)序列長(zhǎng)度為n的E值時(shí)，將乘以N/n，其中N為數(shù)據(jù)庫(kù)中序列的總長(zhǎng)度。E值的計(jì)算可簡(jiǎn)單地把整個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)序列視為長(zhǎng)度為N的單條序列。BLAST程序采用了這一策略

FASTA策略中E值的計(jì)算還需再乘上數(shù)據(jù)庫(kù)的序列條數(shù)。如果考慮到核酸數(shù)據(jù)庫(kù)的序列長(zhǎng)度變化更大，則在DNA序列相似性搜索時(shí)，BLAST的策略可能會(huì)是合理的選擇BLAST僅通過(guò)部分而不是全部無(wú)關(guān)序列計(jì)算最適聯(lián)配值，這贏得了搜索速度。因此，對(duì)于某一選定的替換矩陣和空位罰值，必須進(jìn)行K和λ參數(shù)的預(yù)先估計(jì)，估計(jì)中使用真實(shí)序列，而非通過(guò)隨機(jī)序列模型產(chǎn)生的模擬序列。這一估計(jì)的結(jié)果看來(lái)非常準(zhǔn)確。一些數(shù)據(jù)庫(kù)搜索程序，例如FASTA或其它基于Smith-Waterman算法的程序，在進(jìn)行序列搜索時(shí)，會(huì)對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)中的每條序列進(jìn)行聯(lián)配并給出聯(lián)配值，這些值大部分與未知序列無(wú)關(guān)，但它們被用于了K和λ參數(shù)的估計(jì)。這一方法避免了隨機(jī)序列模型因使用真實(shí)序列(realsequence)造成的隨意性，但同時(shí)產(chǎn)生了使用相關(guān)序列估計(jì)參數(shù)的難題表6數(shù)據(jù)庫(kù)相似性搜索程序BLAST和FASTA程序清單注：n：核酸序列或核酸序列庫(kù)；p：蛋白質(zhì)序列或蛋白質(zhì)序列庫(kù)搜索實(shí)例FastA和BLAST程序是目前最常用的基于局部相似性的數(shù)據(jù)庫(kù)搜索程序，它們都基于查找完全匹配的短小序列片段，并將它們延伸得到較長(zhǎng)的相似性匹配。它們的優(yōu)勢(shì)在于可以在普通的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)上運(yùn)行，而不必依賴(lài)計(jì)算機(jī)硬件系統(tǒng)而解決運(yùn)行速度問(wèn)題。BLAST是目前常用的數(shù)據(jù)庫(kù)搜索程序，它是BasicLocalAlignmentSearchTool的縮寫(xiě)，意為“基本局部相似性比對(duì)搜索工具”[Altschul,1990,1997]。國(guó)際著名生物信息中心都提供基于Web的BLAST服務(wù)器。BLAST程序之所以使用廣泛，主要因?yàn)槠溥\(yùn)行速度比FastA等其它數(shù)據(jù)庫(kù)搜索程序快，而改進(jìn)后的BLAST程序允許空位的插入。可以訪(fǎng)問(wèn)NCBI的網(wǎng)站在線(xiàn)進(jìn)行BLAST和FastA的搜索BLAST搜索BLAST算法本身很簡(jiǎn)單，它的基本要點(diǎn)是序列片段對(duì)（segmentpair）的概念。所謂序列片段對(duì)是指兩個(gè)給定序列中的一對(duì)子序列，它們的長(zhǎng)度相等，且可以形成無(wú)空位的完全匹配。BLAST算法首先找出代查序列和目標(biāo)序列間所有匹配程度超過(guò)一定閾值的序列片段對(duì)，然后對(duì)具有一定長(zhǎng)度的片段對(duì)根據(jù)給定的相似性閾值延伸，得到一定長(zhǎng)度的相似性片段，稱(chēng)高分值片段對(duì)（high-scoringpairs,HSPs）。這就是無(wú)空位的BLAST比對(duì)算法的基礎(chǔ)，也是BLAST輸出結(jié)果的特征。BLAST軟件包實(shí)際上是綜合在一起的一組程序，不僅可用于直接對(duì)蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)和核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索，而且可以將檢測(cè)序列翻譯成蛋白質(zhì)或?qū)?shù)據(jù)庫(kù)翻譯成蛋白質(zhì)后再進(jìn)行搜索，以提高搜索結(jié)果的靈敏度(表7)。表7BLAST程序檢測(cè)序列和數(shù)據(jù)庫(kù)類(lèi)型BLAST程序是免費(fèi)軟件，可以從美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心NCBI等文件下載服務(wù)器上獲得，安裝在本地計(jì)算機(jī)上，包括UNIX系統(tǒng)和WINDOWS系統(tǒng)的各種版本。但必須有BLAST格式的數(shù)據(jù)庫(kù)，可以從NCBI下載，也可以利用該系統(tǒng)提供的格式轉(zhuǎn)換工具由其它格式的核酸或蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)經(jīng)轉(zhuǎn)換后得到。對(duì)核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)而言，不論用哪種方式，都需要很大的磁盤(pán)空間；而程序運(yùn)行時(shí)，需要有較大的內(nèi)存和較快的運(yùn)算速度，因此必須使用高性能的服務(wù)器。對(duì)一般用戶(hù)來(lái)說(shuō)，目前常用的辦法是通過(guò)NCBI、EBI等國(guó)際著名生物信息中心的BLAST服務(wù)器進(jìn)行搜索。北京大學(xué)生物信息中心也提供了BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)搜索服務(wù)。需要說(shuō)明的是，各生物信息中心BLAST用戶(hù)界面有所不同，所提供的數(shù)據(jù)庫(kù)也可能不完全相同，使用前最好先進(jìn)行適當(dāng)?shù)倪x擇歐洲生物信息研究所BLAST服務(wù)器的用戶(hù)界面(圖4)比較簡(jiǎn)潔，提供的數(shù)據(jù)庫(kù)和參數(shù)很多，用戶(hù)可以根據(jù)不同要求，選擇不同的數(shù)據(jù)庫(kù)和各種參數(shù)。一般情況下，可以先按照系統(tǒng)給定的缺省參數(shù)進(jìn)行初步搜索，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析后再適當(dāng)調(diào)整參數(shù)，如改變相似性矩陣、增加或減少空位罰分值、調(diào)節(jié)檢測(cè)序列滑動(dòng)窗口大小等。對(duì)于核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)，一般選擇重復(fù)序列屏蔽功能，而對(duì)于蛋白質(zhì)序列，特別是球蛋白，通常不必選擇重復(fù)序列屏蔽功能。圖4歐洲生物信息學(xué)研究所的BLAST服務(wù)器的用戶(hù)界面圖5是BLAST程序運(yùn)行結(jié)果實(shí)例。這里，檢測(cè)序列是與細(xì)胞凋亡有關(guān)的人自噬基因氨基酸序列，通過(guò)歐洲生物信息學(xué)研究所的BLAST服務(wù)器對(duì)包括SwissProt和TrEMBL數(shù)據(jù)庫(kù)在內(nèi)的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索。輸出結(jié)果中包括程序名稱(chēng)、版本號(hào)以及文獻(xiàn)引用出處，以及檢索序列的名稱(chēng)、數(shù)據(jù)庫(kù)名稱(chēng)；列出相似性值較高的序列條目，以及它們?cè)跀?shù)據(jù)庫(kù)中的編號(hào)和簡(jiǎn)要說(shuō)明。每個(gè)條目后面給出相似性分?jǐn)?shù)值Score和期望頻率值E，以相似性分?jǐn)?shù)值大小為序排列，分?jǐn)?shù)越高，相似性越大。而E值則表示隨機(jī)匹配的可能性，E值越大，隨機(jī)匹配的可能性也越大。最后給出檢測(cè)序列和目標(biāo)序列的比對(duì)結(jié)果(限于篇幅，圖中只給出檢測(cè)序列和一個(gè)目標(biāo)序列的比對(duì)結(jié)果)。圖5BLAST程序運(yùn)行結(jié)果實(shí)例最初的BLAST程序只能用于無(wú)空位的比對(duì)。經(jīng)驗(yàn)表明比對(duì)結(jié)果通常會(huì)出現(xiàn)一些無(wú)空位但不連續(xù)的區(qū)域，不難想象，有些高分值片段對(duì)可以通過(guò)一些相似性較低且有空位的片段連接起來(lái)，組成了一些更長(zhǎng)的或許更具實(shí)際生物學(xué)意義的比對(duì)。基于上述思路，BLAST算法經(jīng)過(guò)改進(jìn)允許空位插入（Altshul等，1997）。為縮短對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)初始搜索的時(shí)間，新的算法只找出一個(gè)最好的高分值片段，并以此為基礎(chǔ)運(yùn)用動(dòng)態(tài)規(guī)劃方法將這一片段向兩端延伸，最終產(chǎn)生的比對(duì)結(jié)果可能有空位插入。由于免去了查找所有高分值片段對(duì)的步驟，新的算法比原算法快3倍。對(duì)BLAST算法的進(jìn)一步擴(kuò)充，可以考慮雙序列比對(duì)和多序列比對(duì)的有效結(jié)合允許空位的BLAST位點(diǎn)特異性BLAST疊代搜索位點(diǎn)特異性BLAST（Position-SpecificIteratedBLAST，簡(jiǎn)稱(chēng)PSI-BLAST）疊代搜索（Altschul等，1997），是一種將雙序列比對(duì)和多序列比對(duì)結(jié)合在一起的數(shù)據(jù)庫(kù)搜索方法。位置特異性疊代BLAST(Position-SpecificIteratedBLAST，簡(jiǎn)稱(chēng)PSI-BLAST)則是對(duì)蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索的改進(jìn)，其主要思想是通過(guò)多次疊代找出最佳結(jié)果。具體做法是利用第一次搜索結(jié)果構(gòu)建位置特異性分?jǐn)?shù)矩陣，并用于第二次的搜索，第二次搜索結(jié)果用于第三次搜索，依此類(lèi)推，直到找出最佳搜索結(jié)果。此外，BLAST不僅可用于檢測(cè)序列對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)的搜索，還可用于兩個(gè)序列之間的比對(duì)。盡管以下事實(shí)已經(jīng)基本得到認(rèn)同：基于序列模式的數(shù)據(jù)庫(kù)搜索靈敏度較高、特異性較好，因而可以發(fā)現(xiàn)一些距離較遠(yuǎn)但卻具有生物學(xué)意義的相似序列；它的不足之處也不能予以忽視。除了需要大量的計(jì)算資源這一缺點(diǎn)外，對(duì)于搜索結(jié)果的分析解釋常常相當(dāng)困難。這些制約因素限制了它的實(shí)際使用范圍。PSI-BLAST的基本思路在于根據(jù)最初的搜索結(jié)果，依照預(yù)先定義的相似性閾值將序列分成不同的組，構(gòu)建一個(gè)位點(diǎn)特異性的序列譜，并通過(guò)多次疊代不斷改進(jìn)這一序列譜以提高搜索的靈敏度。和其它疊代算法一樣，PSI-BLAS方法既有不少長(zhǎng)處，也有它的弊病。例如，如果在比對(duì)前不把膠原蛋白、同源多聚體等低復(fù)雜度的重復(fù)序列屏蔽掉，自動(dòng)疊代搜索過(guò)程會(huì)因?yàn)檫@些重復(fù)序列的干擾而失敗（Holm，1998）。假如第一輪的搜索結(jié)果出現(xiàn)一個(gè)錯(cuò)誤序列，那么最終搜索結(jié)果中將會(huì)出現(xiàn)許多不期望的無(wú)關(guān)序列。因此，為了盡量去除大量的錯(cuò)誤匹配，仔細(xì)分析搜索結(jié)果給出的同源關(guān)系變得非常重要。BLAST算法算法：做任何事情都有一定的步驟。為解決一個(gè)問(wèn)題而采取的方法和步驟，就稱(chēng)為算法。BLAST算法：快速高效的保證。將查詢(xún)序列分為多個(gè)短片段及相似片段；篩選數(shù)據(jù)庫(kù)以發(fā)現(xiàn)具備以上片段的序列；將匹配序列進(jìn)行延伸，插入和延伸gap，根據(jù)突變矩陣（BLOSUM62）計(jì)分排序；返回分值最高的匹配序列NCBIBLAST結(jié)果的評(píng)價(jià)比對(duì)好壞的評(píng)價(jià)：Bit分值考慮了比對(duì)中相同和相似基團(tuán)、gap、替代矩陣，并經(jīng)過(guò)標(biāo)化；Bit分值越高,比對(duì)越好比對(duì)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的評(píng)價(jià)：E值（E-value）E值越低,則比對(duì)就更有可能具有顯著性其他：比對(duì)的長(zhǎng)度也是一個(gè)關(guān)鍵因素解讀BLAST的結(jié)果header。給出查詢(xún)序列的信息和查詢(xún)的數(shù)據(jù)庫(kù)名稱(chēng)。每一條匹配序列的描述。包括圖形化方式和在線(xiàn)的文字描述。每個(gè)匹配序列與查詢(xún)序列的比對(duì)情況。BLAST程序的選擇蛋白：BLASTP－tBLASTN核酸：blastn-blastx-tblastx數(shù)據(jù)庫(kù)的選擇：nr最為常用；month跟蹤每個(gè)月新增數(shù)據(jù)；swissprot蛋白庫(kù)注釋詳盡比對(duì)結(jié)果是否有意義的判定統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性一致性：蛋白序列>25%，核酸序列>70%（參考）長(zhǎng)度FastA搜索FastA算法是由Lipman和Pearson于1985年發(fā)表的（Lipman和Pearson，1985）。FastA的基本思路是識(shí)別與代查序列相匹配的很短的序列片段，稱(chēng)為k-tuple。蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)搜索時(shí)，短片段的長(zhǎng)度一般是1-2個(gè)殘基長(zhǎng)；DNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)搜索時(shí)，通常采用稍大點(diǎn)的值，最多為6個(gè)堿基。通過(guò)比較兩個(gè)序列中的短片段及其相對(duì)位置，可以構(gòu)成一個(gè)動(dòng)態(tài)規(guī)劃矩陣的對(duì)角線(xiàn)方向上的一些匹配片段。FastA程序采用漸進(jìn)（heuristicapproach）算法將位于同一對(duì)角線(xiàn)上相互接近的短片段連