基因突變和損傷DNA的修復(fù)

第3章基因突變與損傷DNA的修復(fù)

現(xiàn)在是1頁\一共有70頁\編輯于星期三基因突變的類型和符號常用的幾個突變株突變發(fā)生的機(jī)理(自發(fā)突變，誘發(fā)突變)保證遺傳穩(wěn)定的機(jī)制(損傷DNA的修復(fù))現(xiàn)在是2頁\一共有70頁\編輯于星期三第一節(jié)基因突變的類型和符號一、基因的符號

nodA（nodule結(jié)瘤基因Ａ）;nifA（nitrogenfixation固氮基因Ａ）;

trpA,trpB（tryptophan色氨酸）;

trpA23,trpA46

（同一基因的不同突變位點(diǎn)）;現(xiàn)在是3頁\一共有70頁\編輯于星期三leu-,strr;(營養(yǎng)缺陷，抗性)lacZ-

;(表型符號為正體LacZ);Δ(lac,pro);（缺失）trpA::Tn5

;（插入）E.coliJM109;

E.coliDH5α;

（菌株）E.coliJM109Δ(lac,proAB)trpA::Tn5

現(xiàn)在是4頁\一共有70頁\編輯于星期三二、基因突變的類型按照突變體表型特征不同分類：１、形態(tài)突變型，例如現(xiàn)在是5頁\一共有70頁\編輯于星期三２、營養(yǎng)缺陷型Ade-

３、抗性突變型Strr

４、致死突變型

5、條件致死突變型

6、產(chǎn)量突變型現(xiàn)在是6頁\一共有70頁\編輯于星期三按照突變所引起的遺傳信息的改變分類：１、錯義突變同一位置上的氨基酸改變

GAA(E)→AAA(K)

２、同義突變同一位置上的氨基酸不變

GAA(E)→GAG(E)３、無義突變堿基突變后形成終止密碼子

GAA(E)→UAA(stop)現(xiàn)在是7頁\一共有70頁\編輯于星期三現(xiàn)在是8頁\一共有70頁\編輯于星期三１、堿基置換轉(zhuǎn)換PyPy

PuPu

顛換PyPu轉(zhuǎn)換比顛換更常見按照遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變分類：現(xiàn)在是9頁\一共有70頁\編輯于星期三２、移碼突變（編碼區(qū)）ATCGAATTCGGGTATTTAATCGAATTCGGGTATTTACGAATCCGAATTCGGGTATTTAATCCGGAATTCGGGTATTTAATCCGAGAATTCGGGTATTTA現(xiàn)在是10頁\一共有70頁\編輯于星期三３、DNA片段插入和缺失

DNA大片段的缺失或重復(fù)，在放線菌中缺失范圍從幾個基因到幾十個基因?，F(xiàn)在是11頁\一共有70頁\編輯于星期三第二節(jié)常用的幾個突變株營養(yǎng)缺陷突變株溫度敏感突變株抗性突變株現(xiàn)在是12頁\一共有70頁\編輯于星期三例：供體E.coli(HfrStrs)受體E.coli(F-Thr-Leu-Thi-Strr)在含有鏈霉素和硫胺素的基本培養(yǎng)基只能分離到蘇氨酸和亮氨酸的重組子現(xiàn)在是13頁\一共有70頁\編輯于星期三第三節(jié)突變發(fā)生的機(jī)理

(自發(fā)突變，誘發(fā)突變)

現(xiàn)在是14頁\一共有70頁\編輯于星期三１、自發(fā)突變

·堿基異構(gòu)式引起DNA復(fù)制過程的錯誤

a)堿基異構(gòu)式

C(氨基)C(亞氨基)

A(氨基)A(亞氨基)

G(酮式)G(烯醇式)

G(酮式)

G(烯醇式)

T(酮式)

T(烯醇式-2’)orT(烯醇式-4’)

1,65,6現(xiàn)在是15頁\一共有70頁\編輯于星期三現(xiàn)在是16頁\一共有70頁\編輯于星期三OH現(xiàn)在是17頁\一共有70頁\編輯于星期三現(xiàn)在是18頁\一共有70頁\編輯于星期三b)堿基異構(gòu)式引起DNA復(fù)制的錯配

現(xiàn)在是19頁\一共有70頁\編輯于星期三A(a)

T(k)

G(k)C(a)

正確配對錯誤配對

G(k)T(e)

A(a)

C(i)

A(i)

C(a)

G(e)

T(k)

現(xiàn)在是20頁\一共有70頁\編輯于星期三A(a)

T(k)

C(i)

A(a)

C(i)

C(a)G(k)例如：環(huán)出效應(yīng)轉(zhuǎn)座子現(xiàn)在是21頁\一共有70頁\編輯于星期三環(huán)出效應(yīng)現(xiàn)在是22頁\一共有70頁\編輯于星期三２、誘發(fā)突變

2-1物理誘變a)電離輻射誘變；

Co60(χ)(γ)ray

Cs137(χ)(γ)ray

H3(α)ray

P32,,S35(β)ray

衛(wèi)星搭載誘變；

高真空，強(qiáng)輻射，微重力

(χ)(γ)ray穿透性

（外照射處理）

(α)(β)ray非穿透性

（內(nèi)標(biāo)記處理）

dNTP電荷及結(jié)構(gòu)改變

現(xiàn)在是23頁\一共有70頁\編輯于星期三電離輻射引起DNA損傷的機(jī)理現(xiàn)在是24頁\一共有70頁\編輯于星期三b)非電離輻射—UltraVioletlight(U.V)---pyrimidinedimer(TTdimer)isgeneratedbycovalentlinks

betweenadjacentTT

∧現(xiàn)在是25頁\一共有70頁\編輯于星期三2-2生物技術(shù)定點(diǎn)誘變

現(xiàn)在是26頁\一共有70頁\編輯于星期三PCR原理解鏈退火延伸現(xiàn)在是27頁\一共有70頁\編輯于星期三基因的定點(diǎn)誘變

oligo-dNt介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變

合成與目標(biāo)基因某區(qū)段互補(bǔ)并含突變位點(diǎn)的oligo-dNt

現(xiàn)在是28頁\一共有70頁\編輯于星期三突變oligo-dNt引物介導(dǎo)的PCR誘變目標(biāo)基因克隆到質(zhì)粒中分為兩管

每管加入2個特定引物一個與基因內(nèi)某一區(qū)段互補(bǔ)（2，4）一個含突變堿基并與欲突變位點(diǎn)互補(bǔ)（1，3）

PCR產(chǎn)物混合變性、復(fù)性轉(zhuǎn)化E.coli現(xiàn)在是29頁\一共有70頁\編輯于星期三PfuDNApolymerasefromPyrococusfuriosus(火球菌屬)

具有3’→5’exonuclease活性，校正復(fù)制時堿基的錯配復(fù)制高保真，聚合長度

兩引物5’端連接其中引物1中含欲突變的堿基

Pfu-PCR直接誘變法現(xiàn)在是30頁\一共有70頁\編輯于星期三引物2合成的新生鏈不會使引物1靶序列發(fā)生替代

未被引物2擴(kuò)增的DNA，含有未突變的酶切位點(diǎn)，經(jīng)酶解后成線狀，轉(zhuǎn)化E.coli不能穩(wěn)定存在

改進(jìn)型引物的PCR誘變

目標(biāo)基因克隆到M13載體提取單鏈DNA為模板

設(shè)計兩引物分別與模板不同區(qū)段互補(bǔ)

引物1與目標(biāo)基因互補(bǔ)，含一突變堿基，并5’端磷酸化

引物2含一酶切位點(diǎn)，并造成酶切位點(diǎn)突變

12現(xiàn)在是31頁\一共有70頁\編輯于星期三兩通用引物（commonP1&commonP2）

設(shè)計兩突變引物（mut.P1&mut.P2）

第一次兩種PCR產(chǎn)物混合，變性，復(fù)性

其中一對雙鏈分子不能進(jìn)行第二次PCR

另一對雙鏈分子的PCR產(chǎn)物為誘變基因

引物重疊延伸的PCR誘變

cP1

mP1mP2cP2現(xiàn)在是32頁\一共有70頁\編輯于星期三基于PCR的隨機(jī)誘變目標(biāo)基因克隆于含兩酶切位點(diǎn)（REA,B）的質(zhì)粒載體REA,B酶切克隆子，exonucleaseIII酶解目標(biāo)基因3’斷口的單鏈Klenow片段dNTP一種堿基類似物（誘變劑）在聚合DNA過程中隨機(jī)造成誘變現(xiàn)在是33頁\一共有70頁\編輯于星期三

DNAshuffling技術(shù)的基因誘變Mutants.

Digestionligation

transformationselection現(xiàn)在是34頁\一共有70頁\編輯于星期三2-3化學(xué)誘變a)干擾堿基合成的化學(xué)誘變劑6-Mercaltopurine5-AminoUracil5-氨基尿嘧啶(5-AU)和6-氮嘌呤(6-NP)

現(xiàn)在是35頁\一共有70頁\編輯于星期三b)堿基類似物導(dǎo)致的堿基錯配(5-BrU)BrBr現(xiàn)在是36頁\一共有70頁\編輯于星期三5-BrU(k)

5-BrU(e)ReplicationBrU(k)BrU(e)ATGC復(fù)制錯誤A/TG/C摻入錯誤G/C

A/T現(xiàn)在是37頁\一共有70頁\編輯于星期三A(a)T(k)5-BrU(k)G(k)5-BrU(e)C(a)mispairingmispairingT(k)A(a)5-BrU(k)G(k)C(e)5-BrU(e)A(a)G(k)G(k)A(a)復(fù)制錯誤摻入錯誤5-BrU(k)5-BrU(e)現(xiàn)在是38頁\一共有70頁\編輯于星期三5-BrU(k)

5-BrU(e)ReplicationBrU(k)BrU(e)GC復(fù)制錯誤A/T

G/C摻入錯誤G/C

A/TInDNABrU(k)>BrU(e)(normal)(isoform)BrU(k)

BrU(e)難易AGGATCCT>現(xiàn)在是39頁\一共有70頁\編輯于星期三HNO2(NitrousacidNA)

ACGHypoxanghineCUracilAXanthineCdeamination

HNO2

堿基修飾引起的化學(xué)突變現(xiàn)在是40頁\一共有70頁\編輯于星期三羥胺的致突變作用NH2OH(HydroxylamineHA羥胺)C(羥化)A(a)OHNH羥化胞嘧啶

GCAT現(xiàn)在是41頁\一共有70頁\編輯于星期三d)烷化劑EMS(Ethylmethanesulfanate)CH3—S—O--CH2CH3OOMMSCH3—S—O--CH3OOSM(SulfurMustardsgas硫芥子氣)HSCH2CH2ClCH2CH2Cl現(xiàn)在是42頁\一共有70頁\編輯于星期三甲基化現(xiàn)在是43頁\一共有70頁\編輯于星期三誘變效應(yīng)；使堿基多處發(fā)生烷化，導(dǎo)致DNA結(jié)構(gòu)變異敏感位點(diǎn)H2NOOOCTN3,C4-NN3,C4-OAGN1,N3,C6-N,N7,C8N1,C2-N,N3,C6-O,N7,C8H2NONHH現(xiàn)在是44頁\一共有70頁\編輯于星期三

Apurination(de-pu)脫嘌呤作用CH3CH2GMPCH3CH2-OC6-O-烷基嘌呤=TC4-O-烷基胸腺嘧啶=GG

GCH2CH2—S--CH2CH2H烷化堿基電離異構(gòu)式錯配多功能烷化劑DNA分子交聯(lián)畸變GXTO7-烷基鳥嘌呤現(xiàn)在是45頁\一共有70頁\編輯于星期三e)嵌合劑和移碼突變AO(AcridineOrange)扁平分子EB(EthidiumBromide)-ATTTTTCG--TAAAAAGC--ATTTCG--TAAAGC-TAOT-ATEBTTTTCG--TA分子插入異相退火AOEB-ATTTCG--TAAAGC--ATX’TTTTCG--TAXAAAAGC-----AAAAA-----AAAAATTTTT------TTTTT----AAAAA--TTTTT--AAAAA--TTTTT-RE---AAAAA------TTTTT------AAAAAA------TTTTTT---+重組XAAAAGC-TA現(xiàn)在是46頁\一共有70頁\編輯于星期三第四節(jié)保證遺傳穩(wěn)定的機(jī)制（損傷DNA的修復(fù)）現(xiàn)在是47頁\一共有70頁\編輯于星期三復(fù)制過程中的錯配修復(fù)DNA的損傷修復(fù)基因的回復(fù)突變密碼的簡并致死突變多倍體……復(fù)制過程中的錯配修復(fù)機(jī)制(ξ=10-11)DNAmismatch+-----A------------C---DNApol(ξ=10-8)經(jīng)第二次校正ξ=10-11MRSMismatchRepairSystem注：polI具有3'--5'的核酸外切酶活性（瞬時，廣義上的校對和修復(fù)功能）現(xiàn)在是48頁\一共有70頁\編輯于星期三1、DNA的復(fù)制修復(fù)

1-1MismatchrepairsystemDNApolymeraseligaseMCE(mismatchcorrectenzyme)3subunitsmutH,L,Sdamgenem6A甲基化酶Scanning新生鏈中錯配堿基識別新生鏈中非m6A的GATC序列酶切含錯配堿基的新生DNA區(qū)段現(xiàn)在是49頁\一共有70頁\編輯于星期三MCEscanningDNA中的GATC(palindromicseq.)

為m6A甲基化敏感位點(diǎn)平均每2kb左右有一GATCseq.3’-------C----------CTAG----------CTAG----5’

5’-----------T----------GATC----------GATC----3’

3’-------------------------------------------------------

5’少梯度多（m6A）新生鏈現(xiàn)在是50頁\一共有70頁\編輯于星期三MCEscanningendonucleasePolymeraseligaseGATCGATCCTAGCTAGTCGATCGATCCTAGCTAGTGATCGATCCTAGCTAGTA現(xiàn)在是51頁\一共有70頁\編輯于星期三1-２(尿嘧啶-)N-糖苷酶系統(tǒng)---TAGC------ATCG------TAGC------ATG---U---TAGC---ung-aseGTUAU---TAGC------ATG---Apurinase(內(nèi)切酶)---TAGC------ADNApolligaseTCG---現(xiàn)在是52頁\一共有70頁\編輯于星期三現(xiàn)在是53頁\一共有70頁\編輯于星期三光復(fù)活酶471aa2、DNA的損傷修復(fù)2-1光復(fù)活----TT--------AA--------TT--------AA--------TT--------AA--------TT--------AA----可見光激活現(xiàn)在是54頁\一共有70頁\編輯于星期三2-2切除修復(fù)BeforeReplicationError-freeUvrA,B,CgeneEndonucleasesExonucleaseDNApolLigase切除修復(fù)步驟：識別DNA鏈中的損傷部位損傷部分被切離修復(fù)現(xiàn)在是55頁\一共有70頁\編輯于星期三現(xiàn)在是56頁\一共有70頁\編輯于星期三現(xiàn)在是57頁\一共有70頁\編輯于星期三動畫現(xiàn)在是58頁\一共有70頁\編輯于星期三E.coli

存活%U.V計量w.t.uvrA+recA+recA+

uvra-recA-

uvrA-recA.gene

以某種方式參與DNA損傷修復(fù)2-3重組修復(fù)現(xiàn)在是59頁\一共有70頁\編輯于星期三

重組修復(fù)

(strandtransferrepair)Afterreplicationrepair

RecA,DNApolymeraeligasegenesbeneeded現(xiàn)在是60頁\一共有70頁\編輯于星期三2-4

SOS修復(fù)JeanWeagleE.coliE.coliE.coliλ8010100mut.100%50%10%

E.coli中噬菌體損傷的DNA被修復(fù)AU.V.誘導(dǎo)了E.coli

的SOS修復(fù)(A&B)SOS修復(fù)高頻率的突變(Error-prone)ABC現(xiàn)在是61頁\一共有70頁\編輯于星期三DNAdamaged300XsignalRecAcleavesLexA

SOSUmnCmutation---Beforeinducing.LexA-p

Rec-A,UmuC…11genesNeg.repression---U.V.damageDNASignal(S.S.DNAtailor5NtS.S.DNA)一般lexA基因產(chǎn)物是阻遏蛋白LexA蛋白抑制自身基因的表達(dá)LexA蛋白阻遏SOS基因的表達(dá)RecA高效表達(dá)LexA過表達(dá),但多數(shù)被RecA降解SOS基因表達(dá)機(jī)制現(xiàn)在是62頁\一共有70頁\編輯于星期三現(xiàn)在是63頁\一共有70頁\編輯于星期三RecA-P;三種功能●DNA重組活性●與S.S.DNA結(jié)合活性●少數(shù)蛋白的proteinase活性當(dāng)DNA正常復(fù)制時（無復(fù)制受阻，無DNA損傷，無TTdimer）

RecA-p不表現(xiàn)proteinase活性現(xiàn)在是64頁\一共有70頁\編輯于星期三當(dāng)DNA復(fù)制受阻/DNAdamaged能量大量消耗細(xì)胞內(nèi)原少量表達(dá)的RecA-p與S.S,DNA結(jié)合激活RecA-p的proteinase活性修復(fù)損傷LexA-p降解RecA-p高效表達(dá)300timesupSOSopen現(xiàn)在是65頁\一共有70頁\編輯于星期三當(dāng)DNA復(fù)制度過難關(guān)后SOSrepair是一種error-prone極強(qiáng)的修復(fù)機(jī)制是進(jìn)化中形成的“竭盡全力，治病救人”的措施（正常狀態(tài)下，SOS是關(guān)閉的）RecA-p很快消失L