細(xì)胞培養(yǎng)的常見問題及解決方案

細(xì)胞培養(yǎng)的常見問題

及解決方案兩種實(shí)驗(yàn)的優(yōu)缺點(diǎn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)活細(xì)胞條件控制樣本均一研究?jī)?nèi)容便于觀察、檢測(cè)、記錄研究范圍廣，費(fèi)用相對(duì)經(jīng)濟(jì)缺乏神經(jīng)和內(nèi)分泌調(diào)節(jié)，不穩(wěn)定問題零：我可以養(yǎng)細(xì)胞嗎？閱讀細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)理論及實(shí)驗(yàn)平臺(tái)培訓(xùn)細(xì)胞種類及培養(yǎng)條件的確立參考文獻(xiàn)，專業(yè)書籍及網(wǎng)站，詢問他人，參考類似細(xì)胞的培養(yǎng)原代培養(yǎng)或購買細(xì)胞株，請(qǐng)有經(jīng)驗(yàn)的老師指導(dǎo)操作問題一：怎樣做到不污染？１、工作人員培養(yǎng)成良好的工作習(xí)慣定期為工作間做清潔，75%酒精擦拭，過氧乙酸可防止霉菌污染定期用75%酒精擦拭擦拭培養(yǎng)箱內(nèi)的托盤，更換消毒水工作區(qū)或工作臺(tái)在實(shí)用前用紫外線照20-30分鐘。問題一：怎樣做到不污染？１、工作人員培養(yǎng)成良好的工作習(xí)慣提前10分鐘打開吹風(fēng)機(jī)工作人員操作前洗手，戴帽，戴口罩，手套所用培養(yǎng)基等試劑從冰箱取出后用用75%酒精擦拭后再放工作臺(tái)試劑瓶開啟后，要傾斜放在試管架上操作過程中盡量減少談話問題二：怎樣觀察活細(xì)胞和死細(xì)胞１、活細(xì)胞透明，飽滿，清晰問題二：怎樣觀察活細(xì)胞和死細(xì)胞１、死細(xì)胞灰暗，無光澤問題三：細(xì)胞在什么時(shí)候傳代最好？如何掌握細(xì)胞生長(zhǎng)密度？一般情況下，細(xì)胞在生長(zhǎng)至完全匯合后就要傳代，所有細(xì)胞都有一個(gè)共同要求，即不宜生長(zhǎng)過密（也就是通常說的長(zhǎng)老了），許多細(xì)胞系都有它的生長(zhǎng)特點(diǎn)：成堆成片的生長(zhǎng)成克隆樣生長(zhǎng)問題三：細(xì)胞在什么時(shí)候傳代最好？如何掌握細(xì)胞生長(zhǎng)密度？有接觸抑制的細(xì)胞，就要在它完全匯合前傳代，即80%密度，不然細(xì)胞就會(huì)引起分化。剛拿到細(xì)胞株怎么辦？問題四：細(xì)胞消化時(shí)怎樣掌握火候細(xì)胞生長(zhǎng)匯合密度為80%-100%時(shí)就要消化傳代消化液濃度：0.05%T+0.02%EDTA

0.25%T+0.03%EDTA消化液的PH:7.6-7.8問題五：懸浮細(xì)胞如何傳代？細(xì)胞密度在2×106，也就是掌握在生長(zhǎng)至最大密度之前傳代，方法:離心棄去舊液，加新鮮培養(yǎng)液將細(xì)胞混勻，然后分成3-6瓶（或按要求分瓶）。問題六：細(xì)胞在培養(yǎng)過程中經(jīng)常出現(xiàn)一些黑點(diǎn)點(diǎn)，是污染嗎？肉眼觀察液體是否渾濁鏡下觀察黑點(diǎn)是否游動(dòng)，要與布朗運(yùn)動(dòng)區(qū)別細(xì)胞狀態(tài)如何以上都不是，可能屬于以下情況如何防止黑點(diǎn)點(diǎn)是的生成？掌握細(xì)胞傳代的最佳時(shí)機(jī)。減少血清等試劑的凍融次數(shù)，培養(yǎng)基無需在37℃水?。贸龇虐胄r(shí)）培養(yǎng)基的PH調(diào)到最佳(略酸PH7.0-7.2，特殊細(xì)胞特殊要求)嚴(yán)格控制水質(zhì)、容器嚴(yán)格洗刷如何處理黑點(diǎn)點(diǎn)？慢速離心，換新瓶。（500-600prm5min）如果是貼壁細(xì)胞，用D-Hanks或PBS洗，或?qū)⒓?xì)胞消化下來，移入離心管內(nèi)慢速離心，然后棄上清，加入新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)類似于層析的方法，先將5ml血清加入離心管，再將細(xì)胞懸液濃縮于1ml液體中，然后加入血清上層，慢速離心。問題八：怎樣讓細(xì)胞適應(yīng)新的條件？從原條件逐漸過度：原3/4新1/41:11/4:3/4完全新培養(yǎng)基換成新的培養(yǎng)基后應(yīng)連續(xù)傳三代再做實(shí)驗(yàn)比較穩(wěn)定以上實(shí)驗(yàn)應(yīng)做對(duì)照

支原體是一種大小介于細(xì)菌和病毒之間(最小直徑0．2um)并獨(dú)立生活的微生物．約有1%可通過濾菌器。支原體無細(xì)胞壁形態(tài)呈高度多形性．可為圓形、絲狀或梨形。支原體形態(tài)多變，在光境下不易看清內(nèi)部結(jié)構(gòu)。電鏡下觀察支原體膜為三層結(jié)構(gòu)．其中央有電干密度大的密集顆粒群或絲狀的中心束。支原體多吸附或散在于細(xì)胞表面和細(xì)胞之間。橫斷面與細(xì)胞微絨毛相似，但微絨毛電子密度比支原體小，且中央無顆粒群或中央束。

支原體代謝需固醇類物質(zhì)、部分種類需要精氨酸、O2或葡萄糖，每一種支原體都有自身持點(diǎn)。多數(shù)支原體適合于偏堿條件下生存(PH7．6—8．0)，對(duì)酸耐受性差。對(duì)熱比較敏感，對(duì)一般抗生素不敏感。

支原體污染細(xì)胞后．培養(yǎng)液可不發(fā)生混濁．多數(shù)情況下細(xì)胞病理變化輕微或不顯著，細(xì)微變化也可由于傳代、換液而緩解．因此易被忽視。但個(gè)別嚴(yán)重者，可致細(xì)胞增殖緩慢．甚至從培養(yǎng)器皿脫落。

為確定有無支原體污染可做如下檢測(cè)：

①相差顯微境檢測(cè)：將細(xì)胞按種于事先放置于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的蓋玻片上，24h后取出，用相差油鏡觀察．支原體呈暗色微小顆粒位于細(xì)胞表面和細(xì)胞之間。

②熒光染色法：熒光染色用能與DNA特異性結(jié)合的熒光染料Hoechst33258，可使支原體內(nèi)含有的DNA著色，染色后用熒光顯微鏡觀察。具體方法如下：首先將細(xì)胞接種蓋玻片上，在細(xì)胞未長(zhǎng)滿前取出玻片，用不合酚紅的Hanks液漂洗一下，用l：3醋酸甲酵固定10Min，然后用生理鹽水漂洗．置于用生理鹽水配濃度為50pg／ml的Hoechst33258中染色10min。染色后用蒸溜水洗1—2min．向細(xì)胞面滴加pH5．5磷酸緩沖液數(shù)滴，然后置熒光顯微鏡下觀察。鏡下支原體為散在于細(xì)胞同圍或附于細(xì)胞膜表面的亮綠色小點(diǎn)。

③電鏡檢查；用掃描電鏡方法簡(jiǎn)便快速．也可以利用透射電鏡。

④DNA分子條文檢查或支原體培養(yǎng)等方法：檢出率高．但方法較為復(fù)雜

有專門的去除