二液相色譜實驗步驟和方法開發(fā)

二液相色譜實驗步驟和方法開發(fā)第1頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三提綱：一.HPLC的廣泛應(yīng)用二.方法開發(fā)過程一）選擇HPLC檢測器二）分配色譜及選擇流動相三）方法開發(fā)的具體步驟四）梯度洗脫方法第2頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三一.HPLC的廣泛應(yīng)用

據(jù)2004年統(tǒng)計，世界上化合物總數(shù)多達4700多萬種在全部有機化合物中僅有20％左右的樣品適用于GC分析而HPLC可對80％左右的有機化合物進行分離和分析第3頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三HPLC的廣泛應(yīng)用HPLC特別適用于高沸點、大分子、強極性和熱穩(wěn)定性差的化合物以及生物活性物質(zhì)的分離和分析并且可以做制備在醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)、生命科學(xué)、化工、環(huán)保等領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用潛力。第4頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三HPLC的應(yīng)用領(lǐng)域在食品研究中的分析應(yīng)用食品中的天然成分碳水化合物類脂化合物、甘油三酸酯、膽固醇脂肪酸和有機酸蛋白、肽、氨基酸食品添加劑酸味劑、甜味劑、香精、乳化劑抗氧化劑、防腐劑顏料和染料（色素〕維生素污染物霉菌（黃曲霉毒素〕農(nóng)藥殘留和獸藥殘留多環(huán)芳烴（PAHS〕和亞硝酸第5頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三HPLC的應(yīng)用領(lǐng)域

在醫(yī)藥研究中分析應(yīng)用藥物分析有USP、BP、CP等標準

常用藥物研究中的應(yīng)用：解熱鎮(zhèn)痛藥、鎮(zhèn)靜藥、安定藥、心血管藥、磺胺類消炎藥等。甾體藥物研究中的應(yīng)用：腎上腺皮質(zhì)激素、雄性激素、雌性激素和孕激素等?？咕仡愃幬镅芯恐械膽?yīng)用：青霉素、頭孢菌素、慶大毒素、四環(huán)素、氯霉素、諾氟沙星等。中草藥研究中的應(yīng)用：生物堿、甙類(皂甙、強心甙、黃酮甙等)、萜類手性藥物研究中的應(yīng)用：光學(xué)異構(gòu)體的拆分(如解毒劑D-青霉胺毒性小，L-異構(gòu)體毒性很強)醫(yī)療藥物的檢測、新藥研究、藥物代謝、藥代動力學(xué)研究。

在獸藥研究中分析應(yīng)用

第6頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三HPLC的應(yīng)用領(lǐng)域

在生物化學(xué)和生物工程中的應(yīng)用氨基酸、多肽合成和蛋白質(zhì)的分析研究核堿、核苷、核苷酸和核酸的分析研究生物胺的分析研究（兒茶酚胺類)

在精細化工分析中的應(yīng)用醇、醛和酮、醚的分離分析酸和酯的分離分析表面活性劑的分析聚合物的分析研究藥物、農(nóng)藥、染料、炸藥等工業(yè)產(chǎn)品第7頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三HPLC的應(yīng)用領(lǐng)域化妝品行業(yè)要控制和分析：防腐劑、防曬劑、性激素以及維生素等；在公安、刑警破案工作需要

投毒藥物、毒品分析等在環(huán)境污染分析中的應(yīng)用廢氣、廢水、廢渣中多環(huán)芳烴、多氯聯(lián)苯、農(nóng)藥殘留、酚類和胺類的檢測

在無機離子分析中應(yīng)用飲用水、酸雨、土壤中陰離子和陽離子分析

第8頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三二.方法開發(fā)的過程Adaptedfrom:Snyder,L.R.;Kirkland,J.J.;Glajch,J.L;PracticalHPLCMethodDevelopment2ndEd.,Wiley-Interscience,NewYork,1997,p.21.得到樣品信息，確定分離目標2.確定特定HPLC過程、樣品預(yù)處理等的需求3.選擇合適的檢測器4.選擇HPLC方法；初步分離；建立最佳分離條件5.優(yōu)化分離條件6.檢查特定過程的問題及需要7.定量校正8.日常使用的確認第9頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三第一步干什么?想辦法得到各種信息向同行了解是否做過此類樣品，或有否類似樣品的分析方法查文獻和方法，如CA,AA,AOAC,EPA---儀器制造商的文獻，如Dionex,Waters對色譜柱有足夠的了解掌握分離機理，自己開發(fā)方法充分了解您自己的樣品第10頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三分析時要了解哪方面的情況？靈敏度的要求有多高?樣品的本底是否很復(fù)雜?有多少組份要分析?對分析的精確度、準確度等有多高要求?是否因是日常檢驗，而要求方法容易使用?第11頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三分離(制備)時要了解哪方面的情況？要分離（即制備）的樣品量有多大?要分離的組份在樣品中的含量很高?還是微量?是否需要保持生物活性?對分離產(chǎn)物純度的要求有多高?純度或活性的鑒定如何完成?第12頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三使用文獻方法注意點色譜柱填料的種類、品牌是否相同?注意文獻方法的流動相是否損害色譜柱?如色譜填料品牌不同，需要調(diào)整流動相注意色譜柱的規(guī)格：內(nèi)徑、柱長需要調(diào)整流速、進樣量注意梯度條件了解系統(tǒng)的滯后體積（梯度）第13頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三一）選擇HPLC檢測器對樣品有響應(yīng)并有一個輸出信號應(yīng)該提供在檢測器響應(yīng)值與樣品濃度之間的線性關(guān)系；并且所設(shè)計的校正技術(shù)應(yīng)該促進這種關(guān)系但是：由于受HPLC系統(tǒng)其他部件的影響會產(chǎn)生響應(yīng)與濃度之間關(guān)系的與線性偏離現(xiàn)象并不是所有的檢測器是線性的受HPLC系統(tǒng)其他部件的影響，檢測器的表現(xiàn)可能與其最佳水平有較大的差距第14頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三用于HPLC的檢測器沒有任何一種單獨的檢測器可以適應(yīng)所有的液相色譜分離！HPLC檢測器可以分為：溶質(zhì)性質(zhì)檢測器（選擇型）對溶質(zhì)的物理或化學(xué)性質(zhì)響應(yīng)，一般不反應(yīng)流動相的變化（選擇型）整體性質(zhì)檢測器（通用型）不管是否有溶質(zhì)，對流動相任何物理性質(zhì)的變化作出響應(yīng)（通用型）第15頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三理想的HPLC檢測器高靈敏度；可忽略的基線噪音寬的線性范圍獨立于流動相及操作參數(shù)的響應(yīng)對壓力、溫度及流速等變化不敏感長時間操作的穩(wěn)定性低死體積非破壞性選擇性第16頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三靈敏度：信噪比靈敏度是信號與噪音的比值；即峰高與基線噪音的比值（S/N）檢測限（LOD）：S/N=3定量限（LOQ）：S/N=10好的信噪比有利于：更好的色譜峰確認更好的定量更好地完成色譜峰純度/均一性 6:1NS第17頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三選擇液相色譜的檢測器要考慮的因素：你要分離的化合物/樣品的化學(xué)特性化學(xué)結(jié)構(gòu)、分子量及紫外光譜等等流動相的影響（溶劑、緩沖鹽改性劑等）梯度還是等度靈敏度需求是否有雙檢測的需求第18頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三選擇液相色譜的檢測器通用檢測器 RIELSD MS靈敏度 ug ng pg 線性范圍 104

否 103流速敏感 是 否 是溫度敏感 是 否 否破壞性 否 是 是選擇性檢測器 ABS FL ECCond MS靈敏度 ng pg fg pg pg線性范圍 105 103 106 105 103流速敏感 否 否 是 是 是溫度敏感 否 否 是 是 是破壞性 否 否 是 否 是第19頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三吸光度（UV/Vis）檢測原理原理：基于被分析組分對特定波長紫外光的選擇性吸收定量基礎(chǔ)：比耳定律，A＝KCL優(yōu)點：1）對溫度和流速不敏感

2）可用于梯度洗脫

3）靈敏度較高，ng級檢測缺點：選擇性檢測器，僅適用于測定有紫外吸收的物質(zhì)第20頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三吸光度（UV/Vis）檢測的應(yīng)用大多數(shù)有機化合物有一定程度的吸光度，可以測定大多數(shù)的化合物，是目前實驗室中使用最多的檢測器

--多數(shù)公司售出的檢測器中75%以上是吸光度檢測器（其中50%以上是紫外/可見檢測器，25%是PDA）第21頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三背景吸收的影響背景吸收降低了線性范圍多數(shù)流動相有紫外吸收實際濃度理想10吸光度210背景吸收第22頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三光電二極管矩陣（PhotoDiodeArray）PhotoDiodeArray簡稱：PDA或DAD第23頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三光電二極管矩陣檢測器（PDA）的特點和用途

一種三維水平的吸光度檢測器--采集三維譜圖兼顧紫外檢測器及可見分光光度計的信息在收集色譜圖的同時，得到光譜圖提供許多有用的功能

-色譜峰的純度鑒定，色譜峰的確認

-可以發(fā)現(xiàn)單波長檢測時未測到的峰

-任意波長的色譜再處理

-光譜信息-光譜庫的建立檢索和擬合

第24頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三熒光（Fluorescence）檢測原理

原理：發(fā)熒光的化合物吸收光（UV或VIS）使其分子達到激發(fā)態(tài)，當其返回到基態(tài)時發(fā)射光的現(xiàn)象即熒光優(yōu)點：熒光檢測器靈敏度高,pg級檢測缺點：不是所有化合物都有熒光，必要時需要衍生

第25頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三熒光檢測器原理第26頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三熒光檢測器的應(yīng)用

環(huán)境中的污染物多環(huán)芳烴(PAH)，多酚，氨基甲酸酯等食品、飲料食品中的毒素；例如：黃曲霉毒素染料維生素及衍生氨基酸生物技術(shù)及制藥氨基甲酸酯類殺蟲劑黃曲霉毒素多環(huán)芳烴（PAH）維生素第27頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三示差折光（RefractiveIndex）檢測示差折光檢測器（RI）是第一個商品化的液相色譜檢測器（上世紀六十年代末、七十年代初）通常被認為是一種通用檢測器檢測溶液中所有被溶解的溶質(zhì)－非特異性任何光學(xué)介質(zhì)的折光率都被定義為光在該介質(zhì)中與真空中的速度之比值RS第28頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三

示差折光（RI）檢測的原理原理：連續(xù)測定流通池中溶液折射率來測定試樣各組分濃度。優(yōu)點：通用型檢測器缺點：1）對溫度變化敏感

2）不能用于梯度檢測

3）靈敏度低，ug級檢測返回第29頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三示差檢測器的應(yīng)用示差折光檢測器是通用型檢測器,如果選擇合適的溶劑，幾乎所有的物質(zhì)都可以檢測特別適用于檢測沒有紫外吸收的化合物,例如糖類,醇類,酯類以及脂肪酸等高分子化合物GPC,GFC分析以及復(fù)雜樣品純化第30頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三蒸發(fā)光散射（ELSD）原理用氮氣把流動相吹成細霧狀流動相的液滴通過一個預(yù)加熱的腔體后被蒸發(fā)掉蒸發(fā)的溶劑被從檢測器中除去溶質(zhì)的揮發(fā)性小于流動相，因此產(chǎn)生顆粒束與光束相交被顆粒散射的光由光電倍增管（PMT）收集PMT的輸出與溶質(zhì)的存在量呈比

例關(guān)系第31頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三ELSD－優(yōu)點及應(yīng)用領(lǐng)域通用型－比流動相揮發(fā)性小的物質(zhì)都能被檢測可以作梯度實驗；檢測下限可到納克級水平對環(huán)境條件不敏感；可以使用有強紫外吸收的溶劑作流動相應(yīng)用領(lǐng)域：碳水化合物油脂及脂肪酸未衍生的氨基酸制藥行業(yè)表面活性劑天然產(chǎn)物第32頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三ELSD－缺點不能使用不揮發(fā)性的流動相（例如：磷酸鹽）要求使用霧化氣源（典型的是氮氣或空氣）不同的色譜條件下霧化及除溶劑的參數(shù)需要重新優(yōu)化破壞性技術(shù)蒸發(fā)出的溶劑要引到戶外或通風(fēng)櫥里對揮發(fā)性化合物的檢測不理想一般得到的是非線性校正曲線某些化合物的檢測靈敏度不如其他檢測器第33頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三二）色譜基本分類

色譜基本分類：按溶質(zhì)（樣品）在兩相分離過程的物理化學(xué)性質(zhì)可以分為：

1.分配色譜—分配系數(shù)***

2.親和色譜—親和力

3.吸附色譜--吸附力

4.離子交換色譜—離子交換能力

5.凝膠色譜（體積排阻色譜）--分子大小引起的體積排阻第34頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三分配色譜分配色譜分為：正相色譜：固定相（填料）為極性，流動相為非極性反相色譜：固定相（填料）為非極性，流動相為極性。用得最多，約占60-70%相對應(yīng)的色譜柱：反相柱：烷基硅烷鍵合硅膠填料，如C18（ODS）

C8,C4,C3，苯基等正相柱：典型的為硅膠柱，其它官能團為-CN氰基，

-NH2氨基等第35頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三分配色譜的分離機理第36頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三分配色譜概述反相色譜的主要類型，基于分子的極性分離洗脫次序：一般為反相，即極性高的先被洗脫第37頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三流動相極性第38頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三流動相洗脫強度反相色譜最常用的流動相及其洗脫強度：水<甲醇<乙腈<乙醇<丙醇<異丙醇<四氫呋喃最常用的流動相組成“甲醇-水；乙腈-水”正相色譜最常用的流動相及其洗脫強度：正己烷<乙醚<乙酸乙酯<異丙醇**應(yīng)用添加劑，成為離子對、離子抑制方法第39頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三流動相的選擇原則樣品易溶，且溶解度盡可能大化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不損壞柱子不妨礙檢測器檢測，所選波長處無吸收*黏度低，流動性好*無毒或低毒，易于操作易于從其中回收樣品易于制成高純度，即色譜純廢液易處理，不污染環(huán)境第40頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三三）方法開發(fā)的具體步驟先用一根短的色譜柱用相對較高的流速使用盡可能純度高的標準品先用高強度的洗脫液調(diào)節(jié)k’值改變保留值調(diào)節(jié)a值改變選擇性通過改變流動相的pH值，使樣品成中性加入“對離子”，使樣品呈中性調(diào)節(jié)柱長度改變柱效及分離速度第41頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三反相色譜的方法開發(fā)開發(fā)過程實例色譜條件∶色譜柱：C18，4.6mm×15mm流動相：乙腈/水，乙腈從100%逐漸降低（或走梯度）舉例中用不同的溶劑強度，60/40、50/50、40/60，由強漸弱流速：1ml/min樣品：①對羥基苯甲酸甲酯(MethylParaben)②對羥基苯甲酸丙酯(PropylParaben)③對羥基苯甲酸丁酯(ButylParaben)第42頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三1.改變?nèi)萘恳蜃?/p>

K’譜圖第43頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三同樣強度的不同溶劑，改變了流動相α值改變色譜柱2.調(diào)節(jié)α值改變選擇性第44頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三離子型化合物的色譜分離離子型化合物的分離方式多數(shù)化合物是離子型的！使用離子交換柱：離子交換法主要用于“強”陰、陽離子使用反相柱離子抑制色譜法：通過改變流動相的pH值，使樣品成中性離子對色譜法：加入“對離子”，使樣品呈中性第45頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三3.離子抑制色譜離子型化合物在反相色譜柱上不保留改變流動相的pH值，抑制樣品離子的電離使樣品成中性適用于弱酸性化合物的分離加入TFA,磷酸鹽等降低流動相的pH值，使樣品降低離子化使用硅膠基質(zhì)C18填料使用條件應(yīng)在填料基質(zhì)的范圍內(nèi)硅膠柱的pH在2-8（較保險值3-7）內(nèi)第46頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三離子抑制色譜實例而在乙腈/水并且pH=7時，多數(shù)組份保留時間很短，無法完全分離。對甲氧基苯甲酸苯甲酸納苯甲醛三甲氧基-四羥基苯甲醛第47頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三離子抑制色譜的使用范圍下列情況下不能使用離子抑制方法，如果：一些酸在pH低于2時還保持離子化一些堿在pH高于7時還保持離子化可以有以下的選擇離子交換色譜使用聚合物或其他耐堿性流動相的反相柱，在pH高于7時用離子抑制法使用“離子對色譜法” 第48頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三4.離子對色譜法在反相色譜流動相內(nèi)加入“離子對”試劑與樣品中可電離的組份形成“對離子”在反相色譜柱上分離離子型化合物離子對試劑的類型季銨鹽、叔胺鹽（正離子），適用于弱酸烷基磺酸鹽、高氯酸鹽（負離子），適用于弱堿烷基長度不同，形成對離子的能力不同第49頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三離子對色譜機理第50頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三

抗組胺及減充血劑藥物的分析離子對色譜的應(yīng)用第51頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三離子對色譜分析水溶性維生素第52頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三用離子對、還是用離子抑制方法？第53頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三方法開發(fā)的其他因素流速對柱效的影響不同內(nèi)徑的色譜柱有自己的最佳流速樣品的進樣量(濃度)對柱效的影響樣品的進樣體積對柱效的影響溶劑粘度對柱效的影響 以上因素均影響分離度第54頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三色譜方法轉(zhuǎn)換如果沒有與文獻或要求相近的色譜柱轉(zhuǎn)換進樣量轉(zhuǎn)換流速第55頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三

四）液相色譜方法開發(fā)

梯度洗脫方法第56頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三在這一部分您將學(xué)習(xí):關(guān)于梯度洗脫過程及其優(yōu)點.

如何優(yōu)化梯度分離.

有關(guān)梯度分離的一些實用考慮.第57頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三液相色譜泵穩(wěn)定平滑并且重現(xiàn)性好的流速可靠且充分的溶劑混合準確及重現(xiàn)的自動溶劑混合準確及重現(xiàn)的梯度形成有效的流速范圍制備色譜或微柱、窄柱色譜要考慮滯后體積梯度分析更為關(guān)注目的：在任何情況下保持最高精度第58頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三梯度的洗脫方式高壓梯度及低壓梯度第59頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三梯度滯后：系統(tǒng)體積的影響死體積/譜帶展寬體積(無色譜柱時)滯后(系統(tǒng))體積滯后(系統(tǒng))體積溶劑輸送系統(tǒng)(泵)檢測器進樣器色譜柱梯度混合器溶劑輸送系統(tǒng)(泵)高壓梯度注意∶滯后體積包括進樣器、阻尼器、混合器及其管路比例閥檢測器進樣器ABCD色譜柱溶劑輸送系統(tǒng)(泵)低壓梯度阻尼器混合器第60頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三梯度滯后大小的影響滯后體積太大會引起梯度變化的延遲例如：滯后體積為2.0ml，流速1.0ml/min實際梯度會比設(shè)置值晚2分鐘響應(yīng)，沒有問題對微柱色譜影響更大，同上例但流速0.1ml/min實際梯度會比設(shè)置值晚20分鐘響應(yīng)，不能接受滯后體積的不同會使方法轉(zhuǎn)換麻煩滯后體積比文獻大或小都會使方法不能重現(xiàn)滯后體積的變化會導(dǎo)致梯度重現(xiàn)性不好普通分析型液相色譜的滯后體積為1~4ml（戴安的4元泵<700μl，高壓泵<400μl

）第61頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三滯后體積變化的影響設(shè)計不好的HPLC系統(tǒng)，滯后體積隨反壓變化滯后體積隨反壓變化的后果：梯度的準確性不好，造成：方法的適應(yīng)性不好用靜態(tài)梯度混合器；固定滯后體積可明顯改善梯度特性梯度百分比保留時間梯度曲線好的梯度滯后曲線保留時間梯度百分比不好的梯度滯后曲線固定滯后體積，改善了梯度性能普通的低壓梯度系統(tǒng)第62頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三色譜柱反壓變化對梯度實驗的影響P680ALPGwithoutpulsedamperBack-pressure:

60bar,85barand

105barVariation:<1%5681012-100200400600900mAUMinutesMethylparabeneEthylparabenePropylparabeneButylparabene5681012-100200400600900mAUMinutesMethylparabeneEthylparabenePropylparabeneButylparabenePumpwithpulsedamperBack-pressure:

60bar,85barand

105barVariation:>2%Acclaim120,C18,5μm,4.6x100mm;0.5mL/min;25°C;5μLinjectionvolume;UVdetectionat256nm;Eluent(A)Waterand(B)Acetonitril;Gradient:30%bto100%Bin10min;Methyl-,Ethyl-,Propyl-andButylparabene,10mg/Leach第63頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三梯度洗脫的特點優(yōu)點縮短分析時間增加分離能力檢測靈敏度提高缺點儀器設(shè)備要求高不適合某些檢測方式(RI)柱需再生平衡定量分析的重復(fù)性較低？第64頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三一般流出問題早流出峰的分離度差.遲流出峰的峰寬增加而峰高降低.由于k’范圍寬，所以分析時間長.強保留組分造成柱污染.等梯度洗脫

-在洗脫樣品的整個過程中，流動相的組成保持不變.第65頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三AnalyticalEducationCenterH5929A11-09梯度洗脫-一個解決方案優(yōu)點改善分離度提高檢測性能能夠分離復(fù)雜樣品縮短分析時間降低由于強保留組分而使色譜柱性能變差的可能性其他應(yīng)用柱清洗方法開發(fā)中的嘗試運行梯度洗脫-在分離過程中改變流動相組成.第66頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三梯度運行中發(fā)生了什么?增加有機改性劑的含量分配轉(zhuǎn)移到流動相增加化合物的流速第67頁，共76頁，2023年，2月20日，星期三梯度方法開發(fā)-優(yōu)化溶劑梯度5%有機相100%有機相從嘗試運行開始