綠色銀光蛋白課件

“綠色熒光蛋白”讓未知世界顯影Osamu

Shimomura

Martin

Chalfie

Roger

Y.

Tsien

（錢永?。?008年10月8日，美Woods

Hole海洋生物學實驗室的下村修、哥倫比亞大學的馬丁-沙爾菲和加州大學圣地亞哥分校的錢永健三位美國科學家，因為在水母中發(fā)現(xiàn)和研究綠色熒光蛋白而獲得2008年諾貝爾化學獎。

GFP發(fā)現(xiàn)之旅；1962年，下村修首次從維多利亞多管水母Aequorea

victoria中分離出GFP。他發(fā)現(xiàn)該蛋白在紫外線下會發(fā)出明亮的綠光。

1992年，道格拉斯·普瑞舍克隆并測定了水母中綠色熒光蛋白的基因。1993年，Martin

Chalfie證明了GFP作為多種生物學現(xiàn)象的發(fā)光遺傳標記的價值。在最初的一項實驗中，他用GFP使秀麗隱桿線蟲的6個單獨細胞有了顏色。

1994年，錢永健開始改造熒光蛋白，培育出黃色、藍色、綠色、紅色等多種顏色的熒光蛋白，理解了GFP發(fā)出熒光的機制。世界上目前使用的熒光蛋白大多是錢永健實驗室改造后的變種。令在同一時間跟蹤多個不同的生物學過程成為現(xiàn)實。錢永健還開發(fā)了檢測熒光蛋白的熒光探針技術。GFP簡介維多利亞多管水母生活在北太平洋寒冷水域。這種水母體內含有一種生物發(fā)光蛋白質——aequorin，它本身發(fā)藍光。GFP能把這種光轉變成綠色，也就是當水母容光煥發(fā)的時候我們實際看到的顏色。GFP的純溶液在典型的室光下呈黃色，但是當被拿到戶外的陽光下時，它會發(fā)出鮮綠的顏色。這種蛋白質從陽光中吸收紫外光，然后以能量較低的綠光形式發(fā)射出來。GFP結構蛋白序列SKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFYLQCFARYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSQNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSYQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGIGFP由238個氨基酸殘基組成，分子量約為26.9kDa。GFP結構GFP結構GFP結構GFP結構GFP晶體結構顯示,蛋白質中央是一個圓柱形水桶樣結構,長420nm,寬240nm,由11個β片層組成桶狀構成疏水中心和由4個α螺旋以及其中一個α螺旋包含著的發(fā)光基團構成。

GFP結構GFP結構桶的頂部由3個短的垂直片段覆蓋,底部由一個短的垂直片段覆蓋,對熒光活性很重要的生色團則位于大空腔內。嚴密的桶形結構保護著熒光基團，防止它被周圍環(huán)境淬滅。實驗表明GFP熒光產(chǎn)生的前提是桶狀結構完整性,去除N端6個氨基酸或C端9個氨基酸,GFP均會失去熒光。這是由于生色團形成的效率較低,而且形成過程受外界環(huán)境影響較大的緣故GFP獨特的結構由238個氨基酸組成“像一個罐頭”每個單體由11個反向平行的-sheets圍繞，4個-helix組成，其中一個-helix位于“罐頭”內大約長420nm,寬240nm熒光基團位于核心的-helixGFP結構由α螺旋含有發(fā)光基團由第65、66、67位絲氨酸、酪氨酸、甘氨酸形成生色團構成。翻譯出的蛋白質折疊環(huán)化之后,在O2存在下,分子內第67位甘氨酸的酰胺對第65位絲氨酸的羧基的親核攻擊形成第5位碳原子咪唑基,第66位酪氨酸的α2β鍵脫氫反應之后,導致芳香團與咪唑基結合。這樣,GFP分子中形成對羥基苯甲酸咪唑環(huán)酮生色團,該過程可以自動催化完成。1.兩個野生型GFP吸收紫外光和藍光，發(fā)射綠光，在395nm出現(xiàn)一個最大吸收峰,在470nm出現(xiàn)一個小的吸收。出現(xiàn)兩個吸收峰的原因可能是由于存在陰性和中性兩個不同化學結構的生色團。由于存在兩個吸收峰,野生型GFP可以被標準的長波紫外源和異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)所激發(fā)。GFP性質2.能夠在單獨或者與其它蛋白融合時產(chǎn)生熒光。而其最顯著的特點是除了氧氣之外，不需要其他輔酶，不需底物。3.Baird等研究人員發(fā)現(xiàn)，雖然GFP有緊密的桶狀結構和形成發(fā)光基團所必需的復雜的翻譯后修飾，當對GFP的N端和C端部分交換重排并以一段間隔重新連接時，GFP仍然具有熒光。并且，GFP的某些位點可以耐受整段蛋白的插入，在結合金屬離子的黃色熒光蛋白（YellowFluorescentProtein,YFP，GFP的突變體）中145位插入鋅指結構能使熒光強度多倍提高。4.GFP作為報告分子具有很多優(yōu)點，如實現(xiàn)了活細胞內基因表達和定位、熒光為蛋白的內在屬性、熒光發(fā)射無種屬依賴性、熒光信號對光漂白具有高抗性、檢測時不需要附加輔助因子、在細菌和真核細胞中表達無明顯毒性、具有高度穩(wěn)定性。另外，細胞內GFP的檢測也比較簡單，如利用紫外燈、熒光顯微鏡、熒光激活細胞分選儀等，現(xiàn)有報道利用實時定量PCR進行GFP熒光定量測定的方法。熒光互補不僅僅在蛋白質相互作用中有所應用，Jeong等研究人員以與底物結合時會有典型的構象變化麥芽糖結合蛋白（MBP）為模型，將MBPC端和N端分別與GFP片斷融合。結果證明加入底物的一組顯示出比對照組更強的熒光，由此提出split-GFP在觀察蛋白構型變化中的應用。另外，一種重要的熒光成像技術—熒光共振能量轉移（fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET）也被廣泛應用。它能夠利用GFP及其突變體青色熒光蛋白（CFP）、黃色熒光蛋白（YFP）等，定時、定量、定位、無損傷地在活細胞內檢測大分子構象變化、蛋白之間相互作用、信號傳遞途徑。2.GFP在信號轉導中的應用研究發(fā)現(xiàn),某些突變的GFP能夠發(fā)生熒光共振能量轉移（FRET），F(xiàn)RET對于兩個熒光分子相互間的定位和距離高度敏感(在納米范圍內)。兩個分子間微小的線性或空間定位關系的破壞可以強烈地改變能量轉移的效率。通過計算供應分子對于接受分子熒光釋放的比率來觀測細胞動態(tài)變化的指標。它消除了GFP分子在絕對濃度、細胞的厚度、激發(fā)源的能量度以及檢測的絕對效率等的影響。利用FRET可以作成GFP依賴的生物探針,現(xiàn)已有研究人員設計大分子或分子配對物來改變GFP之間原有生理信號反應的FRET。在上述實驗基礎上,研究人員設計了FRET依賴的Ca2+敏感指示劑,該實驗發(fā)現(xiàn),通過改變兩個GFP之間的距離,可增加FRET。另有一些研究人員,并沒有把兩個GFP融合在一個單一結構中,而是把一個GFP融合到CaM上,另一個GFP融合到CaM結合區(qū)域。結果發(fā)現(xiàn),當Ca2+結合到CaM上,出現(xiàn)分子間異源二聚體,兩個GFP足夠接近而產(chǎn)生FRET。這個實驗提示了FRET不僅可以在分子內發(fā)生,而且還可在分子間發(fā)生。GFP的結構雖然具有高度完整性,但是實驗中發(fā)現(xiàn),在GFP中某些確定的位置,插入外源基因,完全沒有喪失其熒光性。當把CaM插入黃色熒光GFP突變體中,得到Ca2+傳感器,當Ca2+結合到CaM上,導致生色團去質子化,使熒光強度增加7倍。當在黃色熒光GFP中插入一個Zif268鋅指結構,可以得到傳導Zn2+的GFP,結果發(fā)現(xiàn)熒光少量增加,為改變前的1.7倍,Kd值約0.4mmol。插入外源基因致使GFP熒光敏感性增強的現(xiàn)象,提供了一個獲取永久編碼傳感器去監(jiān)測細胞信號轉導的新路徑。改進GFP的應用前景

藍色熒光蛋白、青色熒光蛋白，綠色熒光蛋白，黃色熒光蛋白，褐色。。。。。。1.提高了GFP的光譜性質，2.提高熒光強度3.提高光穩(wěn)定性4.顏色突變5.pH敏感的突變體

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