蛋白多肽類藥物的藥物代謝動(dòng)力學(xué)

第8章蛋白多肽類藥物的

藥物代謝動(dòng)力學(xué)

1精選課件蛋白多肽類藥物的藥代動(dòng)力學(xué)十分復(fù)雜，這類藥物是生物大分子,與傳統(tǒng)的化學(xué)合成藥物小分子在理化性質(zhì)和體內(nèi)過程等方面均有顯著不同，其藥動(dòng)學(xué)特點(diǎn)和規(guī)律亟待闡明。該類藥物的動(dòng)力學(xué)研究不僅要解決相關(guān)理論問題，而且要求發(fā)展和應(yīng)用新技術(shù)、新方法和建立新體系。2精選課件第1節(jié)蛋白多肽類藥物的體內(nèi)過程

蛋白多肽類藥物的體內(nèi)過程相當(dāng)復(fù)雜。化學(xué)結(jié)構(gòu)特殊，其生理活性和體內(nèi)過程不僅與其一級(jí)結(jié)構(gòu)，而且與其二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)，作用強(qiáng)，用藥劑量小，生物體內(nèi)存在大量相似物質(zhì)的干擾，在體內(nèi)經(jīng)受廣泛的蛋白降解作用以及血液中存在多種不同類型的結(jié)合蛋白，如抗體、受體、受體拮抗劑等3精選課件一、蛋白多肽類藥物的吸收和生物利用度

蛋白多肽類藥物的吸收呈現(xiàn)明顯的給藥途徑依賴性。

(一)口服吸收

多種屏障作用導(dǎo)致口服生物利用度很低，以致絕大多數(shù)蛋白多肽類藥物口服后不能產(chǎn)生足夠的有效血藥濃度。這些屏障包括：●吸收屏障分子量大極性較強(qiáng)具有較低的分配系數(shù)和擴(kuò)散性能使其不易為親脂性生物膜攝取，故很難通過胃腸道吸收?！袼崞琳?/p>

該類藥物對(duì)胃液的強(qiáng)酸性（pH1~2）敏感，易被胃酸分解破壞。4精選課件●酶屏障胃腸道存在大量的酶，如胰絲氨酸蛋白酶中的胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶及彈性蛋白酶以及胃液中的胃蛋白酶都對(duì)蛋白分子產(chǎn)生消化降解作用。多數(shù)蛋白多肽類藥物口服生物利用度很差，通常僅為2~3%，從而絕大多數(shù)這類藥物不能采用口服途徑給藥。僅極少數(shù)肽類可供口服給藥，如環(huán)孢素，由于其獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)（環(huán)狀十一肽）使其成為高度脂溶性并對(duì)酶相對(duì)穩(wěn)定，通常制成油溶液供口服用，即使如此，其口服生物利用度亦差，且高度可變（從2%至92%），多種生理因素可影響其胃腸吸收。已知，肽類化合物中二肽和三肽尚可借助于主動(dòng)機(jī)制通過腸黏膜吸收，但這種轉(zhuǎn)運(yùn)方式顯示有明顯的立體選擇性，含D-型氨基酸的肽類通常吸收差，如氨基末端的氮原子或肽鍵甲基化或羧基末端轉(zhuǎn)變?yōu)轷０方Y(jié)構(gòu)，則吸收進(jìn)一步減少。5精選課件(二)皮下注射

該類藥物皮下注射給藥可避免體循環(huán)前的首關(guān)效應(yīng)，吸收明顯好于口服給藥，但由于蛋白酶的普遍存在，這類藥物也可部分受到皮下注射組織存在的蛋白酶的代謝破壞，致其生物利用度亦不理想如重組細(xì)胞因子皮下注射通常生物利用度低于70%。6精選課件(三)鼻腔給藥鼻吸收遠(yuǎn)大于口服途徑：●鼻黏膜上皮存在眾多微絨毛而具有較大的表面積●鼻黏膜具有廣泛的血管網(wǎng)而成為親脂性和親水性藥物的較好的吸收部位，同時(shí)給予吸收促進(jìn)劑可使肽類藥物鼻吸收遠(yuǎn)大于口服途徑。這些肽類包括▲黃體激素-釋放激素（LH-RH），▲丙氨酸-賴氨酸-促腎上腺皮質(zhì)激素（Ala1-Lys17-ACTH），▲膽囊收縮素八肽，▲-硫代苯基青霉素以及頭孢菌素類等，▲胰島素在大鼠的鼻吸收達(dá)30%，且吸收迅速，由于這一點(diǎn)，鼻吸收途徑引起了人們的很大興趣。7精選課件●避免了肝臟的首關(guān)效應(yīng)，●擬首關(guān)效應(yīng)（pseudo-firstpasseffect）。鼻上皮的嗅覺區(qū)內(nèi)的細(xì)胞色素P450活性甚至高于肝臟，主要由于NADPH-細(xì)胞色素P450還原酶含量較高（約高3~4倍），已發(fā)現(xiàn)在鼻黏膜中也存在肝臟中的三類可誘導(dǎo)的細(xì)胞色素P450同工酶，在鼻上皮中也發(fā)現(xiàn)第Ⅱ相結(jié)合反應(yīng)活性。●鼻腔給予的多肽類藥物的生物利用度與其分子量顯著相關(guān)[3]，▲對(duì)于分子量小于10kDa的分子不需加入生物黏附劑和促進(jìn)劑，?？僧a(chǎn)生足夠量的藥物進(jìn)入體循環(huán)，生物利用度在1~10%左右。▲較大分子，例如干擾素，人生長(zhǎng)激素等即使使用生物黏附性給藥系統(tǒng)，其較大的分子亦阻礙藥物的有效吸收。肽類藥物的吸收能夠通過應(yīng)用酶抑制劑而改善，某些表面活性劑如膽鹽可使蛋白變性而抑制蛋白水解酶，從而增加蛋白多肽藥物的吸收。在鼻黏膜中主要的酶類有▲氨基肽酶、▲肽鏈端解酶▲肽鏈內(nèi)切酶。8精選課件氨基肽酶酶抑制劑:阿嗎他定（amastatin）貝他定（bestatin）如鼻內(nèi)單獨(dú)給予lmg/kg人生長(zhǎng)激素（rGH）溶液后的平均血藥濃度顯著低于rGH與以下2種氨基肽酶抑制劑的聯(lián)合：0.015%阿嗎他定（amastatin）以及0.015%貝他定（bestatin）。表面活性劑:羥乙酸鈉（sodiumglycolate）與促腎上腺皮質(zhì)激素-釋放激素（CRH）同用可使后者的鼻內(nèi)給藥生物利用度達(dá)100%。但表面活性劑的促滲效果因不同藥物而異，如同樣的羥乙酸鈉對(duì)生長(zhǎng)激素釋放激素GHRH的促滲作用較弱，鼻內(nèi)給予（GHRH）的生物利用度僅為7.1%。9精選課件鼻腔途徑目前已成為肽類藥物靜脈外給藥的頗受重視的重要給藥途徑，不少這類藥物已制成噴鼻劑或滴鼻劑用于臨床實(shí)踐。最早被采用的肽類藥物為垂體激素，如催產(chǎn)素、加壓素及其類似物，其中去氨加壓素由于鼻腔吸收良好，不良反應(yīng)少，已成為尿崩癥治療的首選給藥方法。醋酸布舍瑞林(LH-RH類似物)

已有鼻內(nèi)噴霧劑商品，其鼻腔給藥是僅次于注射的有效給藥方式。胰島素鼻用制劑已在美國(guó)有商品出售。10精選課件表8-1某些蛋白多肽類藥物鼻腔給藥的吸收藥物相對(duì)生物利用度*達(dá)峰時(shí)間

h氨基酸殘基數(shù)目實(shí)驗(yàn)對(duì)象胰島素1~305~1051大鼠、狗、人

生長(zhǎng)激素釋放因子2~2020~4040~44大鼠、狗、人

胰高血糖素70~905~1029人

LH-RH激動(dòng)劑和拮抗劑2~510~309~10猴、人

加壓素類似物6~1210~209人

催產(chǎn)素30~405~109人

腦啡肽類似物70~905~105大鼠、人

促甲狀腺釋放激素10~205~153大鼠、人

*相對(duì)于靜脈、肌肉和皮下給藥

11精選課件(四)透皮吸收

透皮吸收已成為令人注目的給藥途徑，可避免腸道和肝臟對(duì)藥物的首關(guān)效應(yīng)，并可提供較好的傳輸控制和維持藥物治療水平于較長(zhǎng)時(shí)間。通常認(rèn)為皮膚的蛋白水解酶活性較低.12精選課件

影響蛋白多肽類藥物透皮吸收因素主要來自吸收屏障:▲較大的分子量▲荷電性使這類藥物很難通過被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)吸收，為克服這種屏障作用，通常采用離子電滲療法，如LH-RH（一種十肽）分子量1182D，在pH6.0時(shí)荷正電，可用這種方法通過皮膚吸收?！裨鰪?qiáng)肽類藥物的透皮吸收:▲透皮吸收促進(jìn)劑、▲pH調(diào)節(jié)▲蛋白水解酶抑制劑。13精選課件(五)其他途徑

陰道內(nèi)和肺內(nèi)給予LH-RH類似物吸收程度達(dá)40~95%，胰島素達(dá)57%。直腸給予四胃泌素（Tetragastrin）生物利用度達(dá)16%，胰島素達(dá)28%。14精選課件二、蛋白多肽類藥物的體內(nèi)代謝影響這類藥物體內(nèi)命運(yùn)的一個(gè)最重大因素是它們給藥后在體內(nèi)經(jīng)受廣泛的酶介導(dǎo)的代謝分解，通常導(dǎo)致生物活性的喪失。(1)肝臟、腸道以及其他器官組織均存在大量代謝蛋白多肽的酶，就其反應(yīng)類型可涉及第I相和第II相代謝反應(yīng)。(2)靜脈注射給藥時(shí)這類藥物的代謝失活主要發(fā)生在肝臟，當(dāng)口服給藥時(shí)則主要發(fā)生在腸道，造成顯著的腸道體循環(huán)前消除。(3)細(xì)胞色素P450與蛋白多肽類藥物的代謝關(guān)系密切，如環(huán)孢素（環(huán)狀十一肽）的代謝是細(xì)胞色素P4503A4介導(dǎo)的，其生物轉(zhuǎn)化包括其分子上不同部位的單羥基化和雙羥基化以及N-脫甲基反應(yīng)。(4)酶抑制劑紅霉素、維拉帕米、尼卡地平、酮康唑及依曲康唑可使環(huán)孢素血濃度升高，而酶誘導(dǎo)劑如利福平、苯妥英以及苯巴比妥能夠降低環(huán)孢素的血藥濃度。15精選課件(一)肝臟對(duì)蛋白多肽類藥物的代謝

●肝臟對(duì)鏈長(zhǎng)小于8個(gè)氨基酸的小肽具有高度的攝取●這種攝取呈現(xiàn)結(jié)構(gòu)特異性●被攝取的多肽可以完整形式或代謝物形式排入膽汁中肝臟對(duì)多肽的攝取機(jī)制涉及以下兩個(gè)過程：●被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn):疏水性肽類●主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)過程:低疏水性肽類；▲內(nèi)吞▲載體介導(dǎo)多數(shù)水溶性的不能通過特異機(jī)制清除的肽類被認(rèn)為是通過內(nèi)吞作用進(jìn)入肝細(xì)胞。●受體介導(dǎo)的內(nèi)吞繼以溶酶體的分解作用適用于解釋多種藥物的肝臟代謝機(jī)制這些藥物有神經(jīng)生長(zhǎng)因子，絨毛膜促性腺激素、催乳素、促甲狀腺釋放激素、TGF、上皮生長(zhǎng)因子等。16精選課件（二）胃腸道對(duì)蛋白多肽類藥物的代謝

胃腸道內(nèi)存在大量代謝蛋白多肽的酶，可分為以下三種類型。胃腸道腔內(nèi)酶這類酶參與蛋白質(zhì)的消化，包括胃蛋白酶、胰蛋白酶、-糜蛋白酶、彈性酶以及羧基肽酶A和B。這些酶類分別特異水解疏水性、堿性、大分子疏水性、小分子脂族及芳香族和堿性C-末端氨基酸，上述酶類的典型底物分別為：Z-His-Phe-Phe-oMe，苯甲?；彼峒柞ィ˙AEE）、苯甲?；野彼嵋阴ィ˙TEE）、Ala-Ala-Ala甲酯、馬尿酸-苯丙氨酸，馬尿酸-精氨酸。17精選課件2.黏膜細(xì)胞酶

主要指與刷狀緣膜結(jié)合的酶類。刷狀緣膜構(gòu)成了腸道上皮細(xì)胞的腔面，富含有多種酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，參與各種蛋白類在細(xì)胞表面的代謝轉(zhuǎn)化和吸收。這些酶類依其作用方式分為4種類型，即氨基肽酶、羧基肽酶、二肽酶及肽鏈內(nèi)切酶。前三種酶屬于肽鏈端解酶，它們從肽類分子的氨基末端或羧基末端順序水解肽類，氨基肽酶是腸刷狀緣膜中最豐富的酶。盡管某些刷狀緣酶是種屬及底物依賴性的，但總的說來，其對(duì)肽類的藥物水解速率遵循下列順序：二肽＞三肽＞大分子肽。18精選課件3.刷狀緣胞液酶

這類酶包括氨基三肽酶、脯氨酸肽酶、脯氨酰肽酶、二肽酶及肌肽酶，其典型的底物分別為：中性二肽、N末端為脯氨酸的三肽、C-末端為脯氨酸/馬尿酸的亞胺二肽、N-末端為脯氨酸/馬尿酸的亞胺二肽、肌肽（-丙氨酰組氨酸）。胞液酶優(yōu)先水解二肽，對(duì)二肽的水解能力超過對(duì)三肽和大分子肽。19精選課件(二)腎臟對(duì)蛋白多肽的代謝

腎臟是最重要的蛋白分解代謝的器官之一，特別是分子量低于60kDa的蛋白。通常，血循環(huán)中的肽類和蛋白能夠自由地通過腎小球?yàn)V過，肽類可在刷狀緣膜水解，其水解產(chǎn)物，游離氨基酸及短鏈多肽通常不經(jīng)溶酶體的分解而通過近曲小管進(jìn)入血液，當(dāng)這些多肽分子量接近3~5kD或更大時(shí)，則往往在近曲小管的刷狀緣膜被內(nèi)吞（而不是水解）并隨后被溶酶體消化，生成的游離氨基酸和短鏈多肽返回血液循環(huán)中。20精選課件(三)其他器官組織對(duì)蛋白多肽的代謝

由于蛋白水解酶的普遍存在性，蛋白多肽藥物在體內(nèi)的代謝部位極其廣泛。在肝、腎和腸道以外的組織也都存在各種水解蛋白多肽的酶，即使在一般認(rèn)為蛋白水解酶活性較低的皮膚，也發(fā)現(xiàn)降解肽類的酶屏障，皮膚中的酶代謝活性主要在表皮，在培育的小鼠角質(zhì)細(xì)胞和小鼠表皮的勻漿中測(cè)得了氨基肽酶的亞細(xì)胞分布。21精選課件三、蛋白多肽類的化學(xué)結(jié)構(gòu)和化學(xué)修飾對(duì)其體內(nèi)過程的影響（一）糖蛋白分子中糖基的作用

近年，大量細(xì)胞因子被開發(fā)，它們?cè)诨瘜W(xué)結(jié)構(gòu)上屬于糖蛋白。糖基在糖蛋白的體內(nèi)血漿時(shí)程的調(diào)節(jié)中起著重要的作用。典型的藥物為

紅細(xì)胞生成素（Erythropoietin,EPO）為含唾液酸的糖蛋白激素，分子中約40%為糖類，包括一個(gè)O-聯(lián)結(jié)和三個(gè)N-聯(lián)結(jié)的寡糖。該激素的糖基在體內(nèi)外活性表達(dá)中十分重要，業(yè)已表明，這些糖基是EPO體內(nèi)活性所必需。不含唾液酸的EPO在體內(nèi)無活性，這種活性的喪失可通過脫唾液酸EPO從血循環(huán)的快速清除加以解釋。該蛋白脫去唾液酸后暴露出半乳糖殘基，后者能為肝細(xì)胞表面存在的半乳糖受體識(shí)別，從而促進(jìn)了EPO被肝細(xì)胞半乳糖結(jié)合受體的結(jié)合和內(nèi)吞，繼被溶酶體消化。22精選課件

在大鼠肝灌流系統(tǒng)，脫唾液酸的天然和重組人EPO的血漿消除比完整的EPO快，原形EPO的分布半衰期和清除半衰期分別為53分鐘和180分鐘，而脫唾液酸EPO的消除半衰期僅為2分鐘。大鼠靜脈滴注125I標(biāo)記的rhEPO后其消除緩慢，血漿半衰期約為2小時(shí)，而脫唾液酸EPO則在10分鐘內(nèi)迅速自血循環(huán)中清除，給藥后30分鐘85%的注射劑量在肝內(nèi)被回收。近年許多重組細(xì)胞因子被研制，它們多數(shù)在血循環(huán)中不穩(wěn)定或引起不良反應(yīng)，但EPO的臨床治療獲得較大成功，一方面由于EPO指向于特定的成紅細(xì)胞，另一方面則由于其體內(nèi)較穩(wěn)定。這種穩(wěn)定性主要取決于分子中高比例的糖類的存在，從而逃脫肝細(xì)胞的攝取。23精選課件（二）氨基酸殘基對(duì)寡肽的肝清除的影響

肽類分子中氨基酸殘基對(duì)肽類的肝清除速率有顯著影響。●隨著丙氨酸數(shù)目的每一增加即伴有肽消失速率的顯著增加；●相反，隨著甘氨酸殘基數(shù)目的每一增加，肽的消失速率顯著減少。24精選課件（三）蛋白多肽一級(jí)結(jié)構(gòu)的PEST假設(shè)

Roger等通過文獻(xiàn)資料的總結(jié)發(fā)現(xiàn)，那些在真核細(xì)胞內(nèi)快速分解的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)通常含有共同的氨基酸序列，此即所謂PEST假設(shè)。該假設(shè)認(rèn)為細(xì)胞內(nèi)半衰期短于2小時(shí)的蛋白質(zhì)的氨基酸序列具有一個(gè)或一個(gè)以上富含脯氨酸（P）、谷氨酸（E）、絲氨酸（S）和蘇氨酸（T）的區(qū)域[9]?！襁@些富含PEST的區(qū)域的兩側(cè)通常（但不總是）有數(shù)個(gè)帶正電荷的氨基酸組?！袼械腜EST區(qū)域的共同點(diǎn)是局部高度集中的P、E、S或T，而天冬氨酸較少。

PEST序列能夠賦予蛋白多肽的快速分解確切機(jī)制尚未明確,然而，人們發(fā)現(xiàn)短壽的蛋白質(zhì)的分解需要的Arrhenius激活能（Ea）僅為10~15kcal/mol，長(zhǎng)壽蛋白的分解所需的Ea接近30kcal/mol。

這種不同提示存在2種分解通路，各具不同的速率限定性步驟。PEST區(qū)給予蛋白一種快速降解的易感性，從而更易發(fā)生胞內(nèi)蛋白水解。25精選課件（四）體內(nèi)蛋白的化學(xué)修飾1.體內(nèi)蛋白化學(xué)修飾的含義

少許的化學(xué)修飾是導(dǎo)致蛋白水解的首要過程。體內(nèi)蛋白的化學(xué)修飾促進(jìn)了蛋白的水解，即經(jīng)修飾的蛋白的降解速率大于相應(yīng)的未修飾的即天然的蛋白質(zhì)26精選課件已知至少有9種這樣的化學(xué)修飾，又稱“標(biāo)示步驟”（markingstep），能夠易化蛋白的水解，這些包括：●絲氨酸和蘇氨酸殘基的磷酸化，●半胱氨酸殘基的混合二硫化物衍生物的形成●賴氨酸殘基氨甲?；?、●非血紅素鐵硫中心的氧化、●賴氨酸的-氨基與泛素的結(jié)合●甲硫氨酸氧化成甲硫氨酸亞砜和甲硫氨酸砜、●谷氨酰胺和天冬酰胺殘基的脫酰胺基●糖基化●細(xì)胞色素P450酶系統(tǒng)對(duì)氨基酸的氧化。在以上化學(xué)修飾中引人注目的是細(xì)胞色素P450酶系統(tǒng)27精選課件2.化學(xué)修飾加速蛋白水解的機(jī)制

影響這種伸展型與折疊型之間的平衡的眾多因素可影響蛋白降解的速率?；瘜W(xué)修飾可使這種平衡移向伸展型，從而使伸展型濃度較高。天然的蛋白往往以折疊型存在，從而處于一種局部的最低能量構(gòu)象，在天然狀態(tài)和伸展?fàn)顟B(tài)之間能量相差5~15Kcal/mol，從而使得這兩種狀態(tài)的相互轉(zhuǎn)化十分快速。研究表明，在決定蛋白水解的易感性中，折疊型和伸展型之間的平衡可能較天然蛋白構(gòu)象本身還更為重要，故整個(gè)降解速率受平衡時(shí)伸展型濃度的控制。蛋白起初的水解性裂解是蛋白降解速率的決定性因素，且裂解最可能發(fā)生在蛋白瞬間處于伸展或部分伸展?fàn)顟B(tài)的那一時(shí)刻，存在的非天然蛋白量的增加可能導(dǎo)致降解的增加。28精選課件3.蛋白氧化與蛋白多肽藥物代謝之間的關(guān)系

MFO催化的蛋白氧化是蛋白降解的一個(gè)信號(hào)，蛋白的更新將受那些能夠影響MFO活性的因素的影響，因而，某些食物以及藥物的攝入能夠影響蛋白的降解，能夠誘導(dǎo)P450系統(tǒng)藥物，如巴比妥類就可能導(dǎo)致蛋白降解增加，有報(bào)道將環(huán)己苯巴比妥加至重建的P450系統(tǒng)，則谷氨酰胺合成酶的氧化失活增加3倍。29精選課件第2節(jié)蛋白多肽類藥物的藥物代謝動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)及其影響因素

一、蛋白多肽類藥物的代謝動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)（一）顯著的首關(guān)效應(yīng)

和小分子合成藥物相比，蛋白多肽類藥物口服具有十分明顯的首關(guān)效應(yīng)，由于這類藥物在胃酸中的不穩(wěn)定性及胃腸道和肝臟中普遍存在的蛋白水解酶，使這類藥物在到達(dá)體循環(huán)前大量降解而致生物利用度極低，故絕大部分蛋白多肽類采用胃腸外給藥途徑，特別是靜脈注射給藥

30精選課件（二）消除半衰期短

由于這類藥物體內(nèi)迅速降解，導(dǎo)致原形藥物的體內(nèi)存留時(shí)間甚短，通常半衰期僅為數(shù)分鐘或0.5~1.0小時(shí)左右，如胰島素在人體半衰期不到9分鐘，靜脈注射后1小時(shí)幾乎所有胰島素被清除，組織型纖溶酶原激活物（t-PA）半衰期為26-55分鐘，水蛭素（hirudin）為60-100分鐘。這種短半衰期迫使它們?cè)谂R床應(yīng)用時(shí)不得不采用靜脈滴注或多次頻繁給藥，以維持恒定的有效血藥水平。31精選課件（三）表觀分布容積通常較小

這類藥物通常水溶性較強(qiáng)，親脂性較差，不易透過細(xì)胞膜和生理屏障，故多數(shù)藥物的表觀分布容積相當(dāng)于細(xì)胞外液體積。如水蛭素在人體的表觀分布容積約為0.28L/kg，相當(dāng)于細(xì)胞外液體積。這類藥物在血液中的濃度往往較高，而在腦組織中的濃度較低。32精選課件（四）非線性動(dòng)力學(xué)性質(zhì)

蛋白多肽類藥物的吸收、結(jié)合和消除均可能涉及非線性飽和動(dòng)力學(xué)。125I-rhTNFDa小鼠iv25、67.5和152g.kg-1-的125I-rhTNFDa后曲線下面積分別為41、180和526g.L-1.h-1，清除率分別為0.66、0.41和0.31L/h·kg，說明隨劑量增加，125I-rhTNFDa顯示非線性藥動(dòng)學(xué)。rh-sc-uPA獼猴靜脈注射重組單鏈尿激酶型纖溶酶原激活劑（rh-sc-uPA）后t1/2和MRT隨劑量增加而延長(zhǎng)，藥-時(shí)曲線下面積明顯大于劑量的增加，全身清除率（CLs）隨劑量增加而減慢，提示研究劑量范圍內(nèi)可能涉及多個(gè)酶反應(yīng)，為劑量依賴性非線性動(dòng)力學(xué)過程。33精選課件又如肝細(xì)胞增殖因子（HGF）用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)其血漿中濃度變化時(shí)發(fā)現(xiàn)，HGF的特異性清除和非特異性清除均顯示非線性。iv低劑量（1－3g·kg-1）HGF后，分析其血漿清除率的變化時(shí)發(fā)現(xiàn)，此時(shí)主要是HGF與其受體的結(jié)合發(fā)生飽和，即特異性清除發(fā)生飽和，iv高劑量（0.3-1mg/kg）時(shí)，不僅HGF與其受體的結(jié)合發(fā)生飽和，HGF與HSPGs的非特異性結(jié)合也發(fā)生了飽和。34精選課件二．蛋白多肽類藥物藥動(dòng)學(xué)的影響因素（一）結(jié)合蛋白的影響

蛋白結(jié)合是眾所周知的小分子外源性化學(xué)藥物的非特異性現(xiàn)象，但對(duì)蛋白多肽類藥物而言，這一結(jié)合現(xiàn)象多為特異性蛋白引起的，▲受體▲抗體●結(jié)合成為一種生理作用，這些結(jié)合蛋白往往是生理學(xué)上具有活性的蛋白多肽類物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)者、激活物以及調(diào)節(jié)劑。它們可在細(xì)胞水平調(diào)節(jié)治療性蛋白多肽藥物的效能，●可影響這類藥物的體內(nèi)過程和藥動(dòng)學(xué)行為，特別是可影響治療性蛋白多肽的體內(nèi)清除并干擾其體液分析?！裨谀承┣闆r下，結(jié)合蛋白作為一種儲(chǔ)存庫使其體內(nèi)存留時(shí)間延長(zhǎng)，相反，結(jié)合蛋白也可成為其清除機(jī)制而加速這類藥物自機(jī)體的清除。35精選課件（二）種屬特異性

和小分子化合物不同，蛋白多肽具有結(jié)構(gòu)和活性種屬特異性，特別是氨基酸序列，對(duì)于相同的實(shí)體在不同種屬之間有所不同，這就有可能使得一種活性蛋白在不同種屬試驗(yàn)時(shí)變得無活性，且成為一種異物而導(dǎo)致免疫原反應(yīng)。例如，干擾素α或紅細(xì)胞生成素天然情況下是糖基化的，而其他一些如生長(zhǎng)激素和胰島素則非糖基化。業(yè)已發(fā)現(xiàn)糖基化程度亦有種屬特異性，加入糖基的緣由尚未充分了解，糖基能夠保護(hù)蛋白免遭降解和抗原識(shí)別。除去糖基后蛋白的清除率既可改變，也可不發(fā)生改變，因而在開發(fā)一種糖基化蛋白時(shí)需要對(duì)此進(jìn)行研究，因?yàn)椴溉閯?dòng)物蛋白的克隆大部分在細(xì)菌細(xì)胞中完成的，得到的是非糖基化產(chǎn)物。36精選課件（三）給藥方案依賴性藥物作用

●蛋白治療藥物的給藥方案可影響該類藥物的藥效動(dòng)力學(xué)，特別是蛋白激素類，這些激素生理情況下的分泌具有生理節(jié)律性，●外源性蛋白治療藥不同給藥速率和方式可產(chǎn)生不同的作用。

37精選課件如生長(zhǎng)激素釋放激素（GRF）半衰期很短，僅為數(shù)分鐘，按傳統(tǒng)的藥動(dòng)學(xué)原理，GRF應(yīng)連續(xù)或多次給藥以維持恒定的血藥濃度，但這與其作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑的臨床應(yīng)用相矛盾?！?dāng)連續(xù)或脈沖式靜脈給藥后，GRF變得無效，不能維持生長(zhǎng)激素的釋放，▲每天一次或兩次單劑推注，則能刺激生長(zhǎng)激素的釋放。又如生長(zhǎng)激素（GH），實(shí)驗(yàn)研究表明垂體切除的大鼠中，▲每日一劑GH引起體重和骨骼生長(zhǎng)速率的顯著增加，相同劑量的GH以每日9次脈沖式給藥使體重增加，骨骼生長(zhǎng)速率增加27%以上，▲CH連續(xù)靜脈給藥導(dǎo)致生長(zhǎng)速率的顯著降低。促性腺激素釋放激素▲連續(xù)給藥導(dǎo)致促性腺激素分泌抑制，▲脈沖式給藥則能最有效的促進(jìn)性腺激素的釋放。黃體生成素釋放激素（LHRH）▲以生理脈沖頻率（每90分鐘一次）短期、小劑量給藥時(shí)，對(duì)垂體性腺系統(tǒng)起促進(jìn)作用，▲以非生理脈沖頻率長(zhǎng)期大劑量給藥可以致垂體分泌黃體生長(zhǎng)素（LH）和卵泡刺激素（FSH），引起性腺分泌激素能力下降和性器官萎縮。這種給藥方案依賴性作用亦見于甲狀旁腺激素、松弛素、組織型纖溶酶原激活物等。38精選課件（四）蛋白的免疫原性

●

可誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗體，抗體的存在能夠失活（中和）蛋白藥物的生物活性，影響蛋白藥物的體內(nèi)分布，代謝和排泄，甚至或可能引起繼發(fā)性不良反應(yīng)和疾病，從而使得臨床前和臨床研究的結(jié)果變得難以解釋?！贵w對(duì)蛋白藥物的失活可通過封閉蛋白藥物分子中的活性中心或通過對(duì)活性以外的更為遠(yuǎn)離的部位的結(jié)合改變蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，即立體效應(yīng)而導(dǎo)致蛋白藥物活性的喪失?！贵w除可中和蛋白藥物的生物活性外，還可通過影響其藥代動(dòng)力學(xué)而進(jìn)一步影響蛋白的效能，這種影響表現(xiàn)為增加或減少抗原-抗體復(fù)合物的清除，如果生成的抗原-抗體復(fù)合物較未結(jié)合藥物本身清除更快，則蛋白藥物可因這種結(jié)合而失活，不論這種抗體是中和性的還是非中和性的。39精選課件（五）內(nèi)源性干擾

●內(nèi)源性成分對(duì)外源性蛋白的藥代動(dòng)力學(xué)產(chǎn)生干擾，因而在闡明外源性給予的蛋白藥物的確切藥代動(dòng)力學(xué)時(shí)，內(nèi)源性物質(zhì)的影響必須予以控制，如通過靜脈滴注葡萄糖和生長(zhǎng)激素抑制素以抑制胰島素和生長(zhǎng)激素的內(nèi)源性釋放，從而使得有可能對(duì)外源性胰島素和生長(zhǎng)激素的藥代動(dòng)力學(xué)作出確切解釋。還要考慮的是●外源性給予的是藥理劑量，而非生理劑量，藥理劑量的蛋白質(zhì)能改變蛋白質(zhì)的體內(nèi)過程，因機(jī)體會(huì)將藥理劑量視為生成過度而作出調(diào)節(jié)反應(yīng)?！駲C(jī)體暴露于高濃度的蛋白藥物可能導(dǎo)致不可預(yù)測(cè)的不良反應(yīng)。這些均可影響蛋白多肽類藥物的藥動(dòng)學(xué)。40精選課件（六）給藥系統(tǒng)

1.緩釋注射給藥系統(tǒng)

埋植劑和微球注射劑兩種，其中以微球注射劑最為引人注目。在諸多多肽緩釋注射劑中研究得最為成功的品種為黃體生成素釋放激素（LHRH）及其類似物曲普瑞林（triptorelin）、亮丙瑞林（leuprorelin）、布舍瑞林（baserelin）、高舍瑞林（goserelin）那法瑞林（nafarelin）LHRH在體內(nèi)易被酶降解，半衰期極短，僅3.5-5分鐘，當(dāng)用于抑制垂體-性腺系統(tǒng)功能時(shí)，需要每日給藥，一個(gè)療程3－6個(gè)月。上述緩釋制劑均以聚乳酸-羥乙酸(PLGA)為骨架材料，制成緩釋制劑，其半衰期分別延長(zhǎng)至8、16、30、80和144分鐘，丙氨瑞林（LHRH-A,alarelin）是天然LHRH的九肽擬似物，活性為L(zhǎng)HRH的15~20倍。為我國(guó)自行研制的Ⅰ類新藥。該藥為以PLGA為載體的長(zhǎng)效微球，聚合物骨架能夠保護(hù)微球內(nèi)部藥物不被降解，可緩釋一個(gè)月。納米粒給藥系統(tǒng)近年快速發(fā)展的納米粒給藥系統(tǒng)在蛋白多肽類藥物的體內(nèi)傳輸中有著極廣闊的應(yīng)用前景，可有效延長(zhǎng)這類藥物的體內(nèi)釋放，避免酶的降解，提高生物利用度。41精選課件2.口服給藥系統(tǒng)

數(shù)十年來人們一直致力于尋找適合于蛋白多肽類藥物的非注射給藥系統(tǒng)，其中主要是口服給藥系統(tǒng)，其采用的策略主要是：加入蛋白酶抑制劑，吸收促進(jìn)劑和穩(wěn)定劑以克服口服吸收中遇到的屏障作用；●腸溶包衣技術(shù)●微囊、微球技術(shù)及微乳技術(shù)；●部位特異性結(jié)腸給藥技術(shù)；●其他特殊技術(shù)，如人體紅細(xì)胞載體，具受體介導(dǎo)吞飲機(jī)制的蛋白結(jié)合物等。胰島素口服給藥系統(tǒng)的研究在所有蛋白多肽類藥物中最為突出。42精選課件3.其他非注射給藥系統(tǒng)

在蛋白多肽的非注射給藥系統(tǒng)中，鼻黏膜給藥備受關(guān)注?！褚葝u素鼻腔給藥生物利用度達(dá)10%~30%，在美國(guó)已有商品出售。腦啡肽類似物和胰高血糖素生物利用度則高達(dá)70%~90%?！褚葝u素制成氣霧劑噴霧吸入在兔體內(nèi)生物利用度達(dá)57%，●直腸給予四胃泌素（Tetragastrin）和胰島素的生物利用度分別達(dá)16%和28％?！耜幍鲤つそo予LHRH類似物生物利用度達(dá)40%－90％。43精選課件4.蛋白多肽的化學(xué)修飾

改善蛋白多肽類藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的一個(gè)主要手段是對(duì)這類藥物分子進(jìn)行化學(xué)修飾，主要將蛋白多肽與生物可降解的高分子可溶性載體（聚合物）結(jié)合形成蛋白質(zhì)-聚合物共軛體，常用的載體（聚合物）為●右旋糖酐、●白蛋白44精選課件●聚乙二醇（PEG），以PEG應(yīng)用最為廣泛?！鳳EG具有良好的水溶性，用適當(dāng)方法活化后可與各類蛋白偶聯(lián)，▲PEG無毒，▲良好的生物相容性，從而使其成為最廣泛使用的蛋白化學(xué)修飾劑?！鳳EG與蛋白多肽以共價(jià)鍵形成的軛合物的性質(zhì)較未修飾的原蛋白多肽很大改善，表現(xiàn)為◆溶解度增高，◆分子量加大，◆穩(wěn)定性增強(qiáng)，◆藥物血循環(huán)中存留時(shí)間延長(zhǎng)，生物半衰期延長(zhǎng)，◆生物利用度提高，◆免疫原性和過敏反應(yīng)降低甚至消失，而活性基本不變。45精選課件人工重組白細(xì)胞介素-2（rhIL-2）利用PEG5000修飾后，使其由疏水性變成親水性，體內(nèi)半衰期顯著延長(zhǎng)，在HIV感染患者可每周一次給藥。腺苷脫氫酶（ADA）經(jīng)PEG修飾后該酶可在血液中存留1~2周，抗原反應(yīng)降低，而未修飾的ADA進(jìn)入血液后數(shù)分鐘內(nèi)即被肝臟清除。r-水蛭素消除半衰期僅為50~100分鐘，但制成的2：1的聚乙二醇重組水蛭素結(jié)合物（PEG-hirudin）單劑iv后T1/2a為1~3h，T1/2B延長(zhǎng)至12小時(shí)，有希望成為1日1次給藥的長(zhǎng)效抗凝抗栓藥物。46精選課件組織型纖溶酶原激活物尿激酶鏈激酶葡激酶彈性蛋白酶蝮蛇抗栓酶超氧化物歧化酶L-天冬酰胺酶無基質(zhì)牛血紅蛋白牛血清白蛋白白細(xì)胞介素-2腫瘤壞死因子-抗腫瘤抗體β-葡糖苷酸酶抗體等通過與PEG形成結(jié)合物后其藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)性質(zhì)均大大改善。47精選課件5.前體藥物的應(yīng)用

將蛋白多肽藥物制成抗酶前體藥物以及親脂性更強(qiáng)的前體藥物，有利于抵抗蛋白酶的降解破壞以及增加親脂性而提高生物利用度。48精選課件6.脂質(zhì)體

作為藥物載體的脂質(zhì)體受到廣泛重視，如IL-2，IFN，天門冬酰胺酶被包埋在脂質(zhì)體內(nèi)都表現(xiàn)出較長(zhǎng)的半衰期，釋放延緩，藥效提高的特點(diǎn)，胰島素與脂質(zhì)體結(jié)合或混合后均有抗胃蛋白酶、胰蛋白酶和α糜蛋白酶降解作用，脂質(zhì)體不僅能保護(hù)被包埋的蛋白多肽藥物，延長(zhǎng)半衰期，還可提高其靶向性，并能促進(jìn)蛋白多肽類藥物的透皮吸收。

49精選課件第3節(jié)生物樣品中蛋白多肽類藥物的分析方法和傳統(tǒng)藥物比較，蛋白多肽類藥物的檢測(cè)面臨相當(dāng)大的難度，其主要原因是：●這類藥物多為生理活性物質(zhì)，化學(xué)結(jié)構(gòu)特殊，穩(wěn)定性差，體內(nèi)處置十分復(fù)雜?！裆矬w內(nèi)存在大量干擾物質(zhì)，如結(jié)構(gòu)相同或相似的內(nèi)源性蛋白多肽類物質(zhì)，細(xì)胞因子、蛋白類治療藥物降解產(chǎn)物、體液基質(zhì)、體內(nèi)結(jié)合蛋白以及針對(duì)治療藥物的抗體等。故要求檢測(cè)方法應(yīng)高度特異。如何特異地將目標(biāo)蛋白多肽分子與干擾物質(zhì)區(qū)分是迄今為止尚未完全解決的一大難題?！裨擃愃幬锷砘钚詮?qiáng)，用藥劑量很小，通常為微克級(jí)水平，致體液中藥物濃度極低，故要求檢測(cè)方法必須具有極高的靈敏度。由于存在以上困難，致使通常采用的方法如HPLC、GC不適用。目前尚無一種完全滿足蛋白多肽藥代動(dòng)力學(xué)研究要求的分析方法。50精選課件Challenge&Opportunity人用藥物注冊(cè)國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)議（ICH）對(duì)生物技術(shù)藥物臨床前安全性評(píng)價(jià)提出:●“在科學(xué)基礎(chǔ)上的靈活性和具體情節(jié)個(gè)別處理”的總則(casebycase)?！裢ǔ追N方法聯(lián)合使用，互為補(bǔ)充以獲得較可靠的結(jié)果。隨著現(xiàn)代科技的發(fā)展，已為蛋白多肽類藥代動(dòng)力學(xué)研究提供了多種分析手段。51精選課件一.生物檢定法定義：該法是利用在體和體外組織或細(xì)胞對(duì)被測(cè)活性蛋白多肽類藥物的某種特異反應(yīng)，通過劑量（或濃度）-效應(yīng)曲線對(duì)目標(biāo)蛋白多肽進(jìn)行定量測(cè)定的一種分析方法。

52精選課件這類測(cè)定方法又分：▲離體組織（細(xì)胞）培養(yǎng)技術(shù)以細(xì)胞增殖、分化或細(xì)胞毒性為基礎(chǔ)，以細(xì)胞數(shù)目的增減為量效指標(biāo)。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，許多依賴性細(xì)胞株被建立，從而增強(qiáng)了特異性和靈敏度。如rhIL6和rhTNFDa的藥動(dòng)學(xué)研究文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)曾分別采用rhIL6依賴性細(xì)胞株7TD1和TNF敏感細(xì)胞株L929測(cè)定給藥后血清藥物濃度時(shí)間變化?！羌?xì)胞培養(yǎng)方法（蛋白多肽的特異生物學(xué)反應(yīng)）如水蛭素的藥動(dòng)學(xué)研究可利用其抗凝活性進(jìn)行，如凝血酶時(shí)間測(cè)定法、生色底物法和蝰蛇毒測(cè)定法等；纖溶酶原激活物利用其溶栓作用采用纖維蛋白平板法測(cè)定?！x體組織進(jìn)行分析如催產(chǎn)素采用離體子宮法；▲在體分析法，如胰島素的小鼠血糖法等。53精選課件優(yōu)點(diǎn)是測(cè)定藥物的生物活性，缺點(diǎn)①缺乏特異性，不能定量失去活性的代謝產(chǎn)物，不能區(qū)分內(nèi)源性和外源性細(xì)胞因子；②靈敏度差，為起動(dòng)生物過程，細(xì)胞因子的濃度必須在閾水平以上，低于閾水平的樣品將不能被定量，從而降低了方法的靈敏度；③耗時(shí)，為完成分析需時(shí)間較長(zhǎng)，往往達(dá)數(shù)日或數(shù)周；④不同實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果有很大差異性，致不同單位之間的比較難以進(jìn)行，這種差異性可能來自細(xì)胞傳代的差異或細(xì)胞對(duì)某種生物學(xué)作用產(chǎn)生的獲得抵抗性。54精選課件二、免疫測(cè)定法

定義：利用直接針對(duì)被分析蛋白質(zhì)、多肽上的不同抗原決定簇部位的單克隆抗體或多克隆抗體特異地識(shí)別被分析的目標(biāo)蛋白質(zhì)，再以放射計(jì)數(shù)、比色等方法予以定量。該法系將抗原抗體反應(yīng)配以靈敏檢測(cè)的方法。常用方法有以下三種（參見第18章）。55精選課件（一）放射免疫測(cè)定法(RIA)

該法系將固定微量的標(biāo)記抗原(多為125I-Ag)和待測(cè)抗原(藥物)與已知限量的抗體(Ab)起競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合反應(yīng)，待測(cè)抗原含量與標(biāo)記抗原-抗體復(fù)合物的放射強(qiáng)度成反比。這是將同位素測(cè)量的高度靈敏度和免疫學(xué)抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)的高度特異性相結(jié)合的一種超微量分析方法，方法的特異性取決于抗原的親和力。56精選課件（二）免疫放射定量法(IRMA)

為近年發(fā)展的新方法，和RIA相似之處是同為競(jìng)爭(zhēng)性蛋白結(jié)合測(cè)定法，但不同的是IRMA將已知的特異性單克隆抗體包被在固相載體上，形成固相抗體(Ab)，加入待測(cè)血清(含待測(cè)抗原Ag)，Ag與固相Ab結(jié)合形成Ag-Ab復(fù)合物，再加入過量的特異性125I標(biāo)記單克隆抗體Ab※，形成Ab-Ag-Ab※夾心狀復(fù)合物，故具有較高的特異性，且靈敏度亦較RIA高。57精選課件（三）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)

該法的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記，結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保持其免疫性，又保留酶的活性。在ELISA法中，以雙抗體夾心法測(cè)抗原應(yīng)用最廣泛，將已知的特異性抗體包被在固相載體上，形成固相抗體，加入含相應(yīng)抗原Ag的待測(cè)標(biāo)本，Ag與固相Ab結(jié)合成復(fù)合物，再加入特異性酶標(biāo)抗體，后者與已形成的Ag-Ab復(fù)合物結(jié)合，加入酶的相應(yīng)底物，根據(jù)酶催化底物顯示的顏色深淺對(duì)待測(cè)物進(jìn)行定性和定量，(圖8-1)

。58精選課件+底物固相Ab標(biāo)本（含Ag）Ag-Ab復(fù)合物酶標(biāo)AbAb-Ag-Ab-酶復(fù)合物

圖8-1雙抗體夾心ELISA法示意圖++顯色59精選課件目前ELISA法已成為一種“備選方法”而被廣泛用于蛋白多肽類藥物的藥物動(dòng)力學(xué)研究，這是由于該法具有以下優(yōu)點(diǎn)：●高度的靈敏度由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫學(xué)反應(yīng)的結(jié)果。如白介素-5，用雙抗體夾心ELISA法的檢測(cè)限低至7.8pg/ml，較應(yīng)用鼠BCL1細(xì)胞的生物檢定法靈敏10000倍?！褫^高的特異性由于應(yīng)用抗原抗體反應(yīng)故和生物檢定法相比特異性較高?！褚子诓僮?、快速、不使用同位素、無輻射源，適用于批處理?！裨噭┦褂脡勖L(zhǎng)。

60精選課件免疫測(cè)定法存在以下缺點(diǎn)：●該法測(cè)定的是待測(cè)蛋白多肽的免疫活性而非生物活性?！裨摲ú荒軐?duì)蛋白多肽作出陽性鑒定，如確切的生化組成和序列?！褚资芏喾矫嬉蛩氐母蓴_：▲一種形式的干擾來自代謝產(chǎn)物，如果它們?cè)谠嗡幍拿庖邷y(cè)定中具有交叉反應(yīng)性，就能顯著干擾生物利用度的測(cè)定?！硪环N干擾來自抗體的形成，這在臨床前研究尤為突出，因?yàn)榻o予的人蛋白對(duì)動(dòng)物明顯是外源性的。這些抗體可能是中和性的或非中和性的，它們可影響蛋白多肽類藥物的清除和藥理作用，并對(duì)其定量測(cè)定產(chǎn)生影響?！Y(jié)合蛋白的存在也能夠構(gòu)成蛋白多肽類藥物測(cè)定的嚴(yán)重的干擾，甚至可使直接的免疫學(xué)測(cè)定毫無價(jià)值。對(duì)于低親和力結(jié)合蛋白的干擾可用稀釋法加以克服，但樣品的稀釋可降低檢測(cè)的靈敏度；稀釋法不能克服高親和力結(jié)合蛋白的干擾，可能需要采用抽提的方法以排除這些干擾?！|(zhì)效應(yīng)免疫學(xué)測(cè)定還受基質(zhì)特異的影響，生物體液以及緩沖液的不同往往能夠改變蛋白的反應(yīng)性，某些可通過向血清樣品中加入免疫球蛋白予以處理，檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線必須用相關(guān)的生物體液加以建立。61精選課件三.同位素標(biāo)記示蹤法