微生物基因工程第六

微生物基因工程第六第1頁/共78頁第六章外源基因的表達(dá)

（二）

第2頁/共78頁6.6酵母基因表達(dá)系統(tǒng)

6.6.1酵母菌作為表達(dá)外源基因受體菌的特征

6.6.2

酵母菌的宿主系統(tǒng)

6.6.3酵母菌的載體系統(tǒng)

6.6.4酵母菌的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)

6.6.5酵母菌的表達(dá)系統(tǒng)

第3頁/共78頁6.6.1

酵母菌作為表達(dá)外源基因受體菌的特征

酵母菌的分類學(xué)特征

酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式進(jìn)行無性繁殖的單細(xì)胞真核生物，分屬于子囊菌綱（子囊酵母菌）、擔(dān)子菌綱（擔(dān)子酵母菌）、半知菌類（半知酵母菌），共由56個屬和500多個種組成。如

果說大腸桿菌是外源基因最成熟的原核生物表達(dá)系統(tǒng)，則酵母菌是最成熟的真核生物表達(dá)系統(tǒng)。第4頁/共78頁6.6.1

酵母菌作為表達(dá)外源基因受體菌的特征酵母菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢全基因組測序，基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理比較清楚，遺傳操作簡便具有原核細(xì)菌無法比擬的真核蛋白翻譯后加工系統(tǒng)大規(guī)模發(fā)酵歷史悠久、技術(shù)成熟、工藝簡單、成本低廉能將外源基因表達(dá)產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中不含有特異性的病毒、不產(chǎn)內(nèi)毒素，美國FDA認(rèn)定為安全的基因工程受體系統(tǒng)（GenerallyRecognizedAsSafeGRAS）酵母菌是最簡單的真核模式生物第5頁/共78頁6.6.2

酵母菌的宿主系統(tǒng)提高重組蛋白表達(dá)產(chǎn)率的突變宿主菌抑制超糖基化作用的突變宿主菌減少泛素依賴型蛋白降解作用的突變宿主菌廣泛用于外源基因表達(dá)的酵母宿主菌第6頁/共78頁廣泛用于外源基因表達(dá)的酵母宿主菌

目前已廣泛用于外源基因表達(dá)和研究的酵母菌包括：酵母屬如釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）克魯維酵母屬如乳酸克魯維酵母（Kluyveromyceslactis）畢赤酵母屬如巴斯德畢赤酵母（Pichiapastoris）裂殖酵母屬如非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe）漢遜酵母屬如多態(tài)漢遜酵母（Hansenulapolymorpha）其中釀酒酵母的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究最為詳盡，但巴斯德畢赤酵母表達(dá)外源基因最理想。第7頁/共78頁第8頁/共78頁抑制超糖基化作用的突變宿主菌

許多真核生物的蛋白質(zhì)在其天門冬酰胺側(cè)鏈上接有寡糖基團(tuán),它們常常影響蛋白質(zhì)的生物活性。整個糖單位由糖基核心和外側(cè)糖鏈兩部分組成。酵母菌普遍擁有蛋白質(zhì)的糖基化系統(tǒng)，但野生型釀酒酵母對異源蛋白的糖基化反應(yīng)很難控制，呈超糖基化傾向，因此超糖基化缺陷株非常重要。第9頁/共78頁第10頁/共78頁減少泛素依賴型蛋白降解作用的突變宿主菌酵母菌泛素依賴型蛋白降解系統(tǒng)的編碼基因酵母菌共有四個泛素編碼基因：UBI1編碼泛素--羧基延伸蛋白52（CEP52）對數(shù)生長期表達(dá)、穩(wěn)定期關(guān)閉UBI2編碼泛素--羧基延伸蛋白52（CEP52）對數(shù)生長期表達(dá)、穩(wěn)定期關(guān)閉UBI3編碼泛素--羧基延伸蛋白76（CEP76）對數(shù)生長期表達(dá)、穩(wěn)定期關(guān)閉UBI4編碼泛素五聚體對數(shù)生長期關(guān)閉、穩(wěn)定期表達(dá)酵母菌共有七個泛素連接酶基因：UBC1、UBC2、UBC3、UBC4、UBC5、UBC6、UBC7第11頁/共78頁減少泛素依賴型蛋白降解作用的突變宿主菌泛素降解途徑衰減的釀酒酵母

UBI4缺陷型：在釀酒酵母菌中，泛素主要由UBI4基因表達(dá)，UBI4-突變株能正常生長，但細(xì)胞內(nèi)游離泛素分子的濃度比野生株要低得多，因此UBI4缺陷突變株是外源基因表達(dá)理想的受體。

UBA1缺陷型：

UBA1編碼泛素激活酶E1，UBA1突變株是致死性的，但其等位基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介導(dǎo)的蛋白降解。Ubc4-ubc5雙突變型：七個泛素連接酶基因的突變對衰減蛋白降解作用同樣有效。第12頁/共78頁6.6.3酵母菌的載體系統(tǒng)

酵母菌中的野生型質(zhì)粒酵母菌克隆表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建第13頁/共78頁第14頁/共78頁酵母菌中的野生型質(zhì)粒

乳酸克魯維酵母中的線狀質(zhì)粒乳酸克魯維酵母中含有兩種不同的雙鏈線狀質(zhì)粒pGKL1和pGKL2拷貝數(shù)為50-100個，分別攜帶K1K2兩種能使多種酵母菌致死的毒素蛋白編碼基因（αβγ），同時含有毒素蛋白抗性基因。第15頁/共78頁酵母菌克隆表達(dá)載體的類型YRp--酵母菌復(fù)制型質(zhì)粒YEp--酵母菌游離型質(zhì)粒YCp--酵母菌著絲粒質(zhì)粒YIp--酵母菌整合型質(zhì)粒YLp--酵母菌線性型質(zhì)粒第16頁/共78頁酵母菌克隆表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建含有ARS的YRp質(zhì)粒的構(gòu)建

ARS為酵母菌中的自主復(fù)制序列，0.8-1.5kb，染色體上每30-40kb就有一個ARS元件。酵母菌自主復(fù)制型質(zhì)粒的構(gòu)建組成包括復(fù)制子、標(biāo)記基因、提供克隆位點的大腸桿菌質(zhì)粒DNA。以ARS為復(fù)制子的質(zhì)粒稱為YRp含有酵母菌固有質(zhì)粒2μ環(huán)序列的的YRp質(zhì)粒的構(gòu)建以2μ質(zhì)粒上的復(fù)制元件為復(fù)制子的質(zhì)粒稱為YEp

上述兩類質(zhì)粒在釀酒酵母中的拷貝數(shù)最高可達(dá)200個，但培養(yǎng)幾代后，質(zhì)粒的丟失率高達(dá)50%-70%，主要是由于分配不均勻所致。第17頁/共78頁第18頁/共78頁第19頁/共78頁酵母菌克隆表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建含有CEN的YCpp質(zhì)粒的構(gòu)建CEN為酵母菌染色體DNA上與染色體均勻分配有關(guān)的序列。將CENDNA插入含ARS的質(zhì)粒中，獲得的新載體稱為YCp。YCp質(zhì)粒具有較高的有絲分裂穩(wěn)定性，但拷貝數(shù)只有1-5個。第20頁/共78頁第21頁/共78頁酵母菌克隆表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

含有酵母菌染色體DNA同源序列的YIp質(zhì)粒的構(gòu)建在大腸桿菌質(zhì)粒上組裝酵母菌染色體DNA特定序列和標(biāo)記基因，構(gòu)建出來的質(zhì)粒稱為YIp。YIp缺乏支持質(zhì)粒在酵母菌中自主復(fù)制的元件，目的基因表達(dá)盒通常插在染色體DNA特定序列中，這樣目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色體DNA區(qū)域第22頁/共78頁第23頁/共78頁6.6.4酵母菌的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)轉(zhuǎn)化質(zhì)粒在酵母細(xì)胞中的命運酵母菌的轉(zhuǎn)化程序用于轉(zhuǎn)化子篩選的標(biāo)記基因第24頁/共78頁轉(zhuǎn)化質(zhì)粒在酵母細(xì)胞中的命運單雙鏈DNA均可轉(zhuǎn)化酵母菌，但單鏈的轉(zhuǎn)化率是雙鏈的10-30倍含有復(fù)制子的單鏈質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞后，能準(zhǔn)確地轉(zhuǎn)化為雙鏈并復(fù)制不含復(fù)制子的單鏈質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞后，能高效地同源整合入染色體這對于體內(nèi)定點突變酵母基因組極為有利克隆在YIp整合型質(zhì)粒上的外源基因，如果含有受體細(xì)胞的染色體DNA的同源序列，會發(fā)生高頻同源整合，整合子占轉(zhuǎn)化子總數(shù)的50-80%第25頁/共78頁酵母菌的轉(zhuǎn)化程序

酵母菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法

早期酵母菌的轉(zhuǎn)化都采用在等滲緩沖液中穩(wěn)定的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法，在Ca2+和PEG的存在下，轉(zhuǎn)化細(xì)胞可達(dá)原生質(zhì)體總數(shù)的1-2%。但該程序操作周期長，而且轉(zhuǎn)化效率受到原生質(zhì)再生率的嚴(yán)重制約原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法的一個顯著特點是，一個受體細(xì)胞可同時接納多個質(zhì)粒分子，而且這種共轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體占轉(zhuǎn)化子總數(shù)的25-33%第26頁/共78頁酵母菌的轉(zhuǎn)化程序

堿金屬離子介導(dǎo)的酵母菌完整細(xì)胞的轉(zhuǎn)化釀酒酵母的完整細(xì)胞經(jīng)堿金屬離子（如Li+等）、PEG、熱休克處理后，也可高效吸收質(zhì)粒DNA，而且具有下列特性：吸收線型DNA的能力明顯大于環(huán)狀DNA，兩者相差

80倍共轉(zhuǎn)化現(xiàn)象極為罕見第27頁/共78頁酵母菌的轉(zhuǎn)化程序

酵母菌電擊轉(zhuǎn)化法

酵母菌原生質(zhì)體和完整細(xì)胞均可在電擊條件下吸收質(zhì)粒DNA，但在此過程中應(yīng)避免使用PEG，它對受電擊的細(xì)胞具有較很大的負(fù)作用。電擊轉(zhuǎn)化的優(yōu)點是不依賴于受體細(xì)胞的遺傳特征及培養(yǎng)條件適用范圍廣，而且轉(zhuǎn)化率可高達(dá)105轉(zhuǎn)化體/μgDNA。第28頁/共78頁用于轉(zhuǎn)化子篩選的標(biāo)記基因用于酵母菌轉(zhuǎn)化子篩選的標(biāo)記基因主要有營養(yǎng)缺陷型互補基因和顯性基因兩大類:營養(yǎng)缺陷型的互補基因營養(yǎng)缺陷型互補基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如：LEU、TRP、HIS、LYS、URA、ADE

但對于多倍體酵母來說，篩選營養(yǎng)缺陷型的受體非常困難第29頁/共78頁第30頁/共78頁

6.6.5

酵母菌的表達(dá)系統(tǒng)

酵母菌啟動子的可控性外源基因在酵母菌中表達(dá)的限制因素酵母菌表達(dá)系統(tǒng)的選擇第31頁/共78頁酵母菌啟動子的可控性

溫度控制型啟動子pho4TS-PHO5啟動子：釀酒酵母PHO5啟動子在培養(yǎng)基中游離磷酸鹽耗盡時才能打開。

PHO4基因編碼產(chǎn)物是PHO5啟動子的正調(diào)控因子，

PHO4溫度敏感型突變基因pho4TS的編碼產(chǎn)物在35℃時失活，因此，裝在pho4TS-PHO5啟動子下游的外源基因在35℃時關(guān)閉、23℃誘導(dǎo)表達(dá)第32頁/共78頁第33頁/共78頁外源基因在酵母菌中表達(dá)的限制因素外源基因穩(wěn)態(tài)mRNA的濃度外源基因mRNA的翻譯活性酵母菌對密碼子的偏愛性在釀酒酵母中，高豐度的蛋白質(zhì)（如甘油醛-3--磷酸脫氫酶GAPDH、磷酸甘油激酶PKG、乙醇脫氫酶ADH）中96%以上的氨基酸是由25個密碼子編碼的第34頁/共78頁酵母菌表達(dá)系統(tǒng)的選擇

釀酒酵母的基因表達(dá)系統(tǒng)最為成熟，包括轉(zhuǎn)錄活性較高的甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因GAPDH、磷酸甘油激酶基因PKG、乙醇脫氫釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)酶基因ADH所屬的啟動子，多種重組外源蛋白獲得成功表達(dá)。釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)的最大問題在于其超糖基化能力，往往使得有些重組蛋白（如人血清白蛋白等）與受體細(xì)胞緊密結(jié)合，而不能大量分泌。這一缺陷可用非釀酒酵母型的表達(dá)系統(tǒng)來彌補。第35頁/共78頁酵母菌表達(dá)系統(tǒng)的選擇

乳酸克魯維酵母表達(dá)系統(tǒng)乳酸克魯維酵母的雙鏈環(huán)狀質(zhì)粒pKD1已被廣泛用作重組異源蛋白生產(chǎn)的高效表達(dá)穩(wěn)定性載體，即便在無選擇壓力的條件下，也能穩(wěn)定遺傳40代以上。乳酸克魯維酵母表達(dá)分泌型和非分泌型的重組蛋白，性能均優(yōu)于釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)。第36頁/共78頁酵母菌表達(dá)系統(tǒng)的選擇

巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)巴斯德畢赤酵母是一種甲基營養(yǎng)菌，能在低廉的甲醇培養(yǎng)基中生長，甲醇可高效誘導(dǎo)甲醇代謝途徑中各酶編碼基因的表達(dá)，因此生長迅速、乙醇氧化酶基因AOX1所屬強啟動子、表達(dá)的可誘導(dǎo)性是巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的三大優(yōu)勢。由于巴斯德畢赤酵母沒有合適的自主復(fù)制型載體，所以外源基因的表達(dá)序列一般整合入受體的染色體DNA上。在此情況下，外源基因的高效表達(dá)在很大程度上取決于整合拷貝數(shù)的多寡。目前已有20余種具有經(jīng)濟(jì)價值的重組蛋白在巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)中獲得成功表達(dá)。第37頁/共78頁酵母菌表達(dá)系統(tǒng)的選擇

多型漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng)多型漢遜酵母也是一種甲基營養(yǎng)菌。其自主復(fù)制序列HARS已被克隆，并用于構(gòu)建克隆表達(dá)載體，但與巴斯德畢赤酵母相似，這種載體在受體細(xì)胞有絲分裂時顯示出不穩(wěn)定性。所不同的是，HARS質(zhì)粒能高頻自發(fā)地整合在受體的染色體DNA上，甚至可以連續(xù)整合100多個拷貝，因此重組多型漢遜酵母的構(gòu)建也是采取整合的策略。目前，包括乙型肝炎表面抗原在內(nèi)的數(shù)種外源蛋白在該系統(tǒng)中獲得成功表達(dá)。第38頁/共78頁6.7

哺乳動物基因表達(dá)系統(tǒng)

A高等哺乳動物基因工程的基本概念B高等哺乳動物的受體系統(tǒng)C高等哺乳動物的載體系統(tǒng)D高等哺乳動物的基因轉(zhuǎn)移E利用哺乳動物工程細(xì)胞生產(chǎn)重組蛋白第39頁/共78頁第40頁/共78頁B高等哺乳動物的受體系統(tǒng)

高等哺乳動物細(xì)胞的生長特性高等哺乳動物受體細(xì)胞的條件高等哺乳動物受體細(xì)胞的遺傳標(biāo)記常用的高等哺乳動物受體細(xì)胞第41頁/共78頁高等哺乳動物細(xì)胞的生長特性

正常的哺乳類動物細(xì)胞具有下列四大生物學(xué)特征：錨地依賴性：細(xì)胞必須附在固體上或固定的表面才能生長分裂血清依賴性：細(xì)胞必須具有生長因子才能生長接觸抑制性：細(xì)胞與細(xì)胞接觸后，生長便受到抑制形態(tài)依賴性：細(xì)胞稱扁平狀，并有長纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上述特征使得正常的哺乳動物細(xì)胞在體外培養(yǎng)中，一般只能存活50代且在培養(yǎng)皿上以平面的形式生長，即單層細(xì)胞生長。有時，正常細(xì)胞會改變某些特征而越過生理臨界點，繼續(xù)增殖并無限制分裂，這種狀態(tài)稱為細(xì)胞系形成，此時的細(xì)胞成為細(xì)胞系。第42頁/共78頁高等哺乳動物受體細(xì)胞的條件

以高效表達(dá)外源基因為目標(biāo)的高等哺乳動物受體細(xì)胞應(yīng)具備下列條件：細(xì)胞系特征喪失細(xì)胞接觸抑制性和錨地依賴性特征，便于大規(guī)模培養(yǎng)遺傳穩(wěn)定性外源基因多次傳代后不至于丟失，易于長期保存合適的標(biāo)記便于轉(zhuǎn)化株的篩選和維持生長快且齊分裂周期短，生長均一，便于控制安全性能好不合成分泌致病物質(zhì)，不致癌大多數(shù)正常的高等哺乳動物細(xì)胞并不能同時具備上述條件，癌細(xì)胞能滿足上述前四項要求，但在安全性能上有欠缺。第43頁/共78頁第44頁/共78頁高等哺乳動物受體細(xì)胞的遺傳標(biāo)記

營養(yǎng)缺陷型的哺乳動物受體細(xì)胞含有胸腺嘧啶核苷激酶（TK）編碼基因缺陷的受體細(xì)胞（tk-）不能在含有次黃嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基上（HAT培養(yǎng)基）生長，載體上的標(biāo)記基因tk能與之遺傳互補含有次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HPRT）編碼基因缺陷的受體細(xì)胞不能在含有次黃嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基上（HAT培養(yǎng)基）生長，載體上的標(biāo)記基因hprt與之遺傳互補（hprt-）第45頁/共78頁第46頁/共78頁常用的高等哺乳動物受體細(xì)胞

迄今為止，用于醫(yī)療用品（藥物、抗體、診斷試劑）大規(guī)模生產(chǎn)的高等哺乳動物受體細(xì)胞主要還是中國倉鼠卵巢細(xì)胞（CHO），其優(yōu)勢有如下幾個方面：遺傳背景清楚，生理代謝穩(wěn)定與人的親緣關(guān)系接近，外源蛋白修飾準(zhǔn)確基因轉(zhuǎn)移和載體表達(dá)系統(tǒng)完善耐受剪切力，便于大規(guī)模培養(yǎng)被美國FFDA確認(rèn)為安全的基因工程受體細(xì)胞（GRAS）第47頁/共78頁C高等哺乳動物的載體系統(tǒng)人腺病毒DNA猴空泡病毒DNA（SV40）人乳多瘤病毒DNA（BKV）人牛痘病毒DNA第48頁/共78頁人腺病毒DNA腺病毒的生物學(xué)特性腺病毒科為線狀雙鏈DNA病毒，無包膜，呈二十面體，共有93個成員，分哺乳動物腺病毒和禽腺病毒兩個屬。目前已鑒定的人腺病毒有6個亞屬，其中常用來構(gòu)建載體的主要是C亞屬的2型（Ad2）和5型（Ad5）病毒。腺病毒感染人細(xì)胞時呈裂解型，不致癌；但對嚙齒目動物來說，絕大多數(shù)的腺病毒成員均能致癌。第49頁/共78頁第50頁/共78頁人腺病毒DNA腺病毒DNA載體的特點基因重排低：外源基因與病毒DNA重組后能穩(wěn)定復(fù)制幾個周期安全性能好：不整合人的染色體DNA，不會導(dǎo)致惡性腫瘤宿主范圍廣：對受體細(xì)胞是否處于分裂期要求不嚴(yán)格使用效果好：外源基因在載體上容易高效表達(dá)第51頁/共78頁猴多瘤病毒DNA（猴多瘤病毒DNA（SV40）SV40的生物學(xué)特性

SV40屬于乳多瘤病毒科多瘤病毒屬，呈小型二十面體，由VP1、VP2、VP3三種衣殼蛋白包裝而成，基因組為5224bp的雙鏈環(huán)狀DNASV40可以與所有哺乳動物宿主細(xì)胞中的組蛋白H2、H3、H4結(jié)合，從而使其DNA形成類似核小體的微型染色體結(jié)構(gòu)。

SV40感染猴細(xì)胞時呈裂解型，不致癌；但感染嚙齒類動物后，便發(fā)生非同源整合而致癌。第52頁/共78頁第53頁/共78頁第54頁/共78頁第55頁/共78頁猴多瘤病毒DNA（猴多瘤病毒DNA（SV40）SV40DNA載體的特點基因表達(dá)好外源基因能高效表達(dá)基因重排高病毒基因組和重組分子常發(fā)生重排和缺失現(xiàn)象宿主范圍窄只能轉(zhuǎn)染猴細(xì)胞裝載量較小第56頁/共78頁

人乳多瘤病毒DNA

（人乳多瘤病毒DNA（BKV）

人乳多瘤病毒的生物學(xué)特性人乳多瘤病毒（BKV）屬于乳多瘤病毒科乳頭瘤病毒屬，其基因組為雙鏈DNA，感染宿主細(xì)胞后基因不發(fā)生整合，獨立于染色體而自主復(fù)制，每個宿主細(xì)胞最高可達(dá)500個拷貝第57頁/共78頁第58頁/共78頁人牛痘病毒DNA

人牛痘病毒的生物學(xué)特性人牛痘病毒是一個大型DNA病毒，基因組長185kb，能在宿主細(xì)胞質(zhì)中自主復(fù)制。以前外源基因插在病毒基因組的非必需區(qū)內(nèi)，構(gòu)建出的重組病毒具有感染力，而且一經(jīng)轉(zhuǎn)染，外源基因即可在最鄰近的病毒啟動子的控制下高效表達(dá)。然而由于牛痘病毒基因組較大，體外DNA重組很困難，因此通常采用體內(nèi)重組的方式進(jìn)行。第59頁/共78頁人牛痘病毒DNA

人牛痘病毒DNA表達(dá)載體的構(gòu)建目前廣泛使用的牛痘病毒表達(dá)系統(tǒng)是一種預(yù)先構(gòu)建好的重組病毒其基因組上插入了一個可表達(dá)的大腸桿菌T7RNA聚合酶編碼基因。在外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞之前，先以上述的重組病毒感染細(xì)胞，使其大量表達(dá)T7RNA聚合酶，然后再將含有外源基因和T7啟動子的細(xì)菌型重組質(zhì)粒導(dǎo)入哺乳動物受體細(xì)胞，此時外源基因整合在受體細(xì)胞染色體DNA上，并在T7RNA聚合酶的作用下表達(dá)出重組蛋白。人囊狀纖維化基因就是采用這種戰(zhàn)略高效表達(dá)的。第60頁/共78頁第61頁/共78頁D高等哺乳動物的基因轉(zhuǎn)移哺乳動物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化法哺乳動物細(xì)胞的病毒轉(zhuǎn)染法第62頁/共78頁哺乳動物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化法

利用物理方法轉(zhuǎn)化高等哺乳動物細(xì)胞的主要優(yōu)點是外源基因表達(dá)盒中不含任何病毒基因序列，這對外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化減輕了負(fù)擔(dān)。但外源基因表達(dá)盒進(jìn)入受體細(xì)胞，往往以多拷貝的形式隨機(jī)整合在染色體DNA上，導(dǎo)致受體細(xì)胞基因滅活、外源基因不表達(dá)。第63頁/共78頁哺乳動物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化法磷酸鈣共沉淀法將待轉(zhuǎn)化的DNA溶解在磷酸緩沖液中，加入CaCl2溶液混勻，此時DNA被包裹在磷酸鈣晶體顆粒內(nèi)；此時細(xì)胞膜形成吞噬泡，磷酸鈣晶體局部溶解膜結(jié)構(gòu)，DNA便進(jìn)入受體細(xì)胞；將上述制備的顆粒懸浮液滴入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，37℃保溫4-16小時棄去DNA溶液，加入新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)7天即可篩選轉(zhuǎn)化株。如果在外源DNA中摻入少量的受體細(xì)胞內(nèi)源性DNA可以提高轉(zhuǎn)化效率。利用磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)化腫瘤病毒DNA，可使正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為癌細(xì)胞，這是人們對腫瘤發(fā)生機(jī)制的最早理解。第64頁/共78頁哺乳動物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化法

電擊轉(zhuǎn)化法將待轉(zhuǎn)化的DNA溶解受體細(xì)胞懸浮液中，然后加入電擊轉(zhuǎn)化儀的樣品槽內(nèi)，兩端施加瞬時高壓電場，使細(xì)胞膜產(chǎn)生細(xì)小的縫隙，此時DNA片段便可不經(jīng)過胞飲作用直接進(jìn)入受體細(xì)胞。電擊轉(zhuǎn)化法常用于對磷酸鈣共沉淀法無效的細(xì)胞類型，如生長在懸浮液中的淋巴細(xì)胞等。第65頁/共78頁哺乳動物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化法

脂質(zhì)體介導(dǎo)法將待轉(zhuǎn)化的DNA溶解與天然或人工合成的磷脂混合，后者在表面活性劑的存在下形成包埋水相DNA的脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)。將這種脂質(zhì)體懸浮液加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，便會與受體細(xì)胞膜融合，DNA隨即進(jìn)入胞質(zhì)和核內(nèi)。利用上述程序曾將外源基因成功地導(dǎo)入了小鼠的淋巴細(xì)胞和HeLa細(xì)胞。第66頁/共78頁哺乳動物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化法顯微注射法通過激素療法使雌鼠超數(shù)排卵，并與雄性小鼠交配，然后殺死雌鼠，從其輸卵管內(nèi)取出受精卵；借助于顯微鏡將純化的DNA溶液迅速注入到受精卵中變大了的雄性原核內(nèi)。上述程序多用于動物個體的轉(zhuǎn)基因過程，由于必須單細(xì)胞逐一操作，所以不太適用于基因的克隆和表達(dá)。第67頁/共78頁哺乳動物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化法

血影細(xì)胞介導(dǎo)法血影細(xì)胞是指哺乳動物的紅細(xì)胞在機(jī)械作用、病毒誘導(dǎo)、低滲環(huán)境下發(fā)生溶血，血紅蛋白大量溢出，最后形成僅被細(xì)胞膜包裹的細(xì)胞核結(jié)構(gòu)。在溶血過程中，紅細(xì)胞膜的通透性大增，在血紅蛋白溢出的同時，外源DNA也容易進(jìn)入。當(dāng)上述外界條件消失后，紅細(xì)胞膜又可恢復(fù)原來的通透性。因此，可先將外源DNA轉(zhuǎn)入血影細(xì)胞，然后再將血影細(xì)胞與受體細(xì)胞在適當(dāng)條件下發(fā)生融合，從而將外源DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞。第68頁/共78頁哺乳動物細(xì)胞的病毒轉(zhuǎn)染法

以病毒DNA為載體可以將外源基因直接轉(zhuǎn)染或與野生型病毒顆粒共轉(zhuǎn)染特定的受體細(xì)胞。這種方法具有定向性好、實驗重復(fù)性佳、導(dǎo)入效率高等優(yōu)點，但也存在一定的缺陷，如目前常用的載體宿主范圍有限，往往無法轉(zhuǎn)染一些具有重要經(jīng)濟(jì)價值的家禽和牲畜細(xì)胞等。第69頁/共78頁E利用哺乳動物工程細(xì)胞生產(chǎn)重組蛋白哺乳動物細(xì)胞高效表達(dá)外源蛋白的基