蛋白質的提取課件

第四章生物化學與分子生物學技術實踐第一節(jié)生物成分的分離與測定技術蛋白質的分離與純化蛋白質的性質蛋白質分離和純化蛋白質的分離步驟蛋白質的純化方法蛋白質含量的測定蛋白質純度等的測定蛋白質存在于生物體的組織細胞中，不同的生物體組織細胞所含的蛋白質種類、數(shù)量也不盡相同。一、蛋白質的性質由于蛋白質的分子量很大，它在水中能夠形成膠體溶液。蛋白質溶液具有膠體溶液的典型性質，如丁達爾現(xiàn)象、布郎運動等。由于膠體溶液中的蛋白質不能通過半透膜，因此可以應用透析法將非蛋白的小分子雜質除去。2、蛋白質的膠體性質蛋白質膠體溶液的穩(wěn)定性與它的分子量大小、所帶的電荷和水化作用有關。改變?nèi)芤旱臈l件，將影響蛋白質的溶解性質在適當?shù)臈l件下，蛋白質能夠從溶液中沉淀出來。3、蛋白質的沉淀作用在溫和條件下，通過改變?nèi)芤旱膒H或電荷狀況，使蛋白質從膠體溶液中沉淀分離。在沉淀過程中，結構和性質都沒有發(fā)生變化，在適當?shù)臈l件下，可以重新溶解形成溶液，所以這種沉淀又稱為非變性沉淀?？赡娉恋硎欠蛛x和純化蛋白質的基本方法，如等電點沉淀法、鹽析法和有機溶劑沉淀法等?？赡娉恋淼鞍踪|的性質與它們的結構密切相關。某些物理或化學因素，能夠破壞蛋白質的結構狀態(tài)，引起蛋白質理化性質改變并導致其生理活性喪失。這種現(xiàn)象稱為蛋白質的變性。4、蛋白質的變性蛋白質的變性變性蛋白質通常都是固體狀態(tài)物質，不溶于水和其它溶劑，也不可能恢復原有蛋白質所具有的性質。所以，蛋白質的變性通常都伴隨著不可逆沉淀。引起變性的主要因素是熱、紫外光、激烈的攪拌以及強酸和強堿等。大部分蛋白質均含有帶芳香環(huán)的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。這三種氨基酸的在280nm附近有最大吸收。因此，大多數(shù)蛋白質在280nm附近顯示強的吸收。利用這個性質，可以對蛋白質進行定性鑒定。5、蛋白質的紫外吸收研究蛋白質的結構、性質和功能，首先需要得到純的蛋白質樣品。(1)蛋白質來源：微生物細胞、動物細胞和植物細胞；(2)隨時測定蛋白質活性并檢測蛋白質含量。(3)分離和純化過程都必須在溫和的條件下進行。(1)生物組織的機械破碎。常用的方法有研磨法、超聲波法和酶解法等。(2)根據(jù)蛋白質的特性，選擇不同的溶劑進行抽提。水溶性蛋白用中性緩沖溶液（透析液）抽提，酸性蛋白用稀堿性溶液抽提，脂溶性蛋白用有機溶劑抽提等。(3)粗提:離心除去固體雜質后，可通過沉淀法、超濾法、萃取法等處理，得到蛋白質粗制品。(4)提純：可用層析法、電泳法等進行提純。(5)成品加工：測定蛋白質的性質并干燥成成品。1．蛋白質的分離步驟血紅蛋白提取和分離步驟具體操作步驟（一）（二）（三）（四）1.洗滌紅細胞1.1洗滌的目的：洗去血液中血漿及血小板等中的雜蛋白1.2洗滌過程：血液100mL3g檸檬酸鈉低速離心2min紅細胞血漿吸出血漿紅細胞5倍體積生理鹽水緩慢攪拌10min重復洗滌3次，直至上清液沒有防止破壞紅細胞，使血紅蛋白流失（一）樣品處理黃色2.血紅蛋白的釋放原理：紅細胞滲透作用吸水漲破，釋放血紅蛋白3.分離血紅蛋白溶液分離過程：紅細胞混合液離心管甲苯層脂類物質血紅蛋白層破碎物沉淀層高速離心10min濾紙過濾脂類物質沉淀物燒杯分液漏斗★注意事項★（1）生理鹽水作用？（3）兩次離心的差異？（4）透析袋的作用機理？模擬紅細胞生存環(huán)境，保持紅細胞結構完整。破碎紅細胞；溶解細胞膜釋放血紅蛋白。前慢后快，前短后長。滲透作用（2）蒸餾水和甲苯的作用？離心沉降法凝膠色譜法萃取法層析法電泳法（三）純化1.凝膠色譜法

（1）原理：（2）材料：凝膠大分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動快；小分子穿過多孔凝膠顆粒的內(nèi)部，路程長，流動慢。凝膠是微小的多孔性球體，如葡聚糖或瓊脂糖。內(nèi)部有許多貫穿的通道.根據(jù)相對分子質量的大小分離蛋白質的方法概念：凝膠色譜法純化蛋白質1）原理：不同蛋白質的帶電性質（正電荷或負電荷）、電量、形狀和大小不同，在電場中受到的作用力大小、方向、阻力不同，導致不同蛋白質在電場中的運動方向和運動速度不同。電泳：帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程（四）純度鑒定—電泳實驗四血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳【目的要求】1、掌握電泳技術的一般原理和基本操作過程。2、熟悉血清中蛋白分類以及電泳分離操作?！緦嶒炘怼?/p>

1.電泳：是指帶電粒子在電場中向本身所帶電荷相反的電極移動的現(xiàn)象。在一定pH條件下，不同的蛋白質由于具有不同的等電點而帶不同性質的電荷，因而在一定的電場中它們的移動方向和移動速度也不同，它們的電泳遷移率不同。V=EQ/(6πrη)M=V/E=Q/(6πrη)V：電泳速度M：遷移率E：電場強度Q：顆粒帶電荷量r：球形分子半徑η：介質粘度【實驗原理】

2.影響電泳的因素：

內(nèi)在因素：蛋白所帶凈電荷的量、蛋白的大小和形狀

外界因素：電場強度、溶液的pH值、溶液的離子強度和電滲現(xiàn)象影響蛋白質分子運動速度的因素

決定運動方向電場作用力形成阻力決定運動速率電荷性質電荷量分子形狀分子大小√√√√√√√3.醋酸纖維素溶于有機溶劑（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均勻的薄膜則成為醋酸纖維素薄膜。該膜具有均一的泡沫狀的結構，厚度約為120μm，有很強的通透性，對分子移動阻力很小。該薄膜電泳具有微量、快速、簡便、分辨力高，對樣品無拖尾和吸附現(xiàn)象等優(yōu)點血清蛋白參考值等電點分子量（kDa）占總蛋白的百分數(shù)(%)清蛋白4.646961~71α1球蛋白5.062003~4α2球蛋白5.063006~10β球蛋白5.1290~1507~11γ球蛋白6.85156~9509~184.經(jīng)醋酸纖維素薄膜電泳可將血清蛋白按電泳速度分為5條區(qū)帶，從正極端依次為清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白及γ球蛋白，經(jīng)染色可計算出各蛋白質的百分含量?！緦嶒炂鞑摹?.DYY-6C型

雙穩(wěn)定時電泳儀和DYY-Ⅲ型電泳槽2.醋酸纖維薄膜（2cm×8cm）：1片/人。3.培養(yǎng)皿：一排桌子公用5套，包括平衡、染色各用一套，漂洗用3套。4.點樣器：載玻片。5.濾紙：公用。6.鑷子：一個/組?！緦嶒炘噭?、巴比妥-巴比妥鈉緩沖液(pH8.6，0.07mol/L，離子強度0.06)2、0.5%氨基黑10B染色液3、漂洗液1.浸泡將2×8cm醋酸纖維薄膜置于電泳緩沖液中，浸泡15min左右，至完全浸透，方可用于點樣?！緦嶒灢僮鳌?/p>

2.點樣用鑷子取出浸透的薄膜，夾在兩層粗濾紙內(nèi)吸干多余的緩沖液，迎光判斷光面與無光澤面。用邊緣整齊的玻片沾取少量無溶血血清，垂直按壓于醋纖膜標號一端約1.5-2㎝處(約2～3μl)3.電泳將點樣端的薄膜平貼在陰極濾紙橋上（點樣面朝下），另一端平貼在陽極濾紙橋上(見下圖)。要求薄膜緊貼濾紙橋并繃直，中間不能下垂。平衡片刻(2-3min)；使其自然充滿緩沖液；而后電壓120V，電流0.4～0.6mA/㎝，通電45分鐘。

4.染色：電泳完畢后將薄膜取下,放在含氨基黑10B染色液的培養(yǎng)皿中浸泡3-5min5.漂洗：將薄膜從染色液中取出后移置漂洗液中漂洗數(shù)次(3-4次)，直至條帶清晰為止，可得到色帶清晰的電泳圖譜。6.記錄和分析實驗結果

漂洗完畢后將薄膜取出,放在濾紙上。將薄膜上的5條色帶根據(jù)其顏色深淺、形狀、大小及相對位置進行描述、記錄在預習本上，并判斷分析其結果?！咀⒁馐马棥?、點樣前，應將薄膜表面多余的緩沖液用濾紙吸去，吸水量以不干不濕為宜。2、薄膜的浸潤與選擇正確膜面是電泳成敗的關鍵之一。3、點樣應點在薄膜的毛面上，點樣量要適量，不宜過多或過少。4.手盡量不要觸及薄膜，用鑷子夾取。5、點樣時，動作要輕、穩(wěn)，用力不能太大，以免損壞膜片或印出凹陷影響電泳區(qū)帶分離效果。垂直點樣。6、電泳時應將薄膜的點樣端置于電泳槽的負極端，且點樣面向下。7、電泳開始后，不能再取放薄膜，以防觸電。如必需進行，要先關閉電源。8、應控制染色時間。時間長，薄膜底色不易脫去；時間太短，著色不易區(qū)分，或造成條帶染色不均勻，必要時可進行復染?！舅伎碱}】電泳圖譜清晰的關鍵是什么？如何正確操作？本堂小結本節(jié)內(nèi)容目標：血紅蛋白的分離和純化獲取紅細胞（離心）破碎紅細胞，釋放血紅蛋白從各紅細胞的成分中獲取血紅蛋白（離心）初步純化血紅蛋白（透析）從生物材料中提取某些特定成分背景知識早在古代，人類就已發(fā)現(xiàn)芳香氣味的植株或花卉能使人神清氣爽，將這些植物制成干品后，可當做藥物和香料使用。但是，植物香料易揮發(fā)，不易儲存。歐洲中世紀香料貿(mào)易的發(fā)展，促成了植物芳香油提取技術的誕生。

16世紀，制備植物芳香油的技術已相當成熟。19世紀，有機化學迅速發(fā)展，人們通過分析植物芳香油的化學成分，找到了芳香的根源，進而合成了人造香料。如今，植物芳香油廣泛地應用于輕工、化妝品、飲料和食品制造的方面?；A知識動物：植物：微生物：主要來源于麝、靈貓、海貍和抹香鯨等天然香料的來源根、莖、葉、花、果實、種子真菌植物芳香油的物理性質:植物芳香油的化學本質:具有很強的揮發(fā)性主要包括萜類化合物及其衍生物植物芳香油的提取方法：植物芳香油選擇方法的依據(jù)：根據(jù)植物原料的特點來決定蒸餾、壓榨、萃取提取植物芳香油的常用方法：提取植物芳香油常用方法的原理：水蒸氣蒸餾法：水中蒸餾法、水上蒸餾法、水氣蒸餾法利用水蒸氣將揮發(fā)性較強的植物芳香油攜帶出來，形成油水混合物，冷卻后，油水混合物又重新分出油層和水層水中蒸餾適于某些鮮花、破碎果皮和不易粘結的原料。但水中蒸餾精油中的酯類成分易水解，所以含酯類高的香料植物不能采用這種方法。1.水中蒸餾又稱隔水蒸餾，是把原料置于蒸餾鍋內(nèi)的篩板上，篩板下盛放一定水量以滿足蒸餾操作所需的足夠的飽和蒸汽，水層高度以水沸騰時不濺濕原料底層為原則。2.水上蒸餾水上蒸餾應用較廣，大面積種植的芳香植物為薄荷、香茅、桉樹葉等都用水上蒸餾提取精油；此法也適用于粉碎后的干燥原料包括某些干花。是由外來的鍋爐蒸汽直接進行蒸餾。通常在篩板下鍋底部位裝有一條開小孔的環(huán)形管，鍋爐來的蒸汽通過小孔直接噴出。通過篩板的篩孔進入原料層加熱原料。由鍋爐來的蒸汽是具有一定蒸汽壓力，溫度較高而含濕量又較低的飽和蒸汽，能很快加熱料層，因此，對干料加熱蒸餾時，干料必須在裝鍋前預先濕透。直接蒸汽蒸餾，其蒸餾速度快，溫度高，可縮短蒸餾時間，高沸點的成分可蒸出，出油率高。3.直接蒸汽蒸餾

因為水中蒸餾會導致原料焦糊和有效成分水解等問題原因：提取柑橘芳香油的方法：通常用壓榨法萃取法的原理：將粉碎、干燥的植物原料用有機溶劑浸泡，使芳香油溶解在有機溶劑中的方法。芳香油溶解于有機溶劑后，只需蒸發(fā)出有機溶劑，就可以獲得純凈的植物芳香油了。比較項目實驗原理方法步驟適用范圍水蒸氣蒸餾法萃取法壓榨法利用水蒸氣將揮發(fā)性較強的植物芳香油攜帶出來使芳香油溶解在有機溶劑中，蒸發(fā)后得到芳香油通過機械加壓，壓榨出果皮中的芳香油①水蒸汽蒸餾②分離油層③除水過濾①粉碎、干燥②萃取、過濾③濃縮①石灰水浸泡、漂洗②壓榨過濾靜置③再次過濾提取玫瑰油、薄荷油等揮發(fā)性強的芳香油原料顆粒盡可能細小，能充分浸泡在有機溶劑中適用于柑橘、檸檬等易焦糊原料的提取植物芳香油提取三種方法的比較1、提取方法：水蒸氣蒸餾法一、玫瑰精油的提?。簩嶒炘O計2、實驗設計玫瑰精油的提取裝置：3、實驗步驟：

①采集玫瑰花：采集盛花期（5月上中旬）的玫瑰花，清水清洗瀝干。

②裝入蒸餾原料：稱取50g玫瑰花放入蒸餾瓶，添加200mL蒸餾水。③安裝蒸餾裝置：所有儀器必須事先干燥，保證無水。④加熱蒸餾⑤拆卸蒸餾裝置：

⑥分離油層：

蒸餾完畢，應先撤出熱源，然后停止通水，最后拆卸蒸餾裝置，拆卸的順序與安裝時相反。

收集錐形瓶中的乳濁液，向錐形瓶中加入質量濃度為0.1g／mL的NaCl，然后將其倒入分液漏斗中，用分液漏斗將油層和水完全分開。放出玫瑰精油，用接收瓶收集。⑦除去水分：

向接收瓶加入無水Na2S04，24h后過濾，得到玫瑰油。注意事項：蒸餾時間不能過短，溫度不能過高。鮮玫瑰花+清水水蒸氣蒸餾油水混合物油水分離除水玫瑰油加無水Na2SO4加NaCl氯化鈉：促使油水混合物（乳濁液中油和水的分離。無水硫酸鈉：吸收油層中的水分。實驗流程示意圖：壓榨裝置通過機械加壓，壓榨出果皮中的芳香油實驗原理：實驗裝置：二、橘皮精油的