實(shí)驗(yàn)堿性磷酸酶米氏常數(shù)的測(cè)定課件

實(shí)驗(yàn)五堿性磷酸酶米氏常數(shù)的測(cè)定

一、目的要求1.學(xué)習(xí)分光光度法測(cè)定的原理和方法2.學(xué)習(xí)和掌握米氏常數(shù)（Km）及最大反應(yīng)速度（Vm）的測(cè)定原理和方法，測(cè)出堿性磷酸酶在以對(duì)硝基苯酚磷酸為底物時(shí)的Km和Vm值。二、原理一、分光光度法的基本原理及方法（一）利用吸收光譜對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性分析1．原理（3）比較吸光度的比值

純DNA（二）利用吸收光譜對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定量分析 1．原理 Beer-Lambert（比爾）定律： T=I/I0A=lg1/T=lgI0/I

A=KCL其中：T為透光率；A為吸光率；I0為入射光強(qiáng)度；I為透射光強(qiáng)度；K為吸收系數(shù)；C為溶液濃度；L為溶液光程的厚度2．常用方法 （1）標(biāo)準(zhǔn)曲線法

OD或Ａ

濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線與樣品的測(cè)定條件必須一致。(三)米氏常數(shù)的測(cè)定原理酶促反應(yīng)v-[S]曲線

v

[S]推導(dǎo)出米氏方程為：其中[S]為底物濃度；v為初速度；Vm為最大反應(yīng)速度；Km為米氏常數(shù)

米氏常數(shù)Km是酶的一個(gè)基本特征常數(shù)，它包含著酶與底物結(jié)合和解離的性質(zhì)。特別是同一種酶能夠作用于幾種不同底物時(shí)，米氏常數(shù)Km往往可以反映出酶與各種底物的親和力的強(qiáng)弱。

測(cè)定Km和Vm，可通過(guò)作圖法求得。最常用的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法。這個(gè)方法是將米氏方程轉(zhuǎn)化為倒數(shù)形式，即：以1/v對(duì)1/[S]作圖，可得一條直線1/v1/Vm

-1/Km1/[S]本實(shí)驗(yàn)測(cè)定堿性磷酸酶催化對(duì)硝基苯磷酸鈉鹽(pNPP)水解的Km和Vm.反應(yīng)式：pNPP+H2OpNP+HPO42-

無(wú)色黃色

可通過(guò)分光光度法測(cè)定產(chǎn)物pNP的含量，求出反應(yīng)速度v。

四、分光光度計(jì)的使用

1．722型分光光度計(jì)的外形2.儀器操作鍵介紹“方式設(shè)定”鍵（MODE）：用于設(shè)置測(cè)試方式“100%T/0ABS”鍵：用于自動(dòng)調(diào)整100.0%T(100.0透射比)或0ABS(零吸光度)“0%T”鍵：用于自動(dòng)調(diào)整零透射比“波長(zhǎng)設(shè)置”旋鈕：用于設(shè)置分析波長(zhǎng)返回返回返回(二）測(cè)定15支試管，1-5做兩組平行測(cè)定管，01-05作為空白對(duì)照。No.12345底物終濃度[S](mM)0.50.751.01.5

310mmol/LpNPP（mL）0.10.150.20.30.6蒸餾水（mL）0.50.450.40.30碳酸鹽緩沖液（mL）各加1.0mL20mmol/LMgCl2（mL）各加0.2mL預(yù)熱混勻，37℃，5分鐘酶液（mL）測(cè)定管各加0.2mL酶液反應(yīng)時(shí)間37℃，精確反應(yīng)10分鐘0.1mol/LNaOH（mL）各加2mL酶液（mL）空白管各補(bǔ)加0.2mL酶液OD405（三）數(shù)據(jù)處理各管在722分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)405nm的OD值(OD405nm)。從對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出OD405nm相當(dāng)于產(chǎn)物對(duì)硝基苯酚的含量(mol數(shù)),計(jì)算出各種底物濃度下的初速度vo（單位以molL-1min-1表示），取倒數(shù)1/v填入表內(nèi)。以1/v對(duì)1/[S]作圖，求出酶催化pNPP水解的米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速度Vm。六、注意事項(xiàng)取液量一定要準(zhǔn)確。反應(yīng)時(shí)間一定要精確。加酶前后一定要將試劑混勻?？瞻讓?duì)照一定要先加NaOH，后加酶。測(cè)定OD405時(shí)要以各自的空白調(diào)零點(diǎn)。移液管或取液器的使用比色杯的使用管號(hào)11'22'33'44'55'

加酶時(shí)間（min）0.511.522.533.544.55加NaOH時(shí)間10.51111.51212.51313.