酶工程理論課ch9ch

酶（蛋白質(zhì)）工程云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院林潔主講linjie@第三部分

酶的應(yīng)用一、酶的應(yīng)用歷史幾千年前，我國祖先就已經(jīng)掌握釀酒、制醬、制飴等技術(shù)，并懂得利用麥麴治療消化不良釀酒——淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、酒化菌的細(xì)胞內(nèi)酶……制醬——蛋白酶……制飴——淀粉酶麥麴——酶與維生素不自覺地利用了各種酶的催化作用19世紀(jì)末期開始真正有目的地利用酶1894年，高峰讓吉（日本），利用米曲霉淀粉酶作為消化劑1908年，羅姆（德國）利用胰酶進(jìn)行皮革的軟化1908年，波伊定（法國）利用細(xì)菌淀粉酶進(jìn)行紡織品的褪漿1911年，華勒斯坦將木瓜蛋白酶用于啤酒的澄清酶（生物催化劑）具有專一性強(qiáng)、催化效率高和作用條件溫和等顯著特點(diǎn)，具有非常廣泛的應(yīng)用價值，隨著酶生產(chǎn)和改性技術(shù)的不斷完善，越來越多的新酶被人們發(fā)現(xiàn)或創(chuàng)造，并運(yùn)用于生產(chǎn)和實踐的各個領(lǐng)域二、酶的應(yīng)用領(lǐng)域和現(xiàn)狀1.酶在醫(yī)藥方面的應(yīng)用利用酶的催化特性進(jìn)行基本診斷藥物的研制和疾病的治療2.酶在食品方面的應(yīng)用食品保鮮食品加工生產(chǎn)改善食品的品質(zhì)和風(fēng)味3.酶在工業(yè)方面的應(yīng)用進(jìn)行原料處理生產(chǎn)各種工業(yè)產(chǎn)品加酶增強(qiáng)產(chǎn)品的使用效果4.酶在農(nóng)業(yè)方面的應(yīng)用農(nóng)產(chǎn)品保鮮農(nóng)產(chǎn)品加工農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量控制飼料加工5.酶在環(huán)保能源方面的應(yīng)用用酶進(jìn)行環(huán)境監(jiān)測用酶進(jìn)行廢水處理生產(chǎn)各種可生物降解材料生產(chǎn)各種新能源產(chǎn)品6.酶在生物技術(shù)（工程）方面的應(yīng)用核酸的合成、切割和拼接（基因工程）胰酶消化（細(xì)胞工程）細(xì)胞破壁、酶（蛋白質(zhì)）分子的改造（發(fā)酵工程、酶工程、蛋白質(zhì)工程）核酸雜交檢測技術(shù)、免疫檢測技術(shù)（分析檢測）第九章

酶在醫(yī)藥和生物技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用第一節(jié)酶在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用第二節(jié)酶在生物技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用第一節(jié)

酶在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用一、酶在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用方向疾病的診斷1.根據(jù)體內(nèi)酶活力的變化診斷疾病2.用酶測定體液中某些物質(zhì)的變化診斷疾病疾病的治療3.直接用酶進(jìn)行疾病的治療4.用酶的催化作用制造各種藥物5.以酶為靶標(biāo)設(shè)計新型藥物基本原理一般健康人體內(nèi)所含某些酶的量是恒定在某一范圍的；當(dāng)人患上某些疾病時，由于組織、細(xì)胞受到損傷或者代謝異常而引起體內(nèi)的某種或某些酶的活力發(fā)生相應(yīng)的變化1.根據(jù)體內(nèi)酶活力的變化診斷疾病轉(zhuǎn)氨酶是催化氨基酸與酮酸之間氨基轉(zhuǎn)移的一類酶，普遍存在于動物、植物組織和微生物中，心肌、腦、肝、腎等動物組織中含量較高，其中以谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）最為重要GPT（也稱為ALT）是催化谷氨酸與丙酮酸之間的轉(zhuǎn)氨作用，GPT則以肝臟中活力最大，當(dāng)肝臟細(xì)胞損傷時，GPT釋放到血液內(nèi)，于是血液內(nèi)酶活力明顯地增加，如測定GPT活力可診斷肝功能的正常與否，急性肝炎患者血清中GPT活力可明顯地高于正常人；GOT

（也稱為AST）是催化谷氨酸與草酰乙酸之間的轉(zhuǎn)氨作用。GOT以心臟中活力最大，其次為肝臟；測定GOT活力則有助于對心臟病變的診斷，心肌梗塞時血清中GOT活性顯示上升。谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶端粒酶（Telomerase）是催化端粒合成和延長的酶，可將端粒DNA加至真核細(xì)胞染色體末端，從而增強(qiáng)體外細(xì)胞的增殖能力；在人體的正常細(xì)胞內(nèi)（除了生殖細(xì)胞和干細(xì)胞等以外），端粒酶的生物合成和酶活性都受到抑制；而在分化程度降低的癌細(xì)胞中卻可以明顯地檢測到端粒酶的活性因此，可以通過測定體細(xì)胞內(nèi)的端粒酶活性，診斷細(xì)胞是否發(fā)生了癌變端粒酶基本原理人體在出現(xiàn)某些疾病時，由于代謝異?；蛘吣承┙M織器官受到損傷，就會引起體內(nèi)某些物質(zhì)的量或者存在部位發(fā)生變化；酶具有專一性強(qiáng)、催化效率高等特點(diǎn)，因此能夠利用酶來測定體液中某些物質(zhì)的含量變化，從而診斷某些疾病2.用酶測定體液中某些物質(zhì)的變化診斷疾病酶測定的物質(zhì)用途葡萄糖氧化酶葡萄糖測定血糖、尿糖，診斷糖尿病葡萄糖氧化酶+過氧化物酶葡萄糖測定血糖、尿糖，診斷糖尿病尿素酶尿素測定血液、尿液中尿素的量，診斷肝、腎病變谷氨酰胺酶谷氨酰胺測定腦脊液中谷氨酰胺的量，診斷肝硬化、肝昏迷膽固醇氧化酶膽固醇測定膽固醇含量，診斷高血脂癥等DNA聚合酶基因PCR技術(shù)診斷基因變異酶聯(lián)免疫吸附檢測范圍廣測定樣本中某種蛋白質(zhì)、病原體或細(xì)胞等糖尿病是由于人體中糖代謝發(fā)生異常，使血液中葡萄糖含量升高，甚至在尿液中也含有葡萄糖的一種疾病，糖尿病的診斷就是測定血液或者尿液中的葡萄糖含量葡萄糖氧化酶是一種催化葡萄糖與氧發(fā)生反應(yīng)生成葡萄糖酸和雙氧水的酶測定方法一：通過測定葡萄糖酸的生成量或氧的消耗量（氧電極或鉑電極）可以測算出樣品中的葡萄糖含量測定方法二：將上述反應(yīng)產(chǎn)物中，在加入過氧化物酶，該酶在氧氣和雙氧水存在的條件下，能將氧受體4-氨基安替吡啉氧化成紅色的醌類化合物；因此，能夠通過分光光度檢測顏色的深淺而測算出葡萄糖的含量葡萄糖氧化酶與糖尿病的診斷通過差異顯示技術(shù)（DDRT-PCR）可以獲得大體涵蓋了在一定發(fā)育階段某種細(xì)胞類型中所表達(dá)的全部mRNA的cDNA；將差別表達(dá)條帶中的DNA回收，擴(kuò)增至所需含量，進(jìn)行測序鑒定，從而對差異條帶鑒定分析，以便獲得差異表達(dá)的目的基因；最終用于研究疾病基因的差異表達(dá)研究。DNA聚合酶與基因差異的檢測DNA聚合酶逆轉(zhuǎn)錄酶免疫檢測技術(shù)的基本原理：抗原免疫動物能夠獲得特異的抗體特異的抗體能與抗原在體內(nèi)或體外發(fā)生反應(yīng)，形成抗原-抗體復(fù)合物ELISA與疾病的診斷抗原的種類：病原體：細(xì)菌、病毒、寄生蟲、衣原體……細(xì)胞蛋白質(zhì)：單純蛋白、脂蛋白、糖蛋白、核酸蛋白等小分子化合物：半抗原，與載體蛋白偶聯(lián)成為完全抗原利用抗原-抗體的特異性反應(yīng)可以檢測檢測樣本中是否存在某種抗原檢測樣本中是否存在某種抗體酶聯(lián)免疫吸附檢測（Enzyme-LinkedImmuno-SorbentAssay,ELISA）的基本原理：抗原與相應(yīng)抗體的特異性反應(yīng)大多數(shù)塑料能夠吸附蛋白質(zhì)（抗原或抗體多為蛋白質(zhì)成分）有些酶的催化反應(yīng)能夠成為顯色反應(yīng)，易于觀察和檢測加入基質(zhì)ELISAPlate酶標(biāo)板抗原專一性抗體酶聯(lián)二抗連結(jié)酶酶呈色不相關(guān)抗體2EELISA的技術(shù)方法間接法-測抗體夾心法-測抗原競爭法-測抗原ELISA的應(yīng)用樣本中病原體或其抗體的存在情況（感染性疾病病、病毒感染相關(guān)腫瘤的診斷）腫瘤的篩查機(jī)體內(nèi)大分子或小分子物質(zhì)的病理變化基本原理酶作為藥物能夠治療多種疾病，用于治療疾病的酶稱為藥用酶，藥用酶具有療效顯著、副作用小的特點(diǎn)，其應(yīng)用越來越廣泛3.用酶進(jìn)行疾病的治療藥用酶的應(yīng)用治療消化不良蛋白酶：胰蛋白酶、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶α-淀粉酶：麥芽淀粉酶、米曲霉淀粉酶脂肪酶糖化酶：特別是嬰兒飲奶后出現(xiàn)腹脹、腹瀉等治療各種炎癥蛋白酶：使炎癥部位的壞死組織溶解、增加組織通透性溶菌酶：作用于細(xì)菌的細(xì)胞壁，使病原菌、腐敗性細(xì)菌等溶解死亡治療輻射損傷超氧氧化歧化酶（SOD）：抗氧化、抗衰老、抗輻射藥用酶的應(yīng)用治療血栓性疾?。ㄈ苎ǎ┠蚣っ福║K）：激活纖溶酶原成為有溶解血纖維蛋白活性的纖溶酶納豆激酶：可以催化血纖維蛋白水解，同時可以激活纖溶酶原成為纖溶酶組織型纖溶酶原激活劑（t-PA）：溶纖功效強(qiáng)，特異性好治療出血性疾病凝血酶：催化血纖維蛋白原水解，生成不溶性的血纖維蛋白，促進(jìn)凝血抑肽酶：抑制人體的胰蛋白酶、纖溶酶、血漿及組織中血管舒緩素治療癌癥（腫瘤）L-天門冬酰胺酶：分解L-天冬氨酸，抑制癌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成L-天門冬酰胺酶（L-asparaginaseB,AsnB）能夠催化天冬酰胺水解，生成L-天冬氨酸和氨當(dāng)L-天門冬酰胺酶注射進(jìn)入人體后，L-天冬酰胺被分解清除：正常細(xì)胞可自身合成L-天冬酰胺，蛋白質(zhì)合成不受影響癌細(xì)胞缺乏L-天冬酰胺合成酶，蛋白合成受阻，癌細(xì)胞死亡L-天門冬酰胺酶對治療白血病有顯著療效，是第一種用于治療癌癥的藥用酶L-天門冬酰氨酶與白血病的治療基本原理酶在藥物制造方面的應(yīng)用是利用酶的催化作用將前體物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)樗幬?，特別在有光學(xué)活性的藥物的合成方面具有十分重要的價值4.用酶的催化作用制造各種藥物半合成抗生素就是將發(fā)酵獲得的抗生素經(jīng)過酶催化反應(yīng)或者化學(xué)反應(yīng)，使其結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，而獲得的具有新的特性和功效的一類抗生素青霉素?；甘窃诎牒铣煽股锏纳a(chǎn)上具有重要作用的一種酶可催化青霉素水解生成6-氨基青霉烷酸（6-APA）可催化頭孢霉素水解生成7-氨基頭孢烷酸（7-ACA）可催化酰基化反應(yīng)，又6-APA或7-ACA合成新型的青霉素或頭孢霉素青霉素酰化酶與半合成抗生素

6-APAasnucleus7-ACCAor7-ADCAasnucleus氨基酸是合成生物體蛋白質(zhì)、激素、酶及抗體的原料，因為在其分子結(jié)構(gòu)中都有不對稱碳原子存在，除甘氨酸外，氨基酸分子都具有光學(xué)活性，即具有L-型和D-型異構(gòu)體。氨基酸的構(gòu)型對其生物學(xué)活性具有重要的影響，在一般情況下只有L-型氨基酸具有生物活性。氨基酰化酶與L-氨基酸L-乙酰氨基酸L-氨基酸＋＋氨基?；富驹砻甘菣C(jī)體完成新陳代謝的關(guān)鍵催化劑，以酶為作用靶點(diǎn)時新藥研發(fā)的通常策略酶抑制劑是一類可以結(jié)合酶并降低其活性的分子；由于抑制特定酶的活性可以殺死病原體或校正新陳代謝的不平衡，許多相關(guān)藥物就是酶抑制劑酶激活劑是一類能夠與酶結(jié)合并增強(qiáng)酶活性的分子；這類分子常常在控制代謝的酶的協(xié)同調(diào)控中發(fā)揮作用5.以酶為靶標(biāo)設(shè)計或篩選新型藥物二、在醫(yī)藥領(lǐng)域使用酶的特點(diǎn)可以快速、簡便、準(zhǔn)確地診斷疾病可以安全、廉價和高效地進(jìn)行疾病治療，達(dá)到其他藥物難以達(dá)到的良好效果通過酶的催化作用，生產(chǎn)各種療效顯著、質(zhì)量較高、副作用少的藥物第二節(jié)

酶在生物技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用一、酶在基因工程中的應(yīng)用二、酶在細(xì)胞工程中的應(yīng)用三、酶在酶工程中的應(yīng)用四、酶在分析檢測中的應(yīng)用酶與重組DNA技術(shù)DNA重組技術(shù)的主要原理：就是應(yīng)用人工方法把生物的遺傳物質(zhì)分離出來，并在體外擴(kuò)增目的DNA片段，然后通過體外的DNA切割和拼接，將重組了的目的DNA導(dǎo)入某種宿主細(xì)胞或個體，從而改變它們的遺傳品性目的基因的制備——DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶DNA的切割——限制性內(nèi)切酶、DNA外切酶、堿性磷酸酶DNA的拼接——DNA連接酶、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶一、酶在基因工程中的應(yīng)用DNA聚合酶是一類催化DNA復(fù)制和修復(fù)DNA分子損傷的酶，主要包括了大腸桿菌DNA聚合酶I、大腸桿菌DNA聚合酶II、大腸桿菌DNA聚合酶III、T4DNA聚合酶、水棲耐熱菌（Thermusaquaticus）DNA聚合酶和嗜熱菌（

Pyrococcusfuriosus

）DNA聚合酶等DNA聚合酶的共同特點(diǎn)是：需要模板與引物不能起始新的DNA鏈的合成催化脫氧核苷三磷酸（dNTP）加到DNA鏈的3’-OH端合成的方向是從5’端至3’端在基因工程方面，DNA聚合酶主要用于PCR反應(yīng)進(jìn)行基因擴(kuò)增TaqDNA聚合酶、PfuDNA聚合酶熱變性、退火和延伸1.DNA聚合酶與目的基因的制備逆轉(zhuǎn)錄酶又稱依賴于RNA的DNA聚合酶，它以RNA為模板，以脫氧核苷三磷酸為底物，合成DNA該酶在基因工程中廣泛應(yīng)用于從mRNA反轉(zhuǎn)錄生成互補(bǔ)的DNA（cDNA），以獲得所需的目的基因片段，現(xiàn)在利用各種反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR），可以簡便、快速地獲得所需的基因RT-PCR反應(yīng)中需合成一段由15~30個bp組成的與模板RNA互補(bǔ)的PCR引物2.反轉(zhuǎn)錄酶與目的基因的制備限制性核酸內(nèi)切酶是一類在特定的位點(diǎn)上，催化雙鏈DNA水解的磷酸二酯酶，1968年由Meselson和Yuan在大腸桿菌細(xì)胞中首次發(fā)現(xiàn)，至今已發(fā)現(xiàn)300多種，已成為基因工程中必不可缺的常用工具酶限制性核酸內(nèi)切酶具有高度的專一性，表現(xiàn)在它能夠識別雙鏈DNA中的某些堿基的排列順序（稱為堿基識別順序），并且只能在某個特定位點(diǎn)上將DNA分子切開限制性核酸內(nèi)切酶的堿基識別順序一般由4~6個核苷酸組成，在基因工程中使用的限制性核酸內(nèi)切酶，其切割位點(diǎn)一般都在其識別順序之內(nèi)，切割DNA時，常產(chǎn)生兩條鏈上的切點(diǎn)是錯開的黏性末端，有的產(chǎn)生的是平整末端3.限制性核酸內(nèi)切酶與DNA的切割DNA外切核酸酶是一類從脫氧核糖核酸（DNA）分子末端開始逐個除去末端核苷酸的酶，這些酶中有些可以從DNA鏈的5’端開始作用，有些從3’端開始作用，有些則可同時作用于5’端和3’端在基因工程中，該類酶可用于DNA的小型化，但更多的是用于將獲得的DNA片段的平整末端加工生成利于DNA重組的黏性末端4.DNA外切核酸酶與黏性末端的產(chǎn)生堿性磷酸酶可以除去DNA或RNA鏈中的5’-磷酸，在基因工程中為防止質(zhì)粒DNA的自我環(huán)化而除去5’-磷酸，或在用32P對DNA或RNA進(jìn)行5’-磷酸標(biāo)記之前除去5’-磷酸是主要使用該酶5.堿性磷酸酶與DNA的去磷酸化DNA連接酶是1967年發(fā)現(xiàn)的能使雙鏈DNA的缺口封閉的酶，它催化DNA片段的5’-磷酸基與另一DNA片段的3’-羥基生成磷酸二酯堿在基因工程中，主要采用的是T4DNA連接酶，該酶是由T4噬菌體感染大腸桿菌細(xì)胞后產(chǎn)生的，可用于具有黏性末端的兩個DNA片段的連接，也可用于平整末端的兩個DNA片段的連接，故此可將由同一種限制性內(nèi)切酶切出的載體DNA和目的基因連接起來，成為重組DNA6.DNA連接酶與重組載體的連接酶與細(xì)胞工程細(xì)胞工程主要是以細(xì)胞為基本單位，在體外條件下進(jìn)行培養(yǎng)和繁殖；或是應(yīng)用現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的理論與方法，在細(xì)胞整體水平或細(xì)胞器水平上人為地使細(xì)胞的某些生物學(xué)特性按照人們的意愿發(fā)生改變，從而獲得新型生物品種或細(xì)胞產(chǎn)品的技術(shù)過程酶與細(xì)胞的體外培養(yǎng)酶與原生質(zhì)體的制備二、酶在細(xì)胞工程中的應(yīng)用胰蛋白酶是從動物胰臟分離的一種水解酶，它能使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解，從而起到解離、分散細(xì)胞的作用；是細(xì)胞培養(yǎng)中常用的工具酶1.胰蛋白酶與動物細(xì)胞的體外培養(yǎng)在制備原生質(zhì)體是，既要除去細(xì)胞壁，又要不損傷其他成分，這樣就不能采用激烈的細(xì)胞壁破碎方法，而只能利用各種具有專一性的酶根據(jù)不同細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞壁組分的不同，除去細(xì)胞壁時所采用的酶也有區(qū)別2.用酶除去細(xì)胞壁與原生質(zhì)體的制備植物細(xì)胞壁的破除植物細(xì)胞的細(xì)胞壁組成植物細(xì)胞壁主要有纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和果膠等組成破除植物細(xì)胞壁主要采用纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶組成的混合酶酶與酶工程、蛋白質(zhì)工程酶工程就是從應(yīng)用的目的出發(fā)，研究酶，生產(chǎn)酶，改造酶，并利用酶的催化功能來生產(chǎn)人類所需產(chǎn)品或?qū)崿F(xiàn)人類需求的技術(shù)過程蛋白質(zhì)工程，又被稱為是第二代基因工程，它是在基因工程的基礎(chǔ)上，結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)、計算機(jī)輔助設(shè)計和蛋白質(zhì)化學(xué)等多學(xué)科的基礎(chǔ)知識，通過對基因的人工定向改造等手段，從而達(dá)到對蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾、改造、評價以產(chǎn)生能滿足人類需要的新型蛋白質(zhì)的技術(shù)酶在酶（蛋白質(zhì)）的生產(chǎn)提取中應(yīng)用酶在酶（蛋白質(zhì)）的改性中的應(yīng)用三、酶在酶工程中的應(yīng)用利用重組DNA技術(shù)高效表達(dá)目的酶或蛋白質(zhì)酶在胞內(nèi)酶（蛋白質(zhì)）的提取中的應(yīng)用除在體液中提取酶（蛋白質(zhì)）或胞外酶（蛋白質(zhì)）外，對于大多數(shù)的胞內(nèi)酶而言，一般都要選用適當(dāng)?shù)姆椒?，將含目的酶的生物組織破碎，促使能最大程度地提高抽提液中酶的濃度根據(jù)細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，添加適當(dāng)?shù)拿缸饔糜诩?xì)胞，使細(xì)胞壁破壞，并在低滲溶液中，使細(xì)胞破裂，從而完成酶（蛋白質(zhì)）的提取，該法破碎效果好根據(jù)不同細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞壁組分的不同，除去細(xì)胞壁時所采用的酶也有區(qū)別1.酶在酶和蛋白質(zhì)生產(chǎn)中的應(yīng)用除去細(xì)菌細(xì)胞壁革蘭氏陽性細(xì)菌——溶菌酶——肽聚糖分子中N-乙酰胞壁酸與N-乙酰氨基葡萄糖之間的β-1,4鍵革蘭氏陰性細(xì)菌——溶菌酶+EDTA——EDTA作用于脂多糖除去霉菌細(xì)胞壁酵母的細(xì)胞壁組成不同種屬的酶菌，其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和組分有較大差別，一般在除去細(xì)胞壁前應(yīng)弄清屬于什么霉菌毛霉、根酶等藻菌綱霉菌：幾丁質(zhì)和殼多糖等多種物質(zhì)組成，使用放線菌和細(xì)菌產(chǎn)生的殼多糖酶、幾丁質(zhì)酶及蛋白酶等多種酶的混合物米曲霉、黑曲霉和青霉等半知菌綱霉菌：幾丁質(zhì)和β-葡聚糖等，主要使用β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶的混合物除去酵母細(xì)胞壁酵母的細(xì)胞壁組成外層：磷酸甘露糖和蛋白質(zhì)組成（使用磷酸甘露糖酶）內(nèi)層：β-葡聚糖構(gòu)成細(xì)胞壁的骨架（使用β-1,3-葡聚糖酶）酵母細(xì)胞的破壁——磷酸甘露糖酶+β-1,3-葡聚糖酶

酶的改性就是指通過各種方法使酶的催化特性得以改進(jìn)的技術(shù)過程蛋白質(zhì)的改造就是指以蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能關(guān)系的知識為基礎(chǔ)，通過周密的分子設(shè)計，把蛋白質(zhì)改造為合乎人類需要的新的突變蛋白質(zhì)基因工程法改造酶（蛋白質(zhì)）——如定點(diǎn)突變技術(shù)進(jìn)行氨基酸置換酶（蛋白質(zhì)）分子的主鏈修飾2.酶在酶和蛋白質(zhì)改性中的應(yīng)用蛋白酶與酶的主鏈切斷修飾亮氨酸氨肽酶與木瓜蛋白酶的修飾木瓜蛋白酶（Papain），簡稱木瓜酶，又稱為木瓜酵素含有木瓜蛋白酶的藥物，能起到抗癌、腫瘤、淋巴性白血病、原菌和寄生蟲、結(jié)核桿菌等，可消炎、利膽、止痛、助消化。治療婦科病、青光眼、骨質(zhì)增生、槍刀傷口愈合、血型鑒別、昆蟲叮咬等存在于木瓜胚乳中的蛋白酶，利用未成熟的番木瓜果實中的乳汁，采用提取分離技術(shù)制得純酶制品，作為植物來源的蛋白酶，具有一定的抗原性，能誘導(dǎo)機(jī)體對其產(chǎn)生免疫應(yīng)答，從而使機(jī)體對其產(chǎn)生抵抗，最終可能導(dǎo)致藥效的下降或藥物過敏反應(yīng)用亮氨酸氨肽酶進(jìn)行有限水解，能夠除去木瓜蛋白酶2/3的肽鏈，該酶的活力基本保持，但其抗原性大大降低酶與生物技術(shù)中的分析檢測在生物技術(shù)的研究和工作中，經(jīng)常要進(jìn)行分析和檢測工作，主要包括了：目的基因的檢測（DNA的檢測）——PCR、Southern-blotting目的基因的轉(zhuǎn)錄檢測（mRNA的檢測）——RT-PCR、Northern-blotting目的基因的表達(dá)檢測（蛋白質(zhì)的檢測）——ELISA、Western-blotting生物分子的檢測（小分子、生物大分子）——ELISA、Western-blotting酶與常用的分析檢測技術(shù)PCR、RT-PCR（DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶）Southern-blotting、Northern-blotting（堿性磷酸化酶、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶）ELISA、Western-blotting（辣根過氧化物酶、堿性磷酸化酶）四、酶在分析檢測中的應(yīng)用Southern-blotting和Northern-blotting都屬于核酸雜交檢測技術(shù)，它是利用DNA與DNA、或DNA與RNA之間能夠在體外互補(bǔ)雜交的特性，利用標(biāo)準(zhǔn)的DNA探針檢測樣本中是否含有相應(yīng)的DNA或RNA組分，因此，能夠方便檢測的標(biāo)記DNA探針是必不可少的常用的標(biāo)記物有：放射性同位素和熒光物質(zhì)使用放射性同位素32P標(biāo)記核酸探針的5’-末端時，常用堿性磷酸化酶進(jìn)行前處理在使用放射性同位素或熒光物質(zhì)標(biāo)記核酸探針使，也可用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶將已經(jīng)標(biāo)記的核苷酸依次附加到探針的3’-末端1.酶與核酸雜交檢測技術(shù)中核酸探針的標(biāo)記Southern-blotting&Northern-blotting末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminaldeoxynucleotidetransferase,TDT）從小牛胸腺中分離得到，其作用是向DNA的3’-OH末端轉(zhuǎn)移脫氧核苷酸在基因工程中利用該酶給DNA片段加上一段同聚體，形成附加末端；也可采用32P或者熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸進(jìn)行3’端標(biāo)記，以便于DNA的分離檢測末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶與DNA的標(biāo)記根據(jù)抗原-抗體反應(yīng)的基本原理和特點(diǎn)，免疫檢測技術(shù)常被用于：用已知抗原檢測未知抗體用已知抗體檢測未知抗原定性或定量檢測體內(nèi)各種生物大分子物質(zhì)（蛋白質(zhì)、多糖、脂）或小分子物質(zhì)（藥物、激素、活性肽）2.酶與免疫檢測技術(shù)辣根過氧化物酶（Horeradishperoxidase,HRP）酶聯(lián)免疫吸附分析法(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay,

ELISA)加入基質(zhì)ELISAPlate酶標(biāo)板抗原專一性抗體酶聯(lián)二抗連結(jié)酶酶呈色不相關(guān)抗體2EWestern-blotting由于辣根過氧化物酶(HorseradishPeroxidase,HRP)比活性高，穩(wěn)定，分子量小，純酶容易制備，所以最常用。HRP廣泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由無色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉結(jié)合而成的糖蛋白

HRP的催化反應(yīng)需要底物過氧化氫(H2O2)和供氫體(DH2)，供氫體多為無色的還原型染料，通過反應(yīng)可生成有色的氧化型染料(D)，供氫體的種類很多，形成的產(chǎn)物特點(diǎn)不一：DAB(3.3－二氨基聯(lián)苯胺)的反應(yīng)產(chǎn)物為不溶性沉淀物，并有電子密度，故適宜于做免疫酶染色或電鏡觀察目前用得較廣泛和較滿意的供氫體是：OPD(鄰苯二胺)和TMB(四甲基聯(lián)苯胺)，前者形成的產(chǎn)物為深桔黃色或棕色，后者產(chǎn)物為藍(lán)綠色，二者的可溶性均好，在避光處顏色穩(wěn)定，空白可近于無色辣根過氧化物酶酶聯(lián)免疫的測試結(jié)果陽性

陰性加2M硫酸終止反應(yīng)第十章

酶反應(yīng)器與酶傳感器第一節(jié)酶反應(yīng)器第二節(jié)酶傳感器第一節(jié)

酶反應(yīng)器一、酶生物反應(yīng)器的基本概念酶反應(yīng)器