工業(yè)微生物NADH的代謝調(diào)控課件

1姓名：李波學(xué)號(hào)：092408139工業(yè)微生物NADH的代謝調(diào)控梗概引言1NADH生理代謝功能2基于生化工程的NADH代謝調(diào)控

2.1添加外源電子受體調(diào)控NADH代謝

2.2添加不同還原態(tài)底物對(duì)NADH代謝的調(diào)控

2.3NAD+合成前體促進(jìn)胞內(nèi)NAD(H/+)代謝

2.4環(huán)境條件對(duì)NADH代謝的調(diào)控

2.5氧化還原電勢(shì)(ORP)的改變對(duì)NADH代謝的調(diào)控3基于代謝工程的NADH代謝調(diào)控

3.1過(guò)量表達(dá)NADH代謝相關(guān)酶調(diào)控NADH代謝

3.2缺失競(jìng)爭(zhēng)利用NADH途徑調(diào)控NADH代謝

3.3引入外源代謝途徑調(diào)控NADH代謝4結(jié)論與展望引言

NADH是碳代謝和氮代謝的關(guān)鍵輔因子。借助于基因工程手段直接操縱NADH等輔因子，比改進(jìn)代謝網(wǎng)絡(luò)中若干節(jié)點(diǎn)處的酶活性對(duì)碳代謝流的影響更為有效，但在NADH層面上調(diào)控碳代謝流的策略,形成了代謝工程的一個(gè)重要分支——輔因子工程，即采用分子生物學(xué)的手段,改造細(xì)胞內(nèi)輔因子的再生途徑,調(diào)控微生物細(xì)胞內(nèi)輔因子的形式和濃度,定向改變和優(yōu)化微生物細(xì)胞代謝功能,實(shí)現(xiàn)代謝流最大化、快速化地導(dǎo)向目標(biāo)代謝產(chǎn)物。本文從生化工程和代謝工程兩個(gè)方面詳述NADH、NAD+含量及其比率的調(diào)控策略。NADH參與的各類代謝活動(dòng)有300多個(gè)NADH生理代謝功能1)調(diào)控能量代謝:NADH通過(guò)線粒體內(nèi)的電子傳遞鏈,利用氧作為最終電子受體,產(chǎn)生大量ATP;2)調(diào)節(jié)微生物胞內(nèi)氧化還原狀態(tài):NADH/NAD+比率反映了微生物細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài);3)調(diào)控碳代謝流:NADH通過(guò)自身或所產(chǎn)生的ATP激活或抑制代謝途徑中關(guān)鍵酶的活性，實(shí)現(xiàn)對(duì)碳代謝流流向及其通量的調(diào)控;4)調(diào)節(jié)線粒體功能:NADH通過(guò)影響線粒體通透性、控制線粒體膜上的電壓依從性陰離子通道和增加線粒體膜電位等途徑改變線粒體活性;5)調(diào)控細(xì)胞生命周期。2基于生化工程的NADH代謝調(diào)控2.1添加外源電子受體調(diào)控NADH代謝2.2添加不同還原態(tài)底物對(duì)NADH代謝的調(diào)控2.3NAD+合成前體促進(jìn)胞內(nèi)NAD(H/+)代謝2.4環(huán)境條件對(duì)NADH代謝的調(diào)控2.5氧化還原電勢(shì)(ORP)的改變對(duì)NADH代謝的調(diào)控2.2添加不同還原態(tài)底物對(duì)NADH代謝的調(diào)控

碳源根據(jù)其在代謝過(guò)程中所產(chǎn)的NADH量不同而分為?1、0和+1氧化態(tài)。美國(guó)Rice大學(xué)SanKY研究小組在一定稀釋率的恒化厭氧培養(yǎng)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn),隨著碳源氧化態(tài)的增大,NADH/NAD+比率，從0.51(葡萄糖酸)增加到0.75(葡萄糖)和0.94(山梨醇),導(dǎo)致中心代謝流產(chǎn)物乙醇(消耗2molNADH)對(duì)乙酸(不消耗NADH)的比率隨之改變。2.3NAD+合成前體促進(jìn)胞內(nèi)NAD(H/+)代謝

微生物細(xì)胞利用自身合成的或從培養(yǎng)基中吸收的煙酸、煙堿作為前體,在磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的作用下經(jīng)3步反應(yīng)合成NAD+，從而為提高胞內(nèi)NADH和NAD+含量提供了新的思路。光滑球擬酵母發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸過(guò)程添加8mg/LNAD+合成前體煙酸,使葡萄糖消耗速度和丙酮酸產(chǎn)量分別增加了48.4%和29%。2.4環(huán)境條件對(duì)NADH代謝的調(diào)控

微生物細(xì)胞所處的外部環(huán)境條件,如溶氧、溫度的變化導(dǎo)致與之相關(guān)的NADH、ATP合成和消耗,從而使微生物細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)代謝途徑發(fā)生顯著變化。在高溶氧的條件下,葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、蘋果酸酶和依賴NADP+的異檸檬酸脫氫酶活性和表達(dá)量明顯上調(diào),而TCA循環(huán)中合成NADH的相關(guān)酶的活性明顯抑制。在高濃度溶氧條件下添加外源電子受體乙醛對(duì)細(xì)胞的碳和能量代謝并不產(chǎn)生影響。溫度調(diào)控胞內(nèi)NADH方面,有研究發(fā)現(xiàn)較低的發(fā)酵溫度能維持較高的胞內(nèi)NADH/NAD+水平。3基于代謝工程的NADH代謝調(diào)控3.1過(guò)量表達(dá)NADH代謝相關(guān)酶調(diào)控NADH代謝3.2缺失競(jìng)爭(zhēng)利用NADH途徑調(diào)控NADH代謝3.3引入外源代謝途徑調(diào)控NADH代謝3.1過(guò)量表達(dá)NADH代謝相關(guān)酶調(diào)控NADH代謝

在促進(jìn)NAD+合成方面，pncB基因編碼的煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶催化生成煙酸單核苷酸(NAMN)的反應(yīng)是NAD回補(bǔ)途徑中的關(guān)鍵限速步驟。過(guò)量表達(dá)pncB基因,導(dǎo)致胞內(nèi)NAD+、NADH和總NAD+分別提高，而NADH/NAD+比率降低。在過(guò)量表達(dá)依賴于NAD+的脫氫酶方面，在釀酒酵母中過(guò)量表達(dá)編碼胞質(zhì)依賴NAD+的乙醛脫氫酶基因ALD3,實(shí)現(xiàn)了NADH高效再生。3.2缺失競(jìng)爭(zhēng)利用NADH途徑調(diào)控NADH代謝

在葡萄糖發(fā)酵生產(chǎn)甘油的過(guò)程中，采用了維持1,6-磷酸果糖激酶和磷酸丙糖異構(gòu)酶活性、削弱與甘油競(jìng)爭(zhēng)NADH的代謝途徑和加強(qiáng)線粒體基質(zhì)氧化分解速度等策略,以及添加甲酸促進(jìn)胞質(zhì)NADH生成速度,使釀酒酵母生產(chǎn)甘油產(chǎn)率突破理論值。4結(jié)論與展望

將調(diào)控胞內(nèi)NADH/NAD+作為技術(shù)手段以優(yōu)化微生物細(xì)胞生理代謝功能以促進(jìn)微生物合成目標(biāo)產(chǎn)物的代謝流最大化和快速化或合成新的代謝產(chǎn)物的研