實驗硫酸銨分級沉淀分離苯丙氨酸解氨酶

實驗硫酸銨分級沉淀分離苯丙氨酸解氨酶第1頁/共17頁實驗（一）硫酸銨分級沉淀分離苯丙氨酸解氨酶（8學(xué)時）第2頁/共17頁一、實驗背景

了解硫酸銨沉淀蛋白質(zhì)的原理；掌握分級沉淀分離酶的基本操作和方法第3頁/共17頁二、實驗原理鹽析：在蛋白質(zhì)溶液中加入一定量的中性鹽（如硫酸銨、硫酸鈉等）使蛋白質(zhì)沉淀析出稱為鹽析，因為中性鹽在水中解離時，能奪走蛋白質(zhì)膠粒表面的水分子，破壞水膜結(jié)構(gòu)；同時中性鹽解離后形成的帶電離子能中和蛋白質(zhì)表面的電荷，這兩種作用使溶液中蛋白質(zhì)沉淀析出。第4頁/共17頁分級沉淀：不同鹽濃度下各種蛋白質(zhì)的溶解度是不同的，因此調(diào)節(jié)溶液的鹽濃度可使各種蛋白質(zhì)先后沉淀出來，或者使需要的酶與其它雜質(zhì)蛋白分開，達到提純目的，這就是分級沉淀法。硫酸銨沉淀一般在蛋白純化的步驟中前期用，它簡便且重復(fù)性好，但純化倍數(shù)不高。分級沉淀中需加的固體硫酸銨或飽和硫酸銨溶液的量，可從硫酸銨飽和度量表中查得。第5頁/共17頁第6頁/共17頁苯丙氨酸解氨酶（L-phenylalanine:ammonialyase，簡稱PAL）是植物體內(nèi)苯丙烷類代謝的關(guān)鍵酶，與一些重要的次生物質(zhì)如木質(zhì)素、異黃酮類植保素、黃酮類色素等合成密切有關(guān)，在植物的正常生長發(fā)育和抵御病菌侵害的過程中起重要作用。PAL催化L-苯丙氨酸裂解為反式肉桂酸和氨，產(chǎn)物反式肉桂酸在波長290nm處有最大吸收值。在反應(yīng)系統(tǒng)中如果酶的加入量適當(dāng)，反式肉桂酸的生成速率即A290升高的速率可在幾小時內(nèi)保持不變，因此，可通過測定A290升高的速率來測定PAL的活力。規(guī)定1小時內(nèi)A290增加0.01為PAL的一個活力單位。第7頁/共17頁三、實驗試劑0.1mol/L硼酸-硼砂緩沖液（PH8.7）酶提取液—0.1mol/L硼酸-硼砂緩沖液（內(nèi)含1mmol/LEDTA、20mmol/Lβ-巰基乙醇）。取100ml0.1mol/L硼酸-硼砂緩沖液（PH8.7）,加入0.037克EDTA鈉鹽，混勻，臨用前再加入0.137mlβ-巰基乙醇，混勻；0.6mmol/LL-Phe溶液。稱取L-Phe9.912毫克溶于100ml蒸餾水中；6NHCl溶液固體（NH4）2SO4第8頁/共17頁四、實驗步驟1、 酶液提取：

（1）取小麥幼苗（發(fā)芽5~6天）2克，用剪刀剪成小段后，立即放入有10ml酶提取液的研缽中，于冰浴上研磨勻漿，勻漿結(jié)束前，再加入10ml酶提取液研磨混勻（2）將已勻漿的酶液，用三層紗布過濾、擠干。濾液轉(zhuǎn)入離心管，平衡后，于10,000g下冷凍離心30min；（3）取離心后的上清液（酶粗提液），量出其體積V1，放置冰浴中備用。第9頁/共17頁實驗步驟2.硫酸銨分級沉淀酶蛋白：

（1）從酶粗提液中吸取出0.5ml，以作后面活力測定等用，根據(jù)實際體積和硫酸銨飽和度用量表，算出達到40%飽和度實際應(yīng)加入酶液中的硫酸銨量，并稱取該量的硫酸銨；

第10頁/共17頁第11頁/共17頁（2）將酶液到入燒杯內(nèi)，燒杯置于冰浴中，然后在邊緩慢攪拌下緩慢加入稱好的固體硫酸銨（不能有大顆粒，放在研缽中研碎），待全部硫酸銨加入后，再緩慢攪拌20min；第12頁/共17頁實驗步驟2.硫酸銨分級沉淀酶蛋白：

（3）將上述溶液到入離心管，3,000g下冷凍離心30min，倒上清液于燒杯內(nèi)，保留沉淀，記為沉淀1；（4）根據(jù)硫酸銨飽和度用量表中，查出從40%到75%飽和度所需硫酸銨用量，算出并稱取實際應(yīng)加的硫酸銨量；（5）按上述（2）、（3）步同法處理，離心后，倒出上清液，保留沉淀，記為沉淀2。第13頁/共17頁實驗步驟3.酶活力測定：

（1）將沉淀[1]和沉淀[2]分別溶于1ml酶抽提液中，待沉淀全部溶解后，量出其體積V2、V3，記為沉淀液[1]和[2]；（2）分別從沉淀液[1]和[2]中吸出0.2ml加入另外二個試管內(nèi)，然后用酶提取液分別將其稀釋成1ml，記為稀釋沉淀液[1]和[2]；（3）取試管7支，按下列編號并加入各試劑：

管試

號

劑

011'22'33’PH8.70.1mol/L硼酸緩沖液（ml）4.03.94.93.94.93.94.9酶粗提取液(ml)/0.10.1////稀釋沉淀液[1](ml)///0.10.1//稀釋沉淀液[2]（ml）/////0.10.10.6mmol/LL-Phe(ml)1.01.0/1.0/1.0/第14頁/共17頁實驗步驟3.酶活力測定：

（4）以上試管放入恒溫水浴（40℃）中保溫60min后，立即加入0.2ml6NHCl，混勻，終止反應(yīng)；（5）于波長290nm處，以0號管溶液調(diào)零，分別記錄測得的各管A290值。酶活單位定義：規(guī)定1小時內(nèi)A290增加0.01為PAL的一個活力單位。第15頁/共17頁1、PAL