基因工程原理 動物細胞的基因轉移

動物細胞的基因轉移

1現在是1頁\一共有41頁\編輯于星期三Introduction動物細胞的基因轉移已應用了40多年研究基因功能和調控或者生產大量的重組蛋白哺乳動物細胞系，桿狀病毒表達系統體內基因治療不同于轉基因動物2現在是2頁\一共有41頁\編輯于星期三動物細胞基因轉移的策略直接DNA轉移

顯微注射，基因槍轉染技術

利用化學和物理技術誘導細胞從外界環(huán)境攝取DNA病毒介導——轉導細菌介導——細菌感染3現在是3頁\一共有41頁\編輯于星期三轉染技術化學方法

（不同的方法有相似的原理）DNA/磷酸鈣共沉淀法

其他化學方法

脂質體轉染物理方法

（有多樣的機制）

電穿孔，顯微注射，基因槍4現在是4頁\一共有41頁\編輯于星期三DNA/磷酸鈣共沉淀法HPRT缺陷型的細胞DNA/磷酸鈣共沉淀為復合物，積累到細胞膜上，然后再由細胞攝取到內部，并轉運到細胞核，DNA釋放并得到表達沉淀物要現用現配沉淀物必須包裹細胞，只適用于單層生長的細胞，而不適用懸浮或成團生長的細胞轉染效率低5現在是5頁\一共有41頁\編輯于星期三6現在是6頁\一共有41頁\編輯于星期三其他的化學轉染方法二乙氨乙基葡聚糖(DEAE-dextran)

可溶性聚陽離子糖類，可以促進DNA與胞吞相互作用瞬時轉染效率很高，但不能形成穩(wěn)定轉化的細胞系7現在是7頁\一共有41頁\編輯于星期三脂質體轉染Lipofection(liposometransfection)將DNA包裝到一個磷脂泡囊中，泡囊可以與靶細胞的細胞膜相互作用，促進DNA攝取。適用于多種細胞類型，包括懸浮細胞可以轉染大片段DNA，比較溫和轉染效率高達90%可用于基因治療8現在是8頁\一共有41頁\編輯于星期三Lipofection9現在是9頁\一共有41頁\編輯于星期三10現在是10頁\一共有41頁\編輯于星期三電穿孔法細胞置于短暫的電脈沖中使細胞膜上形成瞬時的納米大小的孔，DNA通過這些孔進入細胞并轉運到核。適用于多種類型的細胞確定電脈沖的強度和持續(xù)時間參數確定后，具有高重復性需要的細胞量比較大，容易引起死亡11現在是11頁\一共有41頁\編輯于星期三單細胞轉染新技術：納米鋼筆探針電穿孔12現在是12頁\一共有41頁\編輯于星期三直接轉化的方法顯微注射13現在是13頁\一共有41頁\編輯于星期三基因槍14現在是14頁\一共有41頁\編輯于星期三瞬時轉染和穩(wěn)定轉染瞬時轉染：轉入的DNA不能被細胞所整合，DNA在核中保持外源染色體狀態(tài)，也不包含在宿主細胞中可以發(fā)揮功能的復制起始位點，那么它只能保留很短的時間就會稀釋或者降解。穩(wěn)定轉染：DNA整合到基因組中，形成新的遺傳位點，并遺傳給所有的無性繁殖后代。15現在是15頁\一共有41頁\編輯于星期三共轉染和穩(wěn)定轉染的篩選動物細胞的選擇標記內源選擇標記（依賴突變體）共轉染顯性選擇標記16現在是16頁\一共有41頁\編輯于星期三TK可用作內源選擇標記17現在是17頁\一共有41頁\編輯于星期三常用的內源選擇標記基因現在是18頁\一共有41頁\編輯于星期三共轉染物理上不相連的DNA進行轉染，都會整合到基因組中。利用了解清楚的質粒與目的基因共轉染，已知的篩選標記篩選，Southern鑒定目的基因。不相連的供體DNA片段在整合之前發(fā)生了融合。19現在是19頁\一共有41頁\編輯于星期三顯性選擇標記內源標記的缺陷：只能用于那些對應基因不具有功能的突變細胞系。顯性選擇標記所提供的表現型對于細胞來說是全新的，因此可以用于任何類型的細胞。20現在是20頁\一共有41頁\編輯于星期三21現在是21頁\一共有41頁\編輯于星期三選擇標記和轉化基因的擴增添加藥物篩選后，少數個別細胞會自發(fā)產生抗藥性突變而存活氨甲喋呤，DHFR，dhfr“假陽性”的去除：強啟動子驅動dhfr，引入第二個選擇標記22現在是22頁\一共有41頁\編輯于星期三DNA介導的基因轉移質粒載體23現在是23頁\一共有41頁\編輯于星期三質粒載體進行轉染的優(yōu)點質粒載體的方便性得以在動物細胞中應用質粒上的調控序列可以驅動目的基因的表達質粒上的選擇標記和目的基因會一起整合到基因組，不需要與其他基因共轉染穿梭載體的使用，使載體保持為游離的復制子24現在是24頁\一共有41頁\編輯于星期三用于瞬時轉化的非復制型質粒載體瞬時轉化時經常使用質粒載體目的就是利用染色體外DNA的短期存在性基因表達的瞬時測定和重組蛋白的適量回收在大多數動物細胞中共價閉合環(huán)狀DNA只能保持1~2天。25現在是25頁\一共有41頁\編輯于星期三復制子載體的轉染失控的多瘤病毒復制子BK和BPV復制子的穩(wěn)定轉化EBV復制子的穩(wěn)定轉化26現在是26頁\一共有41頁\編輯于星期三失控的多瘤病毒復制子多瘤病毒會造成溶解感染，即病毒基因組復制出非常高的拷貝數，從而使細胞裂解，釋放出成千上萬的子代病毒顆粒。利用其復制起點和啟動子構建克隆載體，瞬時轉染，大量生產重組蛋白27現在是27頁\一共有41頁\編輯于星期三SV40病毒載體SV40有約5kb的環(huán)狀雙鏈DNA基因組最初的SV40載體是病毒載體病毒外殼最大只能插入2.5kb的外源DNA28現在是28頁\一共有41頁\編輯于星期三SV40質粒載體攜帶有SV40復制起點的質粒與病毒本身具有同樣的作用將SV40復制起點克隆到大腸桿菌載體上T抗原編碼區(qū)整合鼠多瘤病毒復制起始位點人巨細胞病毒啟動子29現在是29頁\一共有41頁\編輯于星期三BK和BPV復制子的穩(wěn)定轉染BK病毒和EBV病毒會導致潛伏性感染，病毒基因組保持在低或中等的拷貝數，從而不會影響宿主細胞的生長。穩(wěn)定轉染效率等于普通瞬時轉染的效率提供BKT抗原后，含有BK復制起點的質粒載體就會像病毒一樣進行復制引入neo等選擇標記后，逐步提高培養(yǎng)基中抗生素的濃度，就可以篩選高拷貝的細胞30現在是30頁\一共有41頁\編輯于星期三31現在是31頁\一共有41頁\編輯于星期三BPV載體32現在是32頁\一共有41頁\編輯于星期三EBP載體33現在是33頁\一共有41頁\編輯于星期三腺病毒DNA病毒，基因組大約36kb6個早期轉錄子，1個主要的后期轉錄子穩(wěn)定性、外源DNA高容量、宿主范圍廣、高滴度后代34現在是34頁\一共有41頁\編輯于星期三腺病毒相關載體AAV單鏈DNA病毒對異源輔助病毒有依賴性AAV載體已用于將基因高效轉入許多類型的細胞35現在是35頁\一共有41頁\編輯于星期三桿狀病毒桿狀病毒具有桿狀的衣殼和大的dsDNA基因組感染許多節(jié)肢動物，特別是昆蟲。主要用于在昆蟲和昆蟲細胞內的高水平瞬時蛋白表達AcMNPV和BmNPVsf9，sf21家蠶活體36現在是36頁\一共有41頁\編輯于星期三37現在是37頁\一共有41頁\編輯于星期三38現在是38頁\一共