分子生物學(xué)基因突變

基因突變

&

相關(guān)技術(shù)Dr.LiuJi現(xiàn)在是1頁\一共有104頁\編輯于星期四

NaturalSelectionFebruary12th,2009markedthe200thbirthdayforfamousevolutionscientist

CharlesDarwin(02/12/1809-04/19/1882),

wholaidthefoundationsfortheevolutiontheory-mutation&naturalselection.AsperDarwin,mutationprovidesnewtraitsforspecies,andthenthenature"selects"thosespecieswithadvantageousheritabletraits-theprocessDarwincalled

"naturalselection".

現(xiàn)在是2頁\一共有104頁\編輯于星期四NaturalSelection現(xiàn)在是3頁\一共有104頁\編輯于星期四ScienceandResearch現(xiàn)在是4頁\一共有104頁\編輯于星期四如果要對近幾年的社會話題按照“敏感指數(shù)”排出一個名次的話，轉(zhuǎn)基因食品的安全問題恐怕至少要入圍三甲。究其背后的原因，如果不是轉(zhuǎn)基因食品在安全性問題上確有遮掩、隱瞞的話，那么我們就該反思，是不是真正地了解了“轉(zhuǎn)基因食品的安全性到底是怎么一回事兒？”轉(zhuǎn)基因食品的安全問題現(xiàn)在是5頁\一共有104頁\編輯于星期四Evolution

Mutationsareenginesofnaturalselection

現(xiàn)在是6頁\一共有104頁\編輯于星期四Spiralgoat

現(xiàn)在是7頁\一共有104頁\編輯于星期四Georgewasallmouth

Theeyeshaveit現(xiàn)在是8頁\一共有104頁\編輯于星期四BacktotheWater現(xiàn)在是9頁\一共有104頁\編輯于星期四現(xiàn)在是10頁\一共有104頁\編輯于星期四Science:科學(xué)家揭示

人類長相各異的原因

人類的長相各異，沒有兩個人長相完全相同的。是什么導(dǎo)致了人面部形態(tài)各異呢？遺傳學(xué)證據(jù)顯示父母和子女長相類似，但是哪些因素使得DNA調(diào)控如此精確，使得兩個人長相不同呢？伯克利國家重點實驗室的科學(xué)家揭示了增強子在面部發(fā)育中發(fā)揮重要作用。相關(guān)報道發(fā)表在近期的Science雜志上。該文章的通訊作者AxelVisel博士稱其研究結(jié)果表明很可能人類基因組中的數(shù)千個增強子都不同程度的參與到面部發(fā)育過程中?，F(xiàn)在是11頁\一共有104頁\編輯于星期四該研究總共分析了四千多個可能與面部發(fā)育相關(guān)的增強子序列，建立了增強子序列的基因組圖譜。此外他們還細致分析了其中200個基因增強子的活性。子女遺傳了父母的基因，但是由于增強子的存在，在面部發(fā)育過程中基因活性不盡相同，最終導(dǎo)致面部發(fā)育結(jié)果不完全相同。該結(jié)果還提示遺傳學(xué)家，增強子的特異突變也會在新生兒缺陷中發(fā)揮作用。有助于開發(fā)更好的診斷和治療措施?，F(xiàn)在是12頁\一共有104頁\編輯于星期四FineTuningofCraniofacialMorphologybyDistant-ActingEnhancers

CatiaAttanasio,AlexS.Nord,YiwenZhu,MatthewJ.Blow,ZirongLi,DeniseK.Liberton,HarrisMorrison,IngridPlajzer-Frick,AmyHolt,RoyaHosseini,SengthavyPhouanenavong,JenniferA.Akiyama,MalakShoukry,VeenaAfzal,EdwardM.Rubin,DavidR.FitzPatrick,BingRen,BenediktHallgrímsson,LenA.Pennacchio,AxelViselTheshapeofthehumanfaceandskullislargelygeneticallydetermined.However,thegenomicbasisofcraniofacialmorphologyisincompletelyunderstoodandhypothesizedtoinvolveprotein-codinggenes,aswellasgeneregulatorysequences.Weusedacombinationofepigenomicprofiling,invivocharacterizationofcandidateenhancersequencesintransgenicmice,andtargeteddeletionexperimentstoexaminetheroleofdistant-actingenhancersincraniofacialdevelopment.Weidentifiedcomplexregulatorylandscapesconsistingofenhancersthatdrivespatiallycomplexdevelopmentalexpressionpatterns.Analysisofmouselinesinwhichindividualcraniofacialenhancershadbeendeletedrevealedsignificantalterationsofcraniofacialshape,demonstratingthefunctionalimportanceofenhancersindefiningfaceandskullmorphology.Theseresultsdemonstratethatenhancersareinvolvedincraniofacialdevelopmentandsuggestthatenhancersequencevariationcontributestothediversityofhumanfacialmorphology.doi:10.1126/science.1241006現(xiàn)在是13頁\一共有104頁\編輯于星期四運動和咖啡因

會改變你的DNA

你可能會認為不管做任何事情，自己的DNA都是不會受影響而改變的。但在某種意義上說，這一想法是錯誤的。在3月Cell出版社的《細胞代謝》雜志上，研究人員發(fā)表報告稱當身體處于健康狀態(tài)時，不怎么運動的男性和女性在運動鍛煉幾分鐘后，他們體內(nèi)的DNA會出現(xiàn)瞬間變化。更讓人驚奇的是，這項研究表明我們早晨喝的咖啡中咖啡因成分也可能會以相同方式影響肌肉中的DNA?，F(xiàn)在是14頁\一共有104頁\編輯于星期四女性攜帶離婚基因A-allele

者離婚率高出五成

很多時候，當婚姻出現(xiàn)問題時，人們會把責任怪罪在男方頭上，認為男士的花心導(dǎo)致了婚姻破裂。在近期的BiologicalPsychiatry雜志上刊登的一項研究成果表明，據(jù)瑞典斯德哥爾摩卡羅林斯卡醫(yī)學(xué)院的最新研究發(fā)現(xiàn)，婚姻出現(xiàn)破裂也有可能是女性體內(nèi)攜帶的一種基因作祟所致。一種叫A-allele的催產(chǎn)素受體基因會在女性體內(nèi)搞怪，讓女性對婚姻關(guān)系中偶爾出現(xiàn)的不和諧插曲缺乏耐心，脾氣暴躁，從而提高離婚率。女性處于生產(chǎn)期和哺乳期時體內(nèi)會自行分泌催產(chǎn)素，這種激素能拉近女性和后代間的關(guān)系。不過若催產(chǎn)素分泌異常就會攪亂大腦對感情問題的處理能力，催生叫A-allele的“離婚基因”。研究人員調(diào)查了1800名女性后發(fā)現(xiàn)攜帶這種基因的女性離婚率高50%?，F(xiàn)在是15頁\一共有104頁\編輯于星期四概念及分類誘因與特點突變與疾病突變與遺傳工程技術(shù)突變的檢測基因突變概要Amutationhascausedthisgardenmossrose(百葉薔薇)toproduceflowersofdifferentcolors.Thisisasomaticmutationthatmayalsobepassedoninthegermline現(xiàn)在是16頁\一共有104頁\編輯于星期四

概念：基因突變：基因組DNA分子中發(fā)生堿基的增添、缺失或改變而引起的基因結(jié)構(gòu)的改變，進而引起遺傳表型的改變。一、概念及分類現(xiàn)在是17頁\一共有104頁\編輯于星期四Illustrationsoffivetypesofchromosomalmutations.現(xiàn)在是18頁\一共有104頁\編輯于星期四現(xiàn)在是19頁\一共有104頁\編輯于星期四Cellswithoneadditionalsetofchromosomes,foratotalof69chromosomes,arecalledtriploid現(xiàn)在是20頁\一共有104頁\編輯于星期四Whenanindividualhastwoormorecellpopulationswithadifferentchromosomalmakeup,thissituationiscalledchromosomalmosaicism.現(xiàn)在是21頁\一共有104頁\編輯于星期四Inabalancedtranslocation,piecesofchromosomesarerearrangedbutnogeneticmaterialisgainedorlostinthecell.現(xiàn)在是22頁\一共有104頁\編輯于星期四Mitochondriaprovidethecell’senergy.現(xiàn)在是23頁\一共有104頁\編輯于星期四現(xiàn)在是24頁\一共有104頁\編輯于星期四基因突變指一個基因變?yōu)樗牡任换颍腔蚍肿咏Y(jié)構(gòu)或化學(xué)組成上的改變。染色體的結(jié)構(gòu)及數(shù)目改變現(xiàn)在是25頁\一共有104頁\編輯于星期四突變分類（遺傳信息的改變）突變分類堿基改變密碼效應(yīng)點突變（pointmutation）堿基插入突變（baseinsert）堿基缺失突變（basedeletion）同義突變（synonymousmutation）錯義突變（missensemutation）無義突變（nonsensemutation）移碼突變（frame-shiftingmutation）現(xiàn)在是26頁\一共有104頁\編輯于星期四堿基改變點突變：DNA被化學(xué)修飾或復(fù)制時發(fā)生錯配，使一個堿基變成另一個堿基。堿基插入突變：DNA鏈中插入1個或多個堿基（轉(zhuǎn)座子Tn），突變后可引起DNA序列閱讀框架改變。堿基缺失突變：DNA鏈中1個或多個堿基發(fā)生丟失，突變后可引起DNA序列閱讀框架改變。突變分類現(xiàn)在是27頁\一共有104頁\編輯于星期四現(xiàn)在是28頁\一共有104頁\編輯于星期四基因突變的密碼效應(yīng)分類同義突變：堿基被替代后沒有密碼子改變，其產(chǎn)物AA序列也無變化。錯義突變：堿基序列的改變引起AA序列改變。無義突變：某個堿基改變使某個AA的密碼子成為蛋白質(zhì)合成的終止密碼子。纈氨酸GUAHb中一條鏈

谷氨酸

GAA現(xiàn)在是29頁\一共有104頁\編輯于星期四現(xiàn)在是30頁\一共有104頁\編輯于星期四基因突變的其他分類方式

形態(tài)突變生化突變致死突變按突變的表型特征分類:

突變發(fā)生后出現(xiàn)的表型改變是多種多樣的，有的可能十分微弱，需要精細的生化技術(shù)才能檢測出與野生型（WT)的差別，有的突變的表型效應(yīng)可能如此之大，以致產(chǎn)生形態(tài)上的嚴重缺陷甚至死亡?，F(xiàn)在是31頁\一共有104頁\編輯于星期四1、形態(tài)突變(morphologicalmutation):突變主要影響生物體的外在可見的形態(tài)結(jié)構(gòu)，故又稱可見突變。如形狀、大小、色澤等的改變。2、生化突變(biochemicalmutations):突變影響生物的代謝過程。導(dǎo)致一個特定的生化功能的改變或喪失。

（1）失去功能的突變：突變事件通常是破壞性的，多數(shù)情況下，突變事件導(dǎo)致功能的喪失，完全喪失基因功能的突變稱為無效突變(nullmutation)。通常喪失功能的突變是隱性的，有時候也可以是顯性的。（2）獲得功能的突變:突變事件引起的遺傳隨機變化有可能使之獲得某種新的功能。3、致死突變(lethalmutation):

影響生物體的生活力，導(dǎo)致個體死亡的一類突變。

條件致死突變(conditionallethalmutations)：在某些條件下能成活，而在某些條件下是致死的。例如T4噬菌體的溫度敏感突變型在25℃時能在E.coli宿主細胞中正常生長，形成噬菌斑，但在42℃

時就不能生長。現(xiàn)在是32頁\一共有104頁\編輯于星期四按發(fā)生突變的細胞分類

基因突變可以發(fā)生在體細胞或生殖細胞中，這兩種突變有完全不同的后果。體細胞突變生殖細胞突變1、體細胞突變(somaticmutations):在保持分裂的身體組織的一個細胞發(fā)生突變，這個細胞便成為一群相同突變細胞的祖先。在發(fā)育過程中，體細胞突變事件發(fā)生的愈早，對表型的影響就愈大。體細胞突變一般不能遺傳給后代。2、生殖細胞突變(germinalmutation)：生殖細胞突變發(fā)生在種系(germline)中。如果突變的性細胞參與受精過程，那么突變基因就會傳給下一代。最典型的例子是性連鎖遺傳的血友病突變在歐洲王室通過維多利亞女王在其整個家系中的遺傳?，F(xiàn)在是33頁\一共有104頁\編輯于星期四二、突變誘因及特點自發(fā)性突變

DNA復(fù)制過程中偶然堿基配對出現(xiàn)錯誤，突變頻率低(10-9~10-10)

。誘變劑的作用誘變劑（mutagen）外源誘發(fā)突變的因素，種類繁多，突變頻率高，是自然突變的100-1000倍

。主要有以下幾種：突變誘因現(xiàn)在是34頁\一共有104頁\編輯于星期四（1）物理因素：紫外線、電離輻射等。（2）

生物因素：病毒、真菌、細菌等（3）化學(xué)因素：①烷化劑現(xiàn)在是35頁\一共有104頁\編輯于星期四

②堿基類似物:如5-BrU5-BrU引起DNA堿基改變示意圖

③其他化學(xué)誘變劑:羥胺、亞硝酸鹽等現(xiàn)在是36頁\一共有104頁\編輯于星期四基因突變表現(xiàn)出以下幾個方面的普遍特征：(一)突變的平行性、重演性和可逆性

(二)突變的多方向性與復(fù)等位基因(三)隨機性——生物個體發(fā)育的任何時期

體細胞突變——不遺傳給后代生殖細胞突變——遺傳給后代(四)廣泛性和有害性（多數(shù)）基因突變的一般特征

現(xiàn)在是37頁\一共有104頁\編輯于星期四1.平行性

是指親緣關(guān)系相近的物種因遺傳基礎(chǔ)較近似而發(fā)生相似基因突變的現(xiàn)象。

如小麥有早熟、晚熟的變異類型，屬于禾本科的其它物種如大麥、黑麥、燕麥、水稻、玉米等同樣存在這些變異類型。

2.重演性

相同的基因突變可以在同種生物的不同個體間重復(fù)發(fā)生，稱為重演性。

同一基因突變在不同的個體上均可能發(fā)生。

不同群體中發(fā)生同一基因突變的頻率相近。突變的平行性、重演性和可逆性

現(xiàn)在是38頁\一共有104頁\編輯于星期四

3.可逆性：基因突變的發(fā)生方向是可逆的。★正突變(forwardmutation)：顯性基因A隱性基因a；★反突變(reversemutation)：隱性基因a顯性基因A?！锿ǔＵJ為：野生型基因是正常、有功能基因；而最初基因突變往往是野生型基因突變而喪失功能、發(fā)生功能改變，表現(xiàn)為隱性基因。所以反突變又稱為回復(fù)突變(backmutaiton)。

通常用u表示正突變頻率、v表示反突變頻率，則：

正突變u

野生型===========突變型一般u>v反突變v現(xiàn)在是39頁\一共有104頁\編輯于星期四突變的多方向性：指基因突變可以多方向發(fā)生，即基因內(nèi)部多個突變部位分別改變后會產(chǎn)生多種等位基因形式。例如：A基因不同部位發(fā)生改變產(chǎn)生突變基因a1、a2、a3等對A均表現(xiàn)為隱性的基因。新基因可能均是無功能的，也可能各具不同功能。這些復(fù)等位基因可以從野生型基因突變產(chǎn)生，也可以從其它任何一個突變基因突變產(chǎn)生。突變的多方向性與復(fù)等位基因現(xiàn)在是40頁\一共有104頁\編輯于星期四復(fù)等位基因(multipleallele)：

位于同一基因位點上的多種等位基因。在二倍體與異源多倍體中，同一位點只能有一對基因，最多存在兩種等位基因形式；因此復(fù)等位基因的各種形式會存在于生物群體的不同個體中。等位基因概念現(xiàn)在是41頁\一共有104頁\編輯于星期四

人類紅細胞表面抗原的特異性由3個復(fù)等位基因IA，IB，i決定?！锲渲蠭A，IB對i均為顯性；★

IA，IB間為共顯性?！?/p>

3種基因兩兩組合可能形成6種基因型、4種紅細胞表面抗原反應(yīng)類型，如下表所示(其中用IO表示i)：人類ABO血型的復(fù)等位基因

現(xiàn)在是42頁\一共有104頁\編輯于星期四三、基因突變與疾病人類所有疾病均可視為基因病按照參與疾病發(fā)生過程的基因性質(zhì)和來源，基因病可分為三種：GeneMutationsandDisease基因型genotype表型phenotype正常/異常單基因病多基因病獲得性基因病正常/異?，F(xiàn)在是43頁\一共有104頁\編輯于星期四基因突變與疾病代謝性疾病神經(jīng)肌肉系統(tǒng)疾病發(fā)育缺陷腫瘤早老癥現(xiàn)在是44頁\一共有104頁\編輯于星期四NoSymptomsSevereSymptoms

MildSymptomsNoSymptoms

DiseaseInheritanceisComplex現(xiàn)在是45頁\一共有104頁\編輯于星期四SearchingDiseaseFamilies現(xiàn)在是46頁\一共有104頁\編輯于星期四現(xiàn)在是47頁\一共有104頁\編輯于星期四血友病突變在維多利亞女王及其整個家系中的遺傳現(xiàn)在是48頁\一共有104頁\編輯于星期四突變與疾病Tumor/Cancer現(xiàn)在是49頁\一共有104頁\編輯于星期四早老癥早衰癥全稱早年衰老綜合癥，又稱兒童早老癥，屬遺傳病。Hutchinson于1886年首先報告雖然本病為一種先天遺傳性疾病，但還不能確定是常染色體隱性還是顯性遺傳。本病為一綜合征，特點為發(fā)育延遲，至嬰兒時期就發(fā)生進行性老年性退行性改變?；颊呱眢w的老化過程十分快速。而罹患此病孩童的年齡很少超過13歲，大約每八百萬個新生兒之中有一位患有此疾?，F(xiàn)在是50頁\一共有104頁\編輯于星期四赫-吉綜合征(HGPS)現(xiàn)在是51頁\一共有104頁\編輯于星期四日本京都大學(xué)靈長類研究所副教授大石高生的研究小組發(fā)現(xiàn)了年齡小但面相衰老的“早衰癥”猴子，并將此發(fā)現(xiàn)發(fā)表在了美國科學(xué)雜志上。該小組目標通過猴子細胞制造出的人工多功能干細胞(iPS)使機體各種細胞變異，體外再現(xiàn)早衰癥病狀，以此幫助衰老研究。大石教授表示“不僅希望揭開早衰癥的病理，同樣想要研究人類正常衰老的課題”?，F(xiàn)在是52頁\一共有104頁\編輯于星期四著色性干皮病（XP）

著色性干皮病(xrodermapigmentosaXP)與共濟失調(diào)毛細血管擴張癥一樣，屬DNA修復(fù)缺陷所致的遺傳性共濟失調(diào)綜合征。XP是常染色體隱性遺傳病，具有遺傳異質(zhì)性。著色性干皮病是一種發(fā)生在暴露部位的色素變化，萎縮，角化及癌變的遺傳性疾病，屬常染色體隱性遺傳病?，F(xiàn)在是53頁\一共有104頁\編輯于星期四21三體綜合癥患兒（先天愚型）白化病患者Duchenne肌營養(yǎng)不良癥（假性肌肥大型）唇裂與腭裂現(xiàn)在是54頁\一共有104頁\編輯于星期四MitochondrialMutatorMiceValidatethemtDNAMutationTheoryforMammalianAging現(xiàn)在是55頁\一共有104頁\編輯于星期四現(xiàn)在是56頁\一共有104頁\編輯于星期四現(xiàn)在是57頁\一共有104頁\編輯于星期四現(xiàn)在是58頁\一共有104頁\編輯于星期四研究基因突變與疾病關(guān)系時應(yīng)注意的問題致病突變與基因多態(tài)性：基因中某種突變在人群中發(fā)生頻率>1%，屬于基因多態(tài)性，該突變?yōu)橹行酝蛔儭０l(fā)生頻率<1%則可能屬于致病突變，但須首先確證在人群中只在病患個體出現(xiàn)該突變，其次是在病患家系中也只有患病者出現(xiàn)該突變。單基因遺傳疾病與主要基因突變有關(guān)，如堿基置換、插入、缺失等多基因病涉及突變和候選易感基因數(shù)量眾多鑒定致病或與疾病相關(guān)的基因變異體是關(guān)鍵常見病稀有變異體常見變異體常見病現(xiàn)在是59頁\一共有104頁\編輯于星期四人類基因突變及疾病相關(guān)數(shù)據(jù)庫HMGD-HumanGeneMutationdbSVD-SequencevariationdbHGBASE-HumanGenicBi-AllelicSequencesdbTheSNPconsortium

dbSNP-Humansinglenucleotidepolymorphism(SNP)db

ListofmutationdatabasesfromOMIM

ListofmutationdatabasesfromIMT(Finland)

ADB-Albinismdb(Mutationsinhumangenescausingalbinism)Alpha-glucosidase-Informationabouthumanacidalpha-glucosidase(GSD-II)ARmutations-HumanandrogenreceptormutationdbAntithrombinmutationdb

AsthmaandAllergygenedb

現(xiàn)在是60頁\一共有104頁\編輯于星期四人類基因突變及疾病相關(guān)數(shù)據(jù)庫

TSC-TSC(TSC1/TSC2)variationdbTSC2-Cardiff-RotterdamTuberousSclerosis(TS)db(Tuberin;TSC2)TGDB-TumorgenedbVMD2mutation-HumanVMD2mutationdbvWFmutation-HumanvonWillebrandfactor(vWF)mutationdbWRN-HumanWRNmutationdb(Warnerdisease)WT1mutation-HumanWT1mutationdbX-ALDmutation-HumanABCD1mutationdb現(xiàn)在是61頁\一共有104頁\編輯于星期四人類基因突變及疾病相關(guān)數(shù)據(jù)庫OTCase-Humanornithinetranscarbamylase(OTCase)websiteCytochromeP450allelesnomenclature

p53mutationdb-UniversityofTokyop53mutationdbGermlinep53mutationdb-UniversityofPraguedbofgermlinep53mutationsPAHdb-Humanphenylalaninehydroxylase(PAH)mutationdbPAX6mutation-HumanPAX6mutationdbPrion-PrionandpriondiseasewebsiteRAG1base-HumanRAG1mutationdbRAG2base-HumanRAG2mutationdbRB1base-Humanretinoblastoma-associatedprotein(RB)mutationdbRetNet-RetinalInformationNetworkRetinaInternationalScientificNewsletter-InformationonRetinalgenes,proteinsanddiseases現(xiàn)在是62頁\一共有104頁\編輯于星期四人類基因突變及疾病相關(guān)數(shù)據(jù)庫FBN1mutation-Humanfibrillin1mutationdb(Marfansyndrome)G6PD-HumanG6PDdeficiencyresourceGaltmutation-Humangalactose-1-phosphateuridylyltransferasemutationdb(Galactosemia)HEXAdb-HumanHexosaminidaseAmutationdb(Tay-sachsdisease)IL2RGbase-HumanIL2RG(Interleukin-2receptorgamma)mutationdb(X-SCID)L1CAMmutation-HumanL1CAMmutationdbLDLRmutation-HumanLDLRmutationdb(Familialhypercholesterolemia)LQTSdb-LongQTsyndromedbNCF1base-HumanNCF1mutationdbNCF2base-HumanNCF2mutationdbNeuromusculardiseaseswebsite

NCL-NeuronalCeroidLipofuscinosesmutationdb現(xiàn)在是63頁\一共有104頁\編輯于星期四人類基因突變及疾病相關(guān)數(shù)據(jù)庫BIOMDB-DbofmutationscausingtetrahydrobiopterindeficienciesBLMbase-HumanBLMmutationdb(Bloomsnydrom)BTKbase-HumanBTKmutationdb(X-linkedagammaglobulinemia)CD40Lbase-HumanCD40ligandmutationdbCOL1/3mutation-HumanTypeIandIIIcollagenmutationdbCFTRmutation-Humancysticfibrosismutationdb(CFTR)EMDdb-HumanEmerin(EMD)mutationdb(Emery-Dreifussmusculardystrophy)KMeyeDB-EyediseasegenesdbFVIImutation-HumanFactorVIImutationdbHAMSTeRS-HumanFactorVIIImutationdb(HaemophiliaA)HAeMB-HumanFactorIXmutationdb(HaemophiliaB)現(xiàn)在是64頁\一共有104頁\編輯于星期四定點突變技術(shù)（想變就變）

定點突變：為了了解基因突變與其產(chǎn)物對個體表型的關(guān)系，有目的地在離體條件下制造位點特異突變。定點突變技術(shù)廣泛應(yīng)用與基因表達調(diào)控、遺傳和蛋白質(zhì)工程研究

定點突變技術(shù)包括：

各種核酸酶和突變劑制造突變技術(shù)

寡核苷酸介導(dǎo)的定點突變

PCR定點突變四、突變與遺傳工程技術(shù)現(xiàn)在是65頁\一共有104頁\編輯于星期四基因會發(fā)生突變，突變可以自發(fā)也可以誘發(fā)。但在加拿大生物化學(xué)家M·史密斯（1932-2000）發(fā)明定點突變法之前，突變株的產(chǎn)生必須經(jīng)由自然界或用化學(xué)等方法誘使基因體突變，這種突變屬于隨機突變。史密斯發(fā)明的定點突變法卻是有目的的，該法可經(jīng)由設(shè)計好的寡核苷酸，在任何一個基因片段上進行隨意或設(shè)計好的突變。也就是說，這種突變是預(yù)先設(shè)定好的，所以也有人將該法稱為"反遺傳法"。有意思的是，這一給生命科學(xué)研究及應(yīng)用

領(lǐng)域帶來革命性突破的方法，竟然是史密斯

和其同事在喝咖啡時閑聊出來的。

定點突變法不僅廣泛用于基因工程領(lǐng)域，還

可用于農(nóng)業(yè)培育抗蟲、抗病的良種，用于醫(yī)

學(xué)矯正遺傳病、治療癌癥等?，F(xiàn)在是66頁\一共有104頁\編輯于星期四定點突變

定點突變是指通過聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因組，也可以是質(zhì)粒）中引入所需變化（通常是表征有利方向的變化），包括堿基的添加、刪除、點突變等。定點突變能迅速、高效的提高DNA所表達的目的蛋白的性狀及表征，是基因研究工作中一種非常有用的手段?，F(xiàn)在是67頁\一共有104頁\編輯于星期四蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)決定其功能，二者之間的關(guān)系是蛋白質(zhì)組研究的重點之一。對某個已知基因的特定堿基進行定點改變、缺失或者插入，可以改變對應(yīng)的氨基酸序列和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，對突變基因的表達產(chǎn)物進行研究有助于人類了解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，探討蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)/結(jié)構(gòu)域。利用定點突變技術(shù)改造基因：如野生型的綠色熒光蛋白（wtGFP）是在紫外光激發(fā)下能夠發(fā)出微弱的綠色熒光，經(jīng)過對其發(fā)光結(jié)構(gòu)域的特定氨基酸定點改造，GFP能在可見光的波長范圍被激發(fā)（吸收區(qū)紅移），且發(fā)光強度比原來強百倍，甚至出現(xiàn)黃色熒光蛋白（YFP)，藍色熒光蛋白(BFP)等。定點突變技術(shù)的潛在應(yīng)用領(lǐng)域很廣，比如研究蛋白質(zhì)相互作用位點的結(jié)構(gòu)、改造酶的不同活性或者動力學(xué)特性，改造啟動子或者DNA作用元件，引入新的酶切位點，提高蛋白的抗原性或者是穩(wěn)定性、活性、研究蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，以及藥物研發(fā)、基因治療等等方面?，F(xiàn)在是68頁\一共有104頁\編輯于星期四BAL31核酸酶消化產(chǎn)生單/雙向突變體

________________________________BAL31是從海洋細菌Alteromonasespejianasp中分離到的鈣依賴性核酸酶。BAL31有：

3’—5’外切核酸酶活性從雙鏈DNA去除單鏈核苷酸。

5’—3’外切酶活性，有效切割單鏈DNA。消化單鏈DNA的內(nèi)切酶活性。能緩慢切割多種扭曲的

DNA底物兩種外切酶活性使BAL31能消化DNA的兩個末端以縮短雙鏈現(xiàn)在是69頁\一共有104頁\編輯于星期四BAL31消化產(chǎn)生雙向突變體限制酶U消化產(chǎn)生線性質(zhì)粒DNA在不同時間點進行BAL31消化已消化好的DNA片段重新環(huán)化現(xiàn)在是70頁\一共有104頁\編輯于星期四BAL31消化產(chǎn)生單向突變體限制酶A消化產(chǎn)生線性質(zhì)粒DNA在不同時間點進行BAL31消化已消化好的DNA片段進行限制酶B消化凝膠電泳純化靶DNA片段現(xiàn)在是71頁\一共有104頁\編輯于星期四凝膠電泳純化靶DNA片段將消化的靶DNA重新克隆進新質(zhì)粒載體現(xiàn)在是72頁\一共有104頁\編輯于星期四寡核苷酸介導(dǎo)的定點突變

______________________________TCAGGCT雜交退火DNA聚合酶（klenow）,4dNTPT4DNA連接酶ATP轉(zhuǎn)染大腸桿菌用32P-標記的寡核苷酸做雜交探針篩選噬菌斑，分離突變體現(xiàn)在是73頁\一共有104頁\編輯于星期四現(xiàn)在是74頁\一共有104頁\編輯于星期四寡核苷酸介導(dǎo)的定點突變Kunkel法在dut-，ung-F’大腸桿菌中培養(yǎng)重組M13噬菌體，制備單鏈模板DNA模板中尿嘧啶取代了胸腺嘧啶（20-30個尿嘧啶/模板）磷酸化的誘變寡核苷酸DNA聚合酶，dNTP，DNA連接酶轉(zhuǎn)染野生型大腸桿菌ung+被尿嘧啶取代的DNA鏈被降解由體外合成的DNA鏈所產(chǎn)生的噬斑現(xiàn)在是75頁\一共有104頁\編輯于星期四Kunkel法總結(jié)現(xiàn)在是76頁\一共有104頁\編輯于星期四硫代磷核苷酸誘變法原理：限制性核酸內(nèi)切酶AvaⅠ，

AvaⅡ，

BanⅢ，

HindⅡ，

NciⅠ，

PstⅠ，PvuⅠ等不能切割有硫代磷核苷酸衍生物取代正常核苷酸形成的DNA。

用硫代磷核苷酸如dCTPαS

及dNTPs,在DNA聚合酶催化和DNA連接酶作用下，形成異源dsDNA分子，再用NciⅠ消化該異源dsDNA分子，可獲的高效率的定點突變分子。特點：可獲得很高的突變率（點突變，缺失和插入突變）現(xiàn)在是77頁\一共有104頁\編輯于星期四硫代磷核苷酸誘變法流程雜交退火TCAGGCT硫化核苷酸，DNA聚合酶1.NciⅠ核酸酶2.核酸外切酶DNA聚合酶和連接酶轉(zhuǎn)化并篩選突變體現(xiàn)在是78頁\一共有104頁\編輯于星期四單點定點突變

Stratagene公司QuikChangeSite-directedMutagenesiskit準備突變的質(zhì)粒必須是從常規(guī)E.coli中經(jīng)純化試劑盒(Miniprep)或者氯化銫純化抽提的質(zhì)粒。設(shè)計一對包含突變位點的引物（正、反向），和模版質(zhì)粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循環(huán)延伸”(所謂的循環(huán)延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5’端終止，再經(jīng)過反復(fù)加熱褪火延伸的循環(huán)，這個反應(yīng)區(qū)別于滾環(huán)擴增，不會形成多個串聯(lián)拷貝)，正反向引物的延伸產(chǎn)物退火后配對成為帶缺刻的開環(huán)質(zhì)粒。DpnI酶切延伸產(chǎn)物，由于原來的模版質(zhì)粒來源于常規(guī)大腸桿菌，是經(jīng)dam甲基化修飾的，對DpnI敏感而被切碎（DpnI識別序列為甲基化的GATC，GATC在幾乎各種質(zhì)粒中都會出現(xiàn)，而且不止一次），而體外合成的帶突變序列的質(zhì)粒由于沒有甲基化而不被切開?，F(xiàn)在是79頁\一共有104頁\編輯于星期四操作

流程圖現(xiàn)在是80頁\一共有104頁\編輯于星期四后來推出的QuikChangeXLsite-directedmutagenesiskit則是針對大于8Kb的質(zhì)粒的定點突變的，通過優(yōu)化試劑特別是其感受態(tài)細胞（XL10-Gold），使得較大的質(zhì)粒的定點突變也一樣簡單。QuikChange由于操作簡單快速，效率高（>80%）而受到普遍歡迎，光是2012年的前9個月就有超過400篇發(fā)表的論文中用到這個產(chǎn)品?，F(xiàn)在是81頁\一共有104頁\編輯于星期四多位點定點突變在改造酶的活性或者動力學(xué)特性，研究蛋白之間的相互作用位點等研究過程中，單點突變不能滿足實驗的需要，重復(fù)進行單點突變也非常浪費時間。因而Stratagene公司又推出了QuikChangeMultiSite-DirectedMutagenesiskit。最多一次實驗可以引入5個定點突變。原理就是準備多個帶突變的引物（同方向，對同一單鏈模版），退火后全部突變引物（不超過5個）都結(jié)合在同一環(huán)狀單鏈模版，PfuTurbo聚合酶延伸，碰到下一個引物就停止，各片斷經(jīng)連接成環(huán)，和單鏈模版組成雜和環(huán)，DpnI消化雙鏈模版，也消化雜和環(huán)中的模版，只留下新合成的帶多個突變的單鏈環(huán)（mutantssDNA），得以轉(zhuǎn)化E.coli，形成雙鏈質(zhì)粒。資料表明，引入3個定點突變的效率為60%，5個定點突變的效率為30%。得到的其他質(zhì)粒是帶有較少定點突變的質(zhì)粒。這樣，一次實驗可以得到不同數(shù)目突變的質(zhì)粒，對于研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系也是有用的。現(xiàn)在是82頁\一共有104頁\編輯于星期四PCR定點突變

____________重疊延伸PCR誘變

試驗概要：擴增的DNA片段在預(yù)設(shè)突變處重疊(2次PCR)，再與兩個與原始片段互補的側(cè)翼引物進行第3次PCR特點：需兩個突變誘導(dǎo)引物，兩個側(cè)翼引物，3次PCR。誘變率極高大引物PCR定點誘變試驗概要：兩輪PCR，2個側(cè)翼引物，其中一個為預(yù)設(shè)突變引物，第一輪PCR后，大引物不需純化，第一輪退火溫度較低，第二輪較高（72℃）特點：簡單，經(jīng)濟，平均誘變效率可達80％現(xiàn)在是83頁\一共有104頁\編輯于星期四PCR原理示意圖現(xiàn)在是84頁\一共有104頁\編輯于星期四PA5’PA’5’PA5’PA’5’PA5’PA’5’PA5’PA’5’PB5’PC5’PA5’PB5’PA’5’PC5’5’5’PCR-1PCR-1PCR-2PCR-2混合，變性，退火重疊延伸PCR定點突變現(xiàn)在是85頁\一共有104頁\編輯于星期四5’5’5’5’PB5’PC5’5’5’PCR-3DNA聚合酶現(xiàn)在是86頁\一共有104頁\編輯于星期四現(xiàn)在是87頁\一共有104頁\編輯于星期四大引物PCR定點誘變5‘3’5‘3’引物2引物3PCR產(chǎn)生大引物引物1突變體PCR2現(xiàn)在是88頁\一共有104頁\編輯于星期四現(xiàn)在是89頁\一共有104頁\編輯于星期四五、突變的檢測

限制性片段長度多態(tài)性（restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP）單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single-strandconformationpolymorphism,SSCP

）等位基因特異性PCR（allelespecificPCR

）毛細管電泳法（capillaryelectrophoresis）測序（sequencing）DNA芯片（chip）現(xiàn)在是90頁\一共有104頁\編輯于星期四PCR-RFLP:多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)--限制性片段長度多態(tài)性(RestrictionfragmentlengthPolymorphism，RFLP)

原理：PCR產(chǎn)物－限制性內(nèi)切酶切－多態(tài)性分析，DNA發(fā)生重排后，酶切位點發(fā)生改變。

優(yōu)點：具有分辯率高，無需標記,重復(fù)性好，簡便快速直觀等。主要用于核酸變異性分析與比較,微生物的分群分型分亞型，癌基因分析，遺傳病的診斷等。

局限：只能應(yīng)用突變引起限制性酶切位點改變的情況下，一次只能完成一個特定位點突變篩選，檢測效率低。限制性片段長度多態(tài)性現(xiàn)在是91頁\一共有104頁\編輯于星期四PCR-RFLP原理示意現(xiàn)在是92頁\一共有104頁\編輯于星期四聚合酶鏈反應(yīng)一單鏈構(gòu)象多態(tài)性（

PCR-SSCP）