王鏡巖-生物化學(xué)-第7章蛋白質(zhì)的分離純化和表征

Protein第7章

蛋白質(zhì)的分離純化和表征

蛋白質(zhì)含有酸/堿AA殘基具有兩性堿/酸越大——pI越大pI通常在6.0左右一、蛋白質(zhì)的兩性電離及等電點蛋白質(zhì)的分子量一般在一萬至一百萬道爾頓之間

1道爾頓＝1×C12絕對質(zhì)量/12≈1.66×10-27千克二、蛋白質(zhì)分子的大?。ǘ㏒DS－PAGE測定相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)顆粒電泳時遷移率取決于：所帶電荷分子量分子形狀十二烷基磺酸鈉原態(tài)蛋白質(zhì)變性？磺酸基極性親水烷基親油（蛋白質(zhì)疏水區(qū)）遷移率與電荷和形狀無關(guān)，僅取決于相對分子質(zhì)量巰基乙醇破壞二硫鍵（三）凝膠過濾法測定相對分子質(zhì)量三、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀（一）膠體性質(zhì)（colloidalsystem）膠體溶液的特點：分子直徑在1-100nm內(nèi)溶于水不易聚集沉淀大多數(shù)球狀蛋白能形成穩(wěn)定的親水膠體溶液蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定因素：1.同種蛋白帶同種電荷，相互排斥2.水膜彈性蛋白質(zhì)溶液具有丁達爾效應(yīng)、布朗運動以及不能通過半透膜等性質(zhì)（二）蛋白質(zhì)的沉淀

Pr從膠體溶液中析出Ⅰ可逆沉淀：溫和條件，改變?nèi)芤簆H或Pr所帶電荷Pr結(jié)構(gòu)和性質(zhì)沒有變化適當(dāng)條件下可重新溶解——非變性沉淀pI沉淀法、鹽析法和有機溶劑沉淀法等

1.鹽析法加入中性鹽脫去蛋白質(zhì)的水化層，鹽析一般不引起變性等電點沉淀的蛋白質(zhì)溶液中加入NaCl后沉淀溶解—鹽溶原因？鹽溶—鹽析分子在等電點時，相互吸引，聚合沉淀，加入少量鹽離子后破壞了這種吸引力，使分子分散，溶于水中鹽溶鹽析向蛋白質(zhì)溶液中加入大量硫酸銨后蛋白質(zhì)會沉淀析出原因？蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集沉淀鹽析（（NH4）2SO4）4.重金屬鹽沉淀與帶負電荷蛋白質(zhì)結(jié)成不溶性鹽5.生物堿試劑和某些酸類沉淀與帶正電荷蛋白質(zhì)生成不溶性鹽6.加熱變性沉淀天然結(jié)構(gòu)解體，疏水基外露，破壞水化層及帶電狀態(tài)四、蛋白質(zhì)分離純化的一般原則總目標：增加制品純度或比活1.前處理：因動/植物/細菌而異2.粗分級分離：采用鹽析/等電點沉淀/有機溶劑分級分離等方法3.細分級分離：采用凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析以及親和層析等4.結(jié)晶五、蛋白質(zhì)的分離純化方法（一）根據(jù)分子大小不同的純化方法

1、透析和超過濾利用蛋白質(zhì)分子不能透過半透膜將其與小分子物質(zhì)分開半透膜為玻璃紙或纖維素材料2、密度梯度（區(qū)帶）離心60000~80000轉(zhuǎn)/分重力60萬～80萬倍3、凝膠過濾等電聚焦電泳雙向電泳離子交換層析（四）利用蛋白質(zhì)選擇性吸附的性質(zhì)羥磷石灰層析疏水作用層析