基因工程常用的工具酶課件

第二章基因工程常用的工具酶第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶：簡稱限制酶。是一類能識(shí)別雙鏈DNA分子中某種特定的核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶

20世紀(jì)50年代發(fā)現(xiàn)：λ噬菌體E.coliBPFU10-4E.coliB

PFU1λ噬菌體DNA被降解DNA被修飾E.coliB限制性核酸內(nèi)切酶：降解外來DNA防御修飾酶：DNA甲基化保護(hù)寄主細(xì)胞控制的限制與修飾系統(tǒng)（R/M體系）！一、限制酶的種類限制修飾活性酶蛋白結(jié)構(gòu)相對分子質(zhì)量切割位點(diǎn)切割作用輔助因子實(shí)用性代表Ι型酶Ⅱ型酶

Ⅲ型酶同時(shí)存在單獨(dú)存在同時(shí)存在多亞基結(jié)構(gòu)單亞基結(jié)構(gòu)兩個(gè)亞基30萬dal2-10萬dal

Ι、Ⅱ之間

與識(shí)別位點(diǎn)不一致與識(shí)別位點(diǎn)一致與識(shí)別位點(diǎn)不一致Mg2+、ATP、SAMMg2+

Mg2+、SAM

低高低EcoK、EcoBHindⅡ

EcoPΙ三、Ⅱ型限制酶的特性-識(shí)別序列識(shí)別雙鏈DNA分子中特定的4-8對核苷酸序列5‘…GCTGAATTCGAG…3’3‘…CGACTTAAGCTC…5’EcoRI的識(shí)別序列EcoRI的切割位點(diǎn)5‘…GAG

GC

CGAG…3’3‘…CTCCG

GCTC…5’HaeⅢ的識(shí)別序列HaeⅢ

的切割位點(diǎn)大部分酶的切割位點(diǎn)在識(shí)別序列內(nèi)部或兩側(cè)部分限制酶能識(shí)別多種核苷酸序列5‘…GCGT

PyPuACGAG…3’3‘…CGC

APuPy

TGCTC…5’HindⅡ的識(shí)別序列PydCMP、dTMPPudAMP、dGMP識(shí)別序列呈典型的旋轉(zhuǎn)對稱型回文結(jié)構(gòu)5‘…GCTGAATTCGAG…3’3‘…CGACTTAAGCTC…5’EcoRI的識(shí)別序列EcoRI的切割位點(diǎn)回文結(jié)構(gòu):兩條核苷酸鏈的核酸序列呈雙重旋轉(zhuǎn)對稱排列的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)三、Ⅱ型限制酶的特性-同尾酶、同裂酶同尾酶:來源各異、識(shí)別序列也不相同，但都產(chǎn)生相同粘性末端的一類限制酶5‘…GTGGATCCGA…3’3‘…CACCTAGGCT…5’BamHI5‘…GTGGATCCGA…3’3‘…CACCTAGGCT…5’5‘…GTTGATCAGA…3’3‘…CAACTAGTCT…5’BclI5‘…GTTGATCAGA…3’3‘…CAACTAGTCT…5’BamHI、BclI為一組同尾酶同裂酶:來源各異，但識(shí)別相同核酸序列的一類酶5‘…GTGATCGA…3’3‘…CACTAGCT…5’Sau3AI5‘…GAGATCCA…3’3‘…CTCTAGGT…5’MboI5‘…GTCCCGGGGA…3’3‘…CAGGGCCCCT…5’XmaI5‘…GTCCCGGGGA…3’3‘…CAGGGCCCCT…5’SmaI四、影響限制酶活性的因素DNA的純度：蛋白質(zhì)、苯酚、氯仿、EDTA、SDS增加限制酶用量擴(kuò)大酶催化反應(yīng)體系延長酶催化時(shí)間DNA的甲基化程度：反應(yīng)溫度：DNA的分子結(jié)構(gòu)：酶緩沖液組成：甘油濃度：MgCl2：NaCl/KCl：Tris-HCl：β-巰基乙醇/二硫蘇糖醇（DTT）：牛血清白蛋白（BSA）：DNA連接酶：能夠催化雙鏈DNA片段相鄰的3‘羥基與5’磷酸基形成磷酸二酯鍵的酶作用特點(diǎn)只能連接雙螺旋DNA分子，不能連接單鏈DNA分子；DNA鏈上必須具有游離的3’-OH和5‘-P；只能封閉DNA鏈上磷酸二酯鍵切口，不能封閉多個(gè)核酸分子缺失形成的裂口；需要吸能：ATP/NAD+連接方式缺口DNA:平齊末端DNA：粘性末端DNA：5’5’3’3’OHP5’5’3’3’OHPPOH5’5’3’3’基因工程中常用的連接酶T4噬菌體DNA連接酶（T4連接酶）大腸桿菌DNA連接酶熱穩(wěn)定性DNA連接酶第三節(jié)DNA聚合酶一、大腸桿菌DNA聚合酶Ι（DNApolI）酶特性：5’→3’聚合酶活性5’→3’核酸外切酶活性3’→5’核酸外切酶活性3‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A…5’dNTPMg2+DNApolI3‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A…5’5‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OH5‘…C-G-A-G-T-OH切口平移反應(yīng)（Nicktranslation）用途：制備32P標(biāo)記的DNA探針5’→3’核酸外切酶活性5’→3’核酸聚合酶活性5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘5‘…G-C-T-CA-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘DNaseIDNApolIMg2+dNTPa-32P-dATP二、Klenow大片段酶DNA聚合酶一個(gè)片段：5’→3’核酸外切酶活性另一個(gè)片段：

5’→3’聚合酶活性、3’→5’核酸外切酶活性枯草桿菌蛋白酶Klenow大片段酶Klenow大片段酶特性：5’→3’聚合酶活性

3’→5’核酸外切酶活性用32PdNTP對3‘凹端進(jìn)行末端同位素標(biāo)記5‘…G-C-T-G-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-POH-G-C-T-C…5’Klenowa-32P-pppdAdTTP5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-POH-T-T-A-A-G-C-T-C…5’cDNA克隆中，合成cDNA第二鏈應(yīng)用sanger雙脫氧末端中止法進(jìn)行DNA測序三、TagDNA聚合酶來源嗜熱水生棲熱菌酶特性5’→3’聚合酶活性、3’→5’核酸外切酶活性耐高溫：75~80℃應(yīng)用：PCR技術(shù)（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）94℃變性（1min）60℃退火（1min）72℃延伸（1.5min）溫度（℃）時(shí)間（min）947260循環(huán)1循環(huán)2循環(huán)3PCR反應(yīng)的溫度循環(huán)周期特點(diǎn)待擴(kuò)增的DNA鏈限定在模板上的退火位點(diǎn)之間待擴(kuò)增DNA鏈得到迅速大量擴(kuò)增反應(yīng)體系組成影響因素模板dNTPDNA聚合酶引物A、BMgCl2引物的設(shè)計(jì)退火溫度MgCl2濃度作用底物：帶3’-OH末端的單鏈DNA5‘pOH3‘TDTMg2+

dATPAAAAAAAAAAAAOH3‘5‘p帶3’-OH單鏈突出末端的雙鏈DNA5‘p3‘HOOH3‘

p5‘

TDTMg2+

dATP5‘p3‘HOAAAAAAAAAAAAAA

OH3‘

p5‘

帶3’-OH平齊末端的雙鏈DNA5‘p3‘HOOH3‘

p5‘

TDTCo2+

dATP5‘p3‘HOAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOH3‘

p5‘

用途：外源DNA與載體的重組DNA片段3‘端標(biāo)記二、堿性磷酸酶細(xì)菌堿性磷酸酶（BAP）：來自E.coli小牛腸堿性磷酸酶（CIP）：來自小牛腸作用：催化核酸分子脫去5’-P5‘pOH3‘

DNAorRNA5‘pppdNTP5‘pppNTPBAP/CIPOH3‘

5‘HO5‘HO