研究生實驗課-2016植物生理

實驗課的要求掌握實驗原理，學習方法。培養(yǎng)研究生的獨立工作能力，科學、規(guī)范完成實驗及其實驗報告。學會打時間差，提高效率。第一頁，共51頁。研究生實驗報告基本要求－格式實驗題目：（居中）姓名專業(yè)學號日期成績一、實驗目的：二、實驗原理三、實驗器皿：四、實驗步驟：1.*****2.*****五、實驗記錄六、實驗結果與分析第二頁，共51頁。研究生實驗報告基本要求每次實驗完畢后一周內交實驗報告B209。A4打印。中文用宋體，英文和數(shù)字用TimesNewRoman。數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。用Excel作圖，圖包括圖序、圖標、圖線、圖注等，注明參數(shù)及單位。表格采用三線表，必要時可加輔助線；表中參數(shù)應注明量和單位，如所有欄或大部分欄的單位相同，可將單位標注在表的右上角，其余單位標注在相應的欄內；單位一律采用中華人民共和國法定計量單位。第三頁，共51頁。植物適應逆境機制生長發(fā)育與形態(tài)結構滲透脅迫與滲透調節(jié)植物激素與抗逆性活性氧及其清除系統(tǒng)逆境蛋白與抗逆基因植物抗性的交叉反應第四頁，共51頁。實驗內容（40學時）酶聯(lián)免疫法（ELISA）測定植物激素含量（）1植物的莖尖培養(yǎng)（）2氣孔運動及其影響因素、鈣參與ABA調控氣孔運動的信號轉導（）3幾種逆境相關生理指標的測定（）4常用儀器講座（11月）5第五頁，共51頁。氣孔運動及其影響因素

鈣參與ABA調控氣孔運動的信號轉導－B116氣孔是陸生植物與外界環(huán)境交換水分和氣體的主要通道及調節(jié)機構。目的和意義探明植物激素和外界環(huán)境因素對氣孔運動的影響證明鈣參與ABA對氣孔運動的調控學習剝離表皮的方法和顯微鏡的使用第六頁，共51頁。氣孔運動及其影響因素、

鈣參與ABA調控氣孔運動的信號轉導－B116取3-4周齡蠶豆或鴨跖草幼苗最上端剛完全展開的葉片.暗處或光下預處理2－3h實驗材料：1.鉀離子對氣孔開度的影響（3種處理）0.5％KNO3、0.5％NaNO3與蒸餾水。2.CO2對氣孔運動的影響（2種處理）1mol/LNaOH溶液的大培養(yǎng)皿中，用燒杯罩住，其中CO2被NaOH所吸收。3.IAA和6-BA對氣孔的作用用pH6.1的10mmol/LTris或MES緩沖液配制不同濃度的IAA和6-BA溶液（0、10-4、10-5和10-6mol/L）。關開促進氣孔張開第七頁，共51頁。氣孔運動及其影響因素、

鈣參與ABA調控氣孔運動的信號轉導－B1164.ABA和SA等植物激素對氣孔關閉的作用用pH6.1的10mmol/LTris或MES緩沖液配制不同濃度的ABA和SA溶液（0、10-4、10-5和10-6mol/L）。5.Ca2+參與ABA調節(jié)氣孔運動中的信號轉導用pH6.1的10mmol/LTris或MES緩沖液配制不同濃度的ABA溶液（0、10-4、10-5和10-6mol/L）、Ca2+（0.1、1、10mmol/L）溶液、含有2mmol/LEGTA的ABA系列濃度溶液，含有1mmol/LLaCl3的ABA系列濃度溶液。處理2-3h，測量－隨機取3個視野，每個視野內隨機取5（10）個氣孔。根據(jù)測量結果，作出處理濃度和孔徑的關系圖。分析各處理對氣孔開度的影響。開關阻止氣孔張開，誘導氣孔關閉。第八頁，共51頁。氣孔運動及其影響因素、

鈣參與ABA調控氣孔運動的信號轉導－B116用反應板－－－反應體系為2000mlBuffer2000mlABA10-4

mol/L200mlA+1800mlBABA10-5

mol/LABA10-6

mol/LEGTA20mmol/LE+ABA10-4

mol/L200mlE+200mlA+1600mlB母液ABA10-3

mol/L—稀釋到終濃度第九頁，共51頁。思考題測量前為何要進行照光或暗處理?ABA為何能影響氣孔開度?如何進一步證明鈣參與ABA誘導氣孔關閉的過程？附：互動顯微鏡的使用基本步驟

Mie---設置（倍數(shù)、保存路徑等）---預覽（顯示待觀測視野）---測量（直線，每次一選）---讀數(shù)。剝離表皮的方法：水中撕下表皮—去葉肉細胞—切0.5×0.3cm—置處理液中第十頁，共51頁。酶聯(lián)免疫法（ELISA）測定植物激素含量①抗原抗體反應的高度專一性和敏感性；②酶的高效催化特性。原理固相抗原型（間接法）和固相抗體型（直接法）。目的和意義掌握間接法測定植物激素的原理和方法了解逆境對玉米根系ABA和IAA含量的影響第十一頁，共51頁。間接酶聯(lián)免疫原理示意圖

示反應板（固相載體）示激素特異抗體（一抗）示激素（抗原）示非特異二抗示蛋白質·激素復合物示標記酶第十二頁，共51頁。間接酶聯(lián)免疫原理示意圖

包被洗板競爭(-抗)洗板二抗洗板底物顯色比色第十三頁，共51頁。酶聯(lián)免疫法（ELISA）測定植物激素含量實驗材料自選材料和玉米幼苗（正常和鹽脅迫，2個處理）實驗步驟樣品中激素的提?。禾崛。海?℃

4h）-封口膜（留孔）吹干:（置于低溫）樣品測定

包被

3h洗板---上午11:00—14:30（37℃3h

）競爭30min（

37℃）洗板加IgG-HRP(二抗）30min（37℃）洗板加底物顯色15-20min比色第十四頁，共51頁。酶聯(lián)免疫法（ELISA）測定植物激素含量1.樣品中激素的提取—計量稱取1g

左右材料，加2ml

樣品提取液，在冰浴下研磨成勻漿(一定要磨細)，轉入5ml試管，再用2ml提取液分次沖洗研缽并轉入試管中，搖勻。在4℃下提取4h，3000~4000rpm離心15~20min，取上清液，沉淀中加1ml提取液，搖勻，置4℃下再提取1hr,離心，合并上清液。記錄體積，殘渣棄去。上清液（約2-3ml）—放青霉素小瓶中，置于真空干燥器中吹干?；驅⒁欢w積的上清液轉入表面皿中，吹干（低溫保存）。用樣品稀釋液定容(一般1g樣品用1ml樣品稀釋液定容)，搖勻后再用于測定。第十五頁，共51頁。酶聯(lián)免疫法（ELISA）測定植物激素含量2.樣品測定包被每孔加100ml。然后將酶標板放入內鋪濕紗布的帶蓋瓷盤內。37℃3h洗板放在室溫下平衡。用洗滌液洗4次，第一次迅速倒掉并甩干。競爭

a、配標樣：稀釋成一系列濃度(2000ng/ml、1000ng/ml、500ng/ml、250、125、62.5、31.25、0)8個。

b、加標樣及樣品：每個濃度加3孔，每孔50ml，

每個樣品重復3孔，每孔50ml，邊緣孔不加。

C、加抗體：每孔加50

ml，然后將酶標板放入濕盒內開始競爭。IAA、ABA，iPA+iP37℃0.5h

洗板第十六頁，共51頁。四人一組×××××××××2000100050025012562.5××2000100050025012562.5××31.250CK根CT根CK葉CT葉××31.250CK根CT根CK葉CT葉×××××××××第十七頁，共51頁。酶聯(lián)免疫法（ELISA）測定植物激素含量2.樣品測定加IgG-HRP(二抗）：每孔加100ml，然后將其放入濕盒內，37℃下溫育30min。

洗板加底物顯色：每孔加100ml(在暗處操作)，然后放入濕盒內，當顯色適當后，即0ng/ml孔OD490nm為1.2~1.5，而本底即完全抑制孔不超過0.1~0.2，(兩者之差為1左右)。每孔加入50ml2~3mol/L硫酸終止反應。

15-20min比色：用標準曲線最高濃度孔調0，測定OD490nm

計算—軟件第十八頁，共51頁。酶聯(lián)免疫法（ELISA）測定植物激素含量注意事項洗板（低上-高下）時間安排樣品吹干—真空干燥器-有機溶劑第十九頁，共51頁。植物的莖尖培養(yǎng)原理植物細胞具有全能性，即每個植物細胞包含著能產生完整植株的全部遺傳基因。從理論上講，只要條件合適，包含著全部遺傳基因的細胞都能分裂分化，產生完整的植株。在莖尖和根尖的分生組織中一般是無毒或僅含極低濃度的病毒粒子，而較老的組織中，病毒含量隨離莖尖距離的增加而提高。根據(jù)這一原理采用莖尖組織培養(yǎng)可獲得無毒植株。目的和意義掌握莖尖培養(yǎng)的原理和方法第二十頁，共51頁。植物的莖尖培養(yǎng)－實驗材料：自己感興趣的任何植物材料--幼嫩植株初生芽15-20個實驗步驟：1.配置基本培養(yǎng)基－MS；半天（上午）2.滅菌（包括無菌水和器皿）半天（中午）3.接種（解剖鏡剝離莖尖

－接種）（下午）練習使用解剖鏡剝離莖尖

第二十一頁，共51頁。植物的莖尖培養(yǎng)1.配置培養(yǎng)基大量元素：20倍微量元素：1000倍EDTA-Fe：200倍CaCl2?H2O：200倍KI：1000倍BA：0.2mg/mLIAA：0.1mg/mLNAA：0.1mg/mL肌醇：50mg/L水解乳清蛋白：300mg/L蔗糖：30g/L瓊脂：8-9g/L需要自己計算稱量的試劑已配母液1、MS（pH5.8）2、MS+BA0.5mg/L3、MS+BA0.5mg/L+IAA0.1mg/L4、MS+BA1.5mg/L+IAA0.1mg/L5、MS+BA0.5mg/L+NAA1.0mg/L6、MS+BA1.5mg/L+NAA1.0mg/L分組添加第二十二頁，共51頁。植物的莖尖培養(yǎng)1.配置培養(yǎng)基在制作培養(yǎng)基時，按照以下順序加入各種試劑：先吸取①-⑤，再加入蔗糖，溶解后，加母液⑥~⑧，混勻后加蒸餾水，用0.5NNaOH調pH至5.8~6并用試紙檢驗。加水定容至所計算體積后，調整pH至5.8。然后將混勻的溶液傾入燒杯中，加入瓊脂8g/L，在微波爐上加熱融化（如果瓊脂質量不好，含雜質較多時，可事先在水中浸泡，清洗后使用）。待瓊脂徹底融化后，就可以開始分裝。

培養(yǎng)基的分裝：將制作好的培養(yǎng)基分裝到組織培養(yǎng)用的三角瓶中，分裝時，小心地將培養(yǎng)基倒入三角瓶中，以免瓶口沾上培養(yǎng)基容易引起污染。分裝量可根據(jù)三角瓶大小而定，一般使培養(yǎng)基體積占瓶體的1/4到2/5比較合適。裝好后，塞上棉塞，用羊皮紙包嚴，線繩扎緊，準備消毒滅菌。第二十三頁，共51頁。植物的莖尖培養(yǎng)2.滅菌培養(yǎng)基消毒壓力為0.9~lkg／cm2消毒20min。玻璃器皿及用具、無菌水消毒應適當增加壓力和延長時間，一般為1.2~1.3kg/cm2，30~50min。在消毒用具前，每人應準備好蒸餾水，用棉塞塞好，紙包嚴，線繩扎緊，同時再準備兩套培養(yǎng)皿、皿底內鋪兩張與培養(yǎng)皿大小相應的濾紙，蓋好皿蓋，用羊皮紙分別包好，兩包合起來，再用一塊紗布包好，扎上線繩，一起滅菌。滅菌121~126℃滅20min，0.05P，放氣，2次

第二十四頁，共51頁。植物的莖尖培養(yǎng)3.接種接種室的消毒：材料表面消毒：植物器官(莖尖)用水沖凈－－用70％的酒精漂洗材料半分鐘－－放入0.1％的升汞中進行表面消毒2-10min－－用無菌水沖洗材料。莖尖剝離：表面消毒的莖尖和解剖鏡都置于超靜工作臺上。剖取莖件尖時，把莖芽置于解剖鏡下，一手用鑷子將其按住，另一手用解剖針或解剖刀將葉片和葉原基剝掉。解剖針或解剖刀要常常浸入酒精，并用火焰灼燒，冷卻。當形似一個晶亮半圓球形的頂端分生組織充分露出來后，將其切下一般0.1~1mm（實際操作時可2~4mm），再用同一工具接到培養(yǎng)基上。接種：每瓶中放置1-3個莖尖放置好材料的培養(yǎng)瓶，立即塞好瓶塞。用一小塊錫鉑紙包好瓶口；并用線繩或橡皮繩纏兩圈結成活頭，便于以后解開。記錄個人信息。第二十五頁，共51頁。植物的莖尖培養(yǎng)1.配置培養(yǎng)基每人做三種配方，相同配方的同學原則上6人一組配置培養(yǎng)基（pH5.8）－－400ml每人量取60mlMS培養(yǎng)基，3名同學搭配分別要配置的培養(yǎng)基添加不同激素，分裝到3個三角瓶中。32套培養(yǎng)皿（32*3=96）及2L蒸餾水進行高壓濕熱滅菌。第二十六頁，共51頁。實驗流程母液配制培養(yǎng)基配制培養(yǎng)基等的滅菌接種培養(yǎng)外植體表面消毒412356第二十七頁，共51頁。逆境脅迫（鹽）對玉米幼苗的影響材料---根、葉片處理---1mol/LNaCl（自選逆境）指標：激素—ABA-IAA(選一)膜--MDA滲透物質—脯氨酸保護酶---活性氧代謝-SOD、POD(選一)

第二十八頁，共51頁。幾種逆境相關生理指標的測定自己查閱文獻，設定脅迫條件（高溫、低溫、鹽害、干旱，等等），或處理材料；自己配制部分藥品。任選選3個指標。SOD活性測定（B112）POD活性測定（B112）丙二醛含量的測定（B112）游離脯氨酸的測定（B116）第二十九頁，共51頁。實驗儀器：紫外可見分光光度計離心機第三十頁，共51頁。二、實驗原理

因此光還原反應后，反應液藍色愈深說明酶活性愈低，反之酶活性愈高。本實驗依據(jù)超氧物歧化酶抑制氮藍四唑（NBT）在光下的還原作用來確定酶活性大小。核黃素被氧化物質還原的核黃素氧氮藍四唑藍色的化合物（560nm）

2+2H+H2O2+O2SOD植物組織中超氧物歧化酶活性的測定

第三十一頁，共51頁。實驗步驟

試劑（酶）用量(ml)終濃度（比色時）0.05mol/L磷酸緩沖液130mmol/LMet溶液750μmol/LNBT溶液100μmol/LEDTA-Na2液20μmol/L核黃素酶液蒸餾水30.60.60.60.60.20.413mmol75μmol10μmol2.0μmol對照管加緩沖液代替酶液總體積6.01、酶液提取2、顯色反應表1各溶液加入量0.5g，加1ml磷酸緩沖液(pH7.8)研磨成漿，加緩沖液使終體積為4ml。取2~3ml于10000rpm下離心10分鐘第三十二頁，共51頁。3、SOD活性測定以不照光的對照管作空白，在560nm下分別測定其它各管的光密度值，SOD活性單位以抑制NBT光化還原的50%為一個酶活性單位表示。按下式計算SOD活性。

SOD總活性=單位：酶單位/g鮮重表示；Ack―照光對照管的光密度值；AE—樣品管的光密度值；V—樣液總體積（ml）；a—測定時樣品用量（ml）；W—樣重（g）；第三十三頁，共51頁。思考題

1、在SOD測定中為什么設暗中和照光兩個對照管？2、影響本實驗準確性的主要因素是什么？應如何克服？第三十四頁，共51頁。

實驗原理：硫代巴比妥酸TBA丙二醛3,5,5′-三甲基惡唑2,4-二酮（三甲川）逆境膜脂的過氧化作用丙二醛酸性粉紅色植物組織或器官中丙二醛含量的測定第三十五頁，共51頁。實驗步驟：1MDA的提取稱2g葉片，加入5ml磷酸緩沖液（50mmol，pH值為7.8）及少量石英砂，于冰浴中研磨提取，勻漿液以12000g離心力作用下（4度）離心10min，其上清液即為MDA提取液。2MDA的測定取1mlMDA提取液，加3ml27％三氯乙酸和1ml2%TBA。混和液在95度水浴中保溫30min后，立即置于冰浴中冷卻，然后離心10min，于波長532nm和600nm下測定OD值。第三十六頁，共51頁。結果計算以測得的OD532減去OD600的非特異吸收值，按155mmol-1cm-1消光系數(shù)計算MDA含量。分別計算衰老和對照組的值。

MDA濃度(μmol/L)=6.45(D532-D600)-0.56D450MDA含量(μmol/gFW)＝

D450、D532、D600分別代表450nm、532nm和600nm波長下的光密度值。第三十七頁，共51頁。注意事項：％的三氯乙酸對MDA—TBA反應較合適，若高于此濃度，其反應液的非專一性吸收偏高；MDA-TBA顯色反應的加熱時間，最好控制沸水浴10-15min之間。時間太短或太長均會引起532nm下的光吸收值下降；如待測液渾濁，可適當增加離心力及時間，最好使用低溫離心機離心。低濃度的鐵離子能增強MDA與TBA的顯色反應，當植物組織中鐵離子濃度過低時應補充Fe3+（最終濃度為0.5nmol·L-1）可溶性糖與TBA顯色反應的產物在532nm也有吸收（最大吸收在450nm），當植物處于干旱、高溫、低溫等逆境時可溶性糖含量會增高，必要時要排除可溶性糖的干擾。第三十八頁，共51頁。植物組織中過氧化物酶活性測定原理在過氧化物酶

(peroxidase)催化下

,H2O2

將愈創(chuàng)木酚氧化成茶褐色產物。此產物在

470nm處有最大光吸收,故可通過測

470nm下的吸光度變化測定過氧化物酶的活性。第三十九頁，共51頁。方法和步驟1.酶液的制備取

2g材料,切碎

,加適量的磷酸緩沖液（pH5.5）研磨成勻漿。將勻漿液全部轉入離心管中,于

3000g離心

l0min,

上清液轉入

10ml容量瓶中。2.過氧化物酶活性測定-l

磷酸緩沖液；1.0m12%H202；-l

愈創(chuàng)木酚和

0.1ml酶液。用加熱煮沸

5min的酶液為對照,反應體系加入酶液后,立即于

37℃水浴中保溫15min,然后迅速轉入冰浴中,并加入

2.0ml20%三氯乙酸終止反應,然后,過濾，適當稀釋,470m波長下測定吸光度。第四十頁，共51頁。計算以每分鐘內A470變化

0.01為

1個過氧化物酶活性單位

(u)。過氧化物酶活性

=(△A470·Vt)/（0.01W·Vs·t）-1式中：△A470一反應時間內吸光度的變化；w一馬鈴薯鮮重

(g)；t一反應時間

(min)；Vt一提取酶液總體積

(ml)；Vs一測定時取用酶液體積

(ml)。第四十一頁，共51頁。植物體內游離脯氨酸含量的測定

原理在酸性條件下，脯氨酸與茚三酮反應生成穩(wěn)定的紅色縮合物，用甲苯萃取后，此縮合物在波長520nm處有一最大吸收峰。脯氨酸濃度的高低在一定范圍內與其光密度成正比。第四十二頁，共51頁。1．標準曲線制作表

各試管中試劑加入量管號0123456標準脯氨酸量(ml)00.20.40.81.21.62.0H2O(ml)2.01.81.61.20.80.40冰乙酸(ml)2.02.02.02.02.02.02.0顯色液(ml)3.03.03.03.03.03.03.0脯氨酸含量(μg)0248121620以光密度值為縱坐標，脯氨酸含量為橫坐標，繪制標準曲線，求線性回歸方程。步驟第四十三頁，共51頁。2．樣品測定

（1）脯氨酸提取取不同處理的材料0.5g，分別置于大試管中，加入5ml3%磺基水楊酸溶液，管口加蓋玻璃球塞，于沸水浴中浸提10min。（2）取出試管，待冷卻至室溫后，吸取上清液2ml，加2ml冰乙酸和3ml顯色液，于沸水浴中加熱40min。（3）取出冷卻后向各管加入5ml甲苯充分振蕩，以萃取紅色物質。靜置待分層后吸