手性藥物的生物合成2課件

手性藥物的生物合成手性分離技術(shù)手性分離和分析的重要性★

獲取單一對(duì)映體化合物

★對(duì)于涉及分子手性分析的領(lǐng)域要采用高對(duì)映體選擇性的分析方法手性分離的特殊性

在非手性環(huán)境中，對(duì)映體的物理化學(xué)性質(zhì)（如熔點(diǎn)、沸點(diǎn)、折射率、蒸氣壓、溶解度、紅外、核磁譜和質(zhì)譜等）大都相同，這就造成對(duì)映體分離的困難。1獲得單一對(duì)映體的途徑手性源(chiralpool)合成前手性底物不對(duì)稱(chēng)合成外消旋體拆分防止“外消旋化”“立體選擇性”反應(yīng)，如手性催化、手性誘導(dǎo)、生物催化結(jié)晶法衍生法酶法色譜法2

外消旋體拆分方法

等量對(duì)映體的混合物，其旋光性相互抵消，沒(méi)有旋光能力，稱(chēng)為外消旋體。將外消旋體分為對(duì)映體的過(guò)程，叫做對(duì)映體拆分（resolution）。廣義地講，對(duì)不等量對(duì)映體混合物進(jìn)行分離，也屬于對(duì)映體拆分的范疇。2.1結(jié)晶拆分法

▲Pasteur分離酒石酸對(duì)映體1849年，Pasteur首次分離酒石酸對(duì)映體，就是利用外消旋的酒石酸銨鈉在27℃以下結(jié)晶時(shí)，形成的晶體是“外消旋混合物”，兩個(gè)對(duì)映體的半面晶外觀不一樣。Pasteur借助放大鏡，用鑷子將兩種酒石酸銨鈉晶體分開(kāi)。這就是歷史上有名的第一個(gè)對(duì)映體拆分實(shí)驗(yàn)。

圖3酒石酸銨鈉晶體外型這一方法雖然古老，但在一些特定的場(chǎng)合還有用處，如“手性金屬配合物”。接種晶體拆分法

在一個(gè)外消旋混合物的熱飽和溶液中加入其中的一個(gè)純對(duì)映體的晶種，然后冷卻，則同種的對(duì)映體將附在晶體上析出；濾去晶體后，母液重新加熱，并補(bǔ)加外消旋體使之達(dá)到飽和，冷卻使另一對(duì)映體析出。這樣交替進(jìn)行，可方便地獲得大量純對(duì)映體結(jié)晶。在沒(méi)有純對(duì)映體晶種的情況下，有時(shí)用結(jié)構(gòu)相似的其它手性化合物（有時(shí)甚至非手性化合物）作晶種，也能獲得成功。（為什么？）晶體形成時(shí)的有規(guī)律的定向排列，可能自然形成一手性環(huán)境。2.2生物拆分法

生物酶、微生物、細(xì)菌等生物源具有非常專(zhuān)一的反應(yīng)特性。利用酶可以選擇性地使外消旋體中的一個(gè)對(duì)映體發(fā)生反應(yīng)，如降解，從而達(dá)到拆分的目的。因此，這一方法也稱(chēng)為“生物化學(xué)拆分法”。1858年，Pasteur就觀察到：外消旋酒石酸在酵母或青霉的存在下進(jìn)行發(fā)酵，天然的（+）-酒石酸銨逐漸被消耗，而經(jīng)過(guò)一段時(shí)間之后，從發(fā)酵液中分離出純的（-）-酒石酸銨。這是微生物代謝了天然的（+）-酒石酸，而留下了（-）-酒石酸。圖5D,L－苯基甘氨酸外消旋體的酶拆分

生物拆分特點(diǎn)：立體專(zhuān)一性強(qiáng)、拆分效率高和生產(chǎn)條件溫和。目前，酶法拆分已從水溶液向有機(jī)介質(zhì)發(fā)展。D,L-苯基甘氨酸(PG)(CH3C)2-OOD,L-乙酰PGL-氨肽酶L-PGD-乙酰PG水解/H+D-PGD,L-PGH2SO4/加熱(外消旋化)

用微生物酶拆分外消旋體，比化學(xué)拆分法具有明顯的優(yōu)越性：（1）酶催化反應(yīng)通常具有高度立體專(zhuān)一性；（2）副反應(yīng)少，產(chǎn)率高，產(chǎn)品分離提純簡(jiǎn)單；（3）反應(yīng)條件較溫和，如0~50℃，pH接近中性；（4）酶無(wú)毒，易降解，不會(huì)造成環(huán)境污染，適于規(guī)模生產(chǎn)。用酶拆分外消旋體氨基酸特別重要。因?yàn)槎鄶?shù)合成氨基酸消旋體不易用化學(xué)方法拆分，而酶法拆分卻非常有效，可用于制備旋光性氨基酸?；瘜W(xué)拆分法原理

如果外消旋體的分子含有某些活性基團(tuán)，如羧基、氨基、羥基和雙鍵等，可讓其與某種旋光活性的化合物（稱(chēng)為拆分劑）進(jìn)行反應(yīng)，生成兩種非對(duì)映體。利用非對(duì)映體在分離性質(zhì)上的差別可將其分開(kāi)。換句話說(shuō)，化學(xué)拆分的原理是將具有相同性質(zhì)的對(duì)映體轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂胁煌再|(zhì)的非對(duì)映體來(lái)進(jìn)行分離。拆分過(guò)程一般包括如下三個(gè)步驟：

(+)-酸(-)-酸+(-)-堿(+)-酸·(-)-堿(-)-酸·(-)-堿(+)-酸·(-)-堿(-)-酸·(-)-堿(-)-堿(-)-酸手性試劑衍生分離非對(duì)映體分解或還原單個(gè)對(duì)映體

化學(xué)拆分的關(guān)鍵是選擇合適的拆分劑和拆分溶劑◆拆分劑（1）容易與外消旋體中的兩個(gè)對(duì)映體結(jié)合生成非對(duì)映異構(gòu)體。拆分后，又容易再生出原來(lái)的對(duì)映體。如酸堿反應(yīng)。（2）所形成的非對(duì)映異構(gòu)體溶解度有較大的差別，其中之一容易結(jié)晶。（3）拆分劑應(yīng)達(dá)到旋光純。從原理上，拆分后對(duì)映體純度不會(huì)超過(guò)拆分劑純度。假定拆分劑(-)-B堿的旋光純度為90%（即含有10%的(+)-B），被用來(lái)拆分(±)-A酸，那么所形成的鹽中將有10%的含量。(+)-A酸·(-)-B堿(-)-A酸·(+)-B堿(-)-A酸·(-)-B堿(+)-A酸·(+)-B堿和10%新對(duì)映體（4）拆分劑應(yīng)廉價(jià)易得，或可方便回收

一些常見(jiàn)的手性拆分劑：

堿性拆分劑：（-）-馬錢(qián)子堿、（-）-番木鱉堿、D-（-）-麻黃堿等；

“管制藥品！”

酸性拆分劑：（+）-酒石酸、（+）-樟腦酸、（+）-樟腦酸-10-磺酸、L-（+）-谷氨酸等。

醇類(lèi)化合物可以用異腈酸酯轉(zhuǎn)變?yōu)榉菍?duì)映異構(gòu)的氨基甲酸酯，也可以用手性酰氯（或酸酐）轉(zhuǎn)變成酯拆分。

醛、酮?jiǎng)t常用氨或胺的衍生物轉(zhuǎn)變?yōu)殡辍⒖s氨脲、肼亞胺等非對(duì)映體拆分。2.4色譜拆分法

如何獲得高對(duì)映體純的手性物質(zhì)在許多領(lǐng)域都是很重要的。色譜法不僅是對(duì)映體分析和純度測(cè)定的有力工具，而且液相色譜拆分法還是制備和純化的重要手段。歷史上，曾采用一些天然手性吸附劑，如淀粉、蔗糖、羊毛等成功拆分一些外消旋體。現(xiàn)代制備色譜在拆分外消旋體方面更是發(fā)揮更大的作用。如選用拆分能力很強(qiáng)的手性固定相填充劑，用大柱子，一次已能拆分幾十克量的外消旋體，并達(dá)到99%的旋光純度。

3、高效手性分離技術(shù)

色譜法和電泳法是一類(lèi)高效分離方法，但常規(guī)的色譜/電泳方法仍不能直接分離對(duì)映體。（為什么？）

因?yàn)樵诜鞘中原h(huán)境中，對(duì)映體的分離性質(zhì)（如沸點(diǎn)、蒸氣壓、溶解度、分配系數(shù)、吸附特性以及淌度）完全相同。

如何運(yùn)用高效色譜和毛細(xì)管電泳分離分析對(duì)映體化合物？——熱力學(xué)/分離性質(zhì)上的差異3.1

手性分離基本策略

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手性消除采用手性試劑衍生對(duì)映體，使之轉(zhuǎn)化為非對(duì)映體，利用非對(duì)映體間的性質(zhì)差異采用常規(guī)分離方法分離。

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構(gòu)建手性分離環(huán)境將手性分離介質(zhì)引入分離器中構(gòu)建手性分離環(huán)境，使得原本沒(méi)有分離性質(zhì)差異的對(duì)映體產(chǎn)生分離差異。

這些策略也是其他分析技術(shù)如波譜法研究手性識(shí)別的思路。

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結(jié)合高效分離技術(shù)

衍生后兩種非對(duì)映體的檢測(cè)器響應(yīng)可能不同，不宜按歸一化計(jì)算對(duì)映體純度。

手性試劑衍生位置應(yīng)靠近對(duì)映體樣品的手性中心，以求獲得最大的分離效果。過(guò)大的衍生試劑可能會(huì)縮小樣品理化性質(zhì)的差異，造成分離困難。作制備用的手性衍生劑要求它的衍生化和去衍生化反應(yīng)都容易進(jìn)行，且總收率要高，生成的非對(duì)映體具有更大的分離性（有利于提高制備量）。2)

手性色譜

手性色譜的原理是通過(guò)待拆分對(duì)映體與手性固定相之間的瞬間可逆相互作用，根據(jù)形成瞬間締合物的難易程度和穩(wěn)定程度，經(jīng)過(guò)多次質(zhì)量交換后，達(dá)到對(duì)映體間的分離。

近年來(lái)，高效手性分離技術(shù)的發(fā)展，導(dǎo)致與有機(jī)立體化學(xué)相關(guān)的手性藥物學(xué)、分子生物學(xué)、材料化學(xué)、地球化學(xué)、天然有機(jī)化學(xué)等前沿領(lǐng)域取得許多突破性的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展。衍生法：非對(duì)映體的形成是“固定的、永久的”如果設(shè)法把手性試劑引入固定相，外消旋體樣品流過(guò)柱子是否會(huì)形成非對(duì)映體？

與手性衍生法色譜分析不同，對(duì)映體組成的測(cè)定精度與手性固定相所用的對(duì)映體純度無(wú)關(guān)（固定相的對(duì)映體純度只影響拆分因子α的大小）。手性色譜可以通過(guò)兩種方式進(jìn)行：手性固定相法手性添加劑法手性拆分原理包括主-客體作用、絡(luò)合作用、配體交換、相分離、離子交換等。核心是分子手性識(shí)別作用，即對(duì)映體與固定相（或添加劑）間的相互作用涉及到分子立體選擇性。

手性固定相具有很強(qiáng)的特征性，一個(gè)固定相往往只能拆分一類(lèi)或幾類(lèi)對(duì)映體。手性色譜的另一個(gè)特點(diǎn)是將Pirkle型手性固定相的手性變成相反構(gòu)型，可使對(duì)映體洗脫順序顛倒過(guò)來(lái)。研制新的手性固定相，解決不同類(lèi)型手性化合物的分離是手性色譜發(fā)展的前沿領(lǐng)域。過(guò)去100年：拆分約7000種手性化合物手性色譜：已拆分近萬(wàn)種手性化合物液相色譜中的手性固定相已研制100多種手性添加劑法

在液相色譜流動(dòng)相或毛細(xì)管電泳的緩沖溶液中加入手性添加劑（CA），CA與對(duì)映體溶質(zhì)通過(guò)靜電引力和氫鍵等非共價(jià)鍵結(jié)合方式，形成可逆的不同穩(wěn)定性的非對(duì)映體配合物，在非手性分離器中實(shí)現(xiàn)對(duì)映異構(gòu)體的分離。手性添加劑是一種直接拆分法，其優(yōu)點(diǎn)在于不需要化學(xué)衍生，也不需要特殊的手性固定相。CA必須能提供有效的基團(tuán)和位置以便與溶質(zhì)對(duì)映體形成非對(duì)映的配合物，也必須具有合適的結(jié)構(gòu)以改善分離性能和提高其立體選擇性。常見(jiàn)的CA可分為手性對(duì)離子添加劑、手性配位添加劑和環(huán)糊精添加劑。環(huán)糊精結(jié)構(gòu)OHOHHO甲基化3.3

手性色譜技術(shù)★氣相色譜★高效液相色譜★毛細(xì)管電泳★超臨界色譜3.3.1氣相色譜

GC具有快速、靈敏、簡(jiǎn)便和定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。手性GC特別適合于不對(duì)稱(chēng)合成的樣品分析。因?yàn)榉治鰳悠芬话銦o(wú)需衍生，反應(yīng)產(chǎn)物可直接進(jìn)樣分析，用量極微（10-8g），特別適合于跟蹤不對(duì)稱(chēng)反應(yīng)的全過(guò)程。對(duì)于那些對(duì)映體純度>95%的產(chǎn)物，一般要用GC或HPLC代替旋光測(cè)定。

氣相色譜手性固定相主要分為：●

氫鍵型手性固定相：如某些氨基酸衍生物固定相，主要用于分離氨基酸、羧酸、醇、胺、內(nèi)酯、內(nèi)酰胺等對(duì)映體化合物，氫鍵作用是對(duì)映體分離的主要作用力●

形成包合物的手性固定相：環(huán)糊精衍生物手性固定相用于分離稠環(huán)烷烴、沒(méi)有取代的烯烴、鹵代烴、醇、醛、酮、胺、氰類(lèi)、環(huán)氧化合物、羧酸、鹵代酸、羥基酸、內(nèi)酯和氨基酸等化合物的對(duì)映體?！?/p>

金屬配體交換手性固定相：一些金屬離子(Eu、Rh、Ni、Mn、Cu等)與手性試劑(如樟腦酸衍生物，水楊酸與手性胺形成的西佛堿等)所形成的配位化合物。將這類(lèi)固定相與某些色譜固定液（如鯊魚(yú)烷）混合，涂到毛細(xì)管柱上分離烯烴、環(huán)酮、醇、胺、環(huán)氧化合物、氨基醇、氨基酸、羥基酸和鹵代酸等化合物的對(duì)映體●

手性聚硅氧烷固定相及交聯(lián)手性固定相：以聚硅氧烷為基質(zhì)，鍵合一定濃度的手性固定相的新型色譜固定相。這一類(lèi)固定相改善了手性固定相的耐溫性，擴(kuò)大其使用溫度范圍，增進(jìn)涂漬性能。交聯(lián)手性固定相專(zhuān)指將手性固定相與毛細(xì)管壁交聯(lián)而成色譜柱。交聯(lián)毛細(xì)管柱一般具有耐溶劑沖洗、耐高溫、壽命長(zhǎng)、柱效高等特點(diǎn)，并在超臨界流體色譜條件下使用。3.3.2高效液相色譜

手性固定相分類(lèi)：

●選擇基鍵合相（Pirkle手性固定相）●纖維素和多糖衍生物●環(huán)糊精●蛋白質(zhì)鍵合相●合成聚合物與分子烙印手性固定相拆分機(jī)理：氫鍵、π-π鍵、偶極-偶極、包合絡(luò)合物、配位交換、疏水和極性相互作用的偶合。選擇基鍵合相（Pirkle手性固定相）

美國(guó)Illinois大學(xué)的WHPirkle研究組研制，因此又稱(chēng)Pirkle型或多種作用（multiple-interaction）手性固定相，其商品以Brush-Type（刷性）著稱(chēng)。在手性液相色譜領(lǐng)域，Pirkle型CSP是目前使用量大、適用面廣、對(duì)手性識(shí)別機(jī)理揭示較深刻的一類(lèi)重要CSP。它們具有確定化學(xué)結(jié)構(gòu)，其共同結(jié)構(gòu)特征是在手性中心附近至少含有下列基團(tuán)之一：（1）π-酸或π-堿芳基，具有給體-受體相互作用能力（電子轉(zhuǎn)移絡(luò)合）。（2）極性氫鍵給體/受體。（3）

形成偶極相互作用的極性基團(tuán)。（4）大體積非極性基團(tuán)，提供立體位阻、范德華作用或構(gòu)型控制作用。

Pirkle型手性柱分為酰胺型和脲型CSP兩種結(jié)構(gòu)。它一般用于正相色譜體系，以含一定量異丙醇（0.2~20%）的正己烷為流動(dòng)相，有時(shí)也采用四氫呋喃和其它氫鍵受體溶劑。它也用于反相體系分離強(qiáng)極性溶質(zhì)。Pirkle型CSP的優(yōu)點(diǎn)是柱效和柱容量高，不僅用于對(duì)映體分析，也可用于對(duì)映體制備分離?；谑中宰R(shí)別機(jī)理，可預(yù)測(cè)對(duì)映體洗脫順序，確定其構(gòu)型。其不足是被分離的溶質(zhì)大部分需衍生以引入芳基等手性識(shí)別所需基團(tuán)；多使用非極性溶劑作流動(dòng)相，溶解度可能限制對(duì)某些溶質(zhì)的應(yīng)用。纖維素和多糖衍生物

纖維素是D（+）-葡萄糖單元由1，4-糖苷鍵形成的高度有序、呈螺旋型孔穴結(jié)構(gòu)的光學(xué)活性高分子。但天然的纖維素手性拆分能力不高，色譜性能也不好，難于直接由于對(duì)映體拆分。引入新基團(tuán)

對(duì)纖維素和多糖等天然手性高分子進(jìn)行衍生改性，可制備性能優(yōu)良的手性固定相。

三種形式：凝膠顆粒；鍵合固定相和硅膠涂漬。

在目前在手性液相色譜中，纖維素及其衍生物大多涂漬在硅膠上使用。日本Diacel公司大量提供這類(lèi)商品手性色譜柱。

研究表明，纖維素類(lèi)CSP手性識(shí)別取決于聚合物螺旋型孔穴的“立體配合”（stericfit）包結(jié)作用，CSP的通道對(duì)芳環(huán)有較高的親和力，進(jìn)入孔穴的正是溶質(zhì)分子的芳環(huán)部分。氫鍵、偶極作用對(duì)手性識(shí)別亦有一定影響。大部分可拆分的對(duì)映體至少含有一個(gè)芳環(huán)或可形成氫鍵的羰基。纖維素CSP用水或非水溶性溶劑作流動(dòng)相，除少數(shù)例外，適用的有機(jī)溶劑限于正己烷、異丙醇、甲醇、乙醇。流動(dòng)相影響對(duì)映體分離的選擇性，非極性溶劑通常比甲醇/水混合液顯示出更高的分離選擇性。這類(lèi)CSP具有應(yīng)用范圍廣，樣品容量高的優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)是柱效低，有些溶質(zhì)顯示不可逆吸附，且多為涂漬柱，較易流失，對(duì)所用溶劑有一定限制。高效液相色譜拆分外消旋1-苯基乙醇類(lèi)化合物

三苯甲酸酯纖維素手性色譜柱（CHIRACELOB，I.D.4.6×250mm）拆分1-苯基乙醇、1-苯基丙醇、2-氯-1-苯基乙醇和2-溴-1-苯基乙醇外消旋化合物，可用于監(jiān)測(cè)不對(duì)稱(chēng)催化氫化反應(yīng)過(guò)程和測(cè)定產(chǎn)物對(duì)映體過(guò)剩值。(S)-(-)苯乙醇

(R)-(+)苯乙醇

R：H，Cl，Br，CH3合成聚合物與分子烙印手性固定相

合成手性聚合物CSP的制備主要通過(guò)三種途徑：（1）在手性條件下不對(duì)稱(chēng)聚合；（2）采用手性單體；（3）手性分子烙印技術(shù)。分子烙印(imprinting)手性固定相是在聚合過(guò)程中加入一個(gè)適當(dāng)?shù)哪０?template)分子，然后從聚合物中除去模板分子，流下一個(gè)“形狀選擇性”(shapeselectivity)孔穴，形成適合于孔穴立體選擇的聚合物。3.3.3毛細(xì)管電泳

毛細(xì)管電泳(CE)是20世紀(jì)90年代在手性分離方面得到廣泛應(yīng)用和高度重視的一項(xiàng)高效能分離技術(shù)。毛細(xì)管電泳分離對(duì)映體的優(yōu)點(diǎn)：★高分離效率有利于難分離對(duì)映體拆分★手性選擇劑的消耗量小，運(yùn)行成本低分離過(guò)程中的最優(yōu)化策略

——毛細(xì)管電泳分離對(duì)映體（例）

在分離科學(xué)中，最優(yōu)化指的是在最短的時(shí)間內(nèi)，用最低的消耗獲得最佳的分離效果。整體的最優(yōu)化目標(biāo)包括：分離方法的選擇，實(shí)驗(yàn)方法的選擇，實(shí)驗(yàn)中各個(gè)單元操作的優(yōu)化，以及各個(gè)單元間的最佳組合等。

對(duì)于一種分離方法，提高分離度的有效措施是：盡可能增大外加場(chǎng)；盡可能減少分離過(guò)程中欲分離物質(zhì)熵的增大；盡可能加大難分離物質(zhì)對(duì)之間的差異；對(duì)上面三點(diǎn)所產(chǎn)生的協(xié)同作用的優(yōu)化。

以毛細(xì)管電泳分離對(duì)映體為例說(shuō)明如何提高物質(zhì)的分離