第十三章動物細(xì)胞詳解

第十三章動物細(xì)胞詳解演示文稿當(dāng)前1頁，總共48頁。優(yōu)選第十三章動物細(xì)胞當(dāng)前2頁，總共48頁。第一節(jié)動物細(xì)胞融合技術(shù)自然融合頻率很低，常采用誘導(dǎo)融合。誘導(dǎo)融合方法：病毒介導(dǎo)化學(xué)融合劑（PEG）電擊（物理方法）原理及特點？當(dāng)前3頁，總共48頁。一、病毒誘導(dǎo)融合1958年，日本的Okada發(fā)現(xiàn)紫外線滅活的仙臺病毒可誘發(fā)艾氏腹水瘤細(xì)胞融合。進一步產(chǎn)生了第一個種間雜種細(xì)胞。目前仙臺病毒廣泛應(yīng)用于動物細(xì)胞融合中。其他應(yīng)用的病毒融合劑包括皰疹病毒、天花病毒和副粘液病毒等。當(dāng)前4頁，總共48頁。一、病毒誘導(dǎo)融合1、原理：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能夠與細(xì)胞膜上的糖蛋白發(fā)生作用，使細(xì)胞互相凝集，細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂類分子重新排布，細(xì)胞膜打開，細(xì)胞發(fā)生融合。蛋白質(zhì)分子重新分布：是細(xì)胞融合的必要前提脂質(zhì)分子重排：是實現(xiàn)細(xì)胞融合的關(guān)鍵當(dāng)前5頁，總共48頁。一、病毒誘導(dǎo)融合病毒滅活:是指用物理或化學(xué)手段殺死病毒，但是不損害它們體內(nèi)的有用抗原的方法。滅活的病毒保留了誘導(dǎo)細(xì)胞融合的能力，又不會感染細(xì)胞。當(dāng)前6頁，總共48頁。一、病毒誘導(dǎo)融合2、融合步驟先將親本細(xì)胞分別制成懸液、混合離心將沉積細(xì)胞懸于1ml滅活的仙臺病毒懸液，置冰浴間歇搖動20分鐘，細(xì)胞凝集溫度升至37℃，間歇搖動30分鐘，使其進行融合將融合物懸浮于選擇培養(yǎng)基進行培養(yǎng)當(dāng)前7頁，總共48頁。二、聚乙二淳(PEG)誘導(dǎo)融合乙二醇：HO-CH2-CH2-OH聚乙二淳：HOCH2-（CH2-O-CH2）n-CH2OH用于誘導(dǎo)細(xì)胞融合的聚乙二醇的分子量為1500~7500之間，植物細(xì)胞一般為6000。誘導(dǎo)融合的原理及實驗操作技術(shù)。當(dāng)前8頁，總共48頁。（1）、聚乙二醇（PEG）法2、原理：細(xì)胞融合時細(xì)胞間必須緊密接觸（質(zhì)膜間的距離小于10?），但正常細(xì)胞表面帶負(fù)電荷而相互排斥。PEG可增加膜的流動性，并以自身帶負(fù)電荷的醚鍵與帶正電的水、蛋白質(zhì)相互作用形成氫鍵介導(dǎo)細(xì)胞黏連。洗滌：打破了細(xì)胞表面的電荷平衡，使某些細(xì)胞的正電荷與另一些細(xì)胞的負(fù)電荷相互作用而促進融合。當(dāng)前9頁，總共48頁。1、聚乙二醇（PEG）法（1）、融合原理-+-+-1PEG起橋梁作用++--2PEG被洗掉++--3電荷重排++--4膜接觸++-5融合6融合細(xì)胞當(dāng)前10頁，總共48頁。1、聚乙二醇（PEG）法融合液（植物細(xì)胞）：融合液A：CaCl2·2H2O（2~8mmol/L）

融合液B：

CaCl2·2H2O（10~100mmol/L）

KH2PO4KH2PO4甘露醇（山梨醇）甘露醇（山梨醇）

PEG(50%)

pH（5.8）pH（7.0~10.0）融合液A過濾滅菌，融合液B高溫滅菌。（2）、融合操作技術(shù)：首先要制備融合液和細(xì)胞懸液，然后進行融合操作。當(dāng)前11頁，總共48頁。二、PEG誘導(dǎo)融合動物、植物細(xì)胞融合的差異：PEG的分子量一般為1000~4000，30%~50%濃度PEG溶液pH為7.4~8.0（弱堿性），也有報導(dǎo)pH8.0－8.2時的融合率最高。處理方法：一般將逐滴加入PEG，溫育后加入不含血清的培養(yǎng)基終止PEG的作用，洗滌細(xì)胞進行培養(yǎng)篩選。以5－15％的二甲亞砜或在融合前先用植物血凝素處理一下細(xì)胞，融合效率更高。當(dāng)前12頁，總共48頁。PEG法融合技術(shù)的特點融合頻率高，可重復(fù)性好誘發(fā)融合無特異性：

植物+植物；植物+動物；動物+酵母毒性較低當(dāng)前13頁，總共48頁。三、電融合法電融合技術(shù)是20世紀(jì)70年代末80年代初建立的新的細(xì)胞融合技術(shù)。此法無毒害、效率高、操作簡便但儀器昂貴。當(dāng)前14頁，總共48頁。融合過程及結(jié)果1膜融合（Ca2+、ATP、ATPase的參與）2融合數(shù)小時后細(xì)胞質(zhì)混合3核融合（1）、融合過程當(dāng)前15頁，總共48頁。融合過程及結(jié)果（2）、融合結(jié)果核融合異核體雜種細(xì)胞雙核融合對稱融合（親本雙方）不對稱融合（親緣關(guān)系較遠）全核+部分核一個核（胞質(zhì)雜種）同核體（一個親本）未融合（不成功）只有在第一次同步有絲分裂期間發(fā)生的核融合雜種細(xì)胞才能進一步發(fā)育。當(dāng)前16頁，總共48頁。四、融合細(xì)胞的篩選基于藥物抗性篩選基于營養(yǎng)缺陷型篩選熒光標(biāo)記篩選當(dāng)前17頁，總共48頁。1、基于藥物抗性篩選藥物抗性突變型：細(xì)胞突變后對某一種藥物的抗性顯著增加而形成的一種突變型。某一種藥物在達到一定濃度時，可以殺死野生型細(xì)胞。當(dāng)把正常的野生型細(xì)胞培養(yǎng)在含有這一藥物的培養(yǎng)基上，逐漸增加藥物濃度，便可得到一條存活曲線（surivalcurve）。但是存在一些自發(fā)突變，這一細(xì)胞在藥物的致死濃度中仍能生長。當(dāng)前18頁，總共48頁。1、基于藥物抗性篩選藥物抗性突變型：0.1110100細(xì)胞活存率（log比例）野生型抗性突變型當(dāng)前19頁，總共48頁。1、基于藥物抗性篩選在培養(yǎng)細(xì)胞藥物抗性突變型中研究得最為廣泛的藥物抗性是氮鳥嘌呤抗性。氮鳥嘌呤是一種鳥嘌呤類似物（8-氮鳥嘌呤，8-AG和6-硫代鳥嘌呤，6-TG），當(dāng)培養(yǎng)基中含有這一藥物時，細(xì)胞就會由于其結(jié)構(gòu)與鳥嘌呤類似而利用這一藥物，將它摻入到細(xì)胞自身的DNA中，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。當(dāng)前20頁，總共48頁。1、基于藥物抗性篩選細(xì)胞內(nèi)參與這一反應(yīng)的一個重要酶稱為次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（簡稱HGPRT，hypoxanthineguaninephosphoribosyl-transferase）。次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）：是細(xì)胞內(nèi)嘌呤合成應(yīng)急途徑中的一種酶，它的作用是將次黃嘌呤和鳥嘌呤轉(zhuǎn)變成次黃嘌呤核苷酸或鳥嘌呤核苷酸，后者參與DNA合成過程。氮鳥嘌呤抗性突變：細(xì)胞缺失HGPRT酶，即HGPRT-突變株。當(dāng)前21頁，總共48頁。1、基于藥物抗性篩選同理：5-溴脫氧脲嘧啶（5-BrdU）會引起細(xì)胞突變。參與這一過程的酶為胸腺嘧啶脫氧核苷激酶（TK）。胸腺嘧啶脫氧核苷激酶（TK）：利用胸腺嘧啶脫氧核苷合成DNA。是DNA補救合成途徑中的一種重要酶。在5-BrdU選擇下產(chǎn)生的5-BrdU抗性株，其特點為缺乏TK，即TK-突變株如LMTK–細(xì)胞系。當(dāng)前22頁，總共48頁。1、基于藥物抗性篩選DNA合成途徑：

糖+氨基酸核苷從頭合成途徑（肝，能被氨基碟呤阻斷）“補救”途徑（腦和骨髓，包含HGPRT和TK酶）DNA當(dāng)前23頁，總共48頁。補充資料：核酸的合成體內(nèi)核苷酸的合成有兩條途徑：第一，由簡單的化合物合成嘌呤環(huán)、嘧啶環(huán)的途徑，稱從頭合成（denovosynthesis）途徑。第二，利用體內(nèi)游離的嘌呤、嘌呤核苷（嘧啶或嘧啶核苷），經(jīng)過簡單的反應(yīng)過程，合成核苷酸，稱為補救合成（或重新利用）（salvagepathway）途徑。肝細(xì)胞及多數(shù)細(xì)胞以從頭合成為主，而腦組織和骨髓則以補救合成為主。當(dāng)前24頁，總共48頁。A9NNNN12346587腺嘌呤鳥嘌呤（1）嘌呤

G當(dāng)前25頁，總共48頁。嘧啶N3N24561CTU尿嘧啶胞嘧啶H3C胸腺嘧啶(2)嘧啶當(dāng)前26頁，總共48頁。從頭合成途徑當(dāng)前27頁，總共48頁。補充資料：核酸的合成嘌呤這兩個碳來在一碳單位，以四氫葉酸（輔酶F)為輔酶。氨甲喋呤為葉酸拮抗劑，可與二氫葉酸還原酶結(jié)合，阻礙四氫葉酸形成H3C胸腺嘧啶當(dāng)前28頁，總共48頁?！把a救”途徑當(dāng)前29頁，總共48頁。補充資料：核酸的合成嘌呤核苷酸補救合成途徑：鳥嘌呤+PRPP鳥嘌呤核苷酸

次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）嘧啶核苷酸補救合成途徑：胸腺嘧啶胸苷胸腺嘧啶核苷酸

胸腺嘧啶核苷酸激酶（TK）當(dāng)前30頁，總共48頁。1、基于藥物抗性篩選篩選方法：將融合后的細(xì)胞在HAT選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)。HAT選擇培養(yǎng)基含:次黃嘌呤(hypoxanthine)氨基蝶呤（aminopterin）胸腺嘧啶（thymidine）親本細(xì)胞：為HGPRT或TK缺陷型細(xì)胞當(dāng)前31頁，總共48頁。2、營養(yǎng)缺陷突變型營養(yǎng)缺陷突變型是培養(yǎng)細(xì)胞突變型中的另一種重要突變類型。這些突變型表現(xiàn)在合成低分子量代謝物(如氨基酸）的能力發(fā)生了改變，以致這些細(xì)胞所產(chǎn)生的生物量不能滿足正常生長的需要。例如氨基酸依賴型，嗜糖性突變型等當(dāng)前32頁，總共48頁。2、營養(yǎng)缺陷突變型目前已分離得到許多與氨基酸、嘌呤、嘧啶等生物合成代謝有關(guān)的酶缺陷營養(yǎng)突變型。這些突變型的發(fā)現(xiàn)，不僅可用于研究不同生化途徑中的生物合成過程和代謝調(diào)節(jié)作用，而且還能用來作為體細(xì)胞遺傳學(xué)分析中的遺傳標(biāo)記。當(dāng)前33頁，總共48頁。3、熒光標(biāo)記篩選用不同熒光素標(biāo)記的脂質(zhì)染料標(biāo)記親本細(xì)胞。四乙基羅丹明橙色熒光異硫氰酸熒光素黃綠色熒光融合親本發(fā)兩種熒光或黃色熒光。也可用細(xì)胞分選儀分選。當(dāng)前34頁，總共48頁。第二節(jié)單克隆抗體生產(chǎn)技術(shù)雜交瘤技術(shù)：將腫瘤細(xì)胞與體細(xì)胞融合獲得雜種細(xì)胞的技術(shù)。雜交瘤技術(shù)多指B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)。即將致敏的B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進行融合而產(chǎn)生雜種細(xì)胞，也有T細(xì)胞雜交瘤（胸腺瘤細(xì)胞）技術(shù)。它的目的主要是為獲得淋巴因子或單克隆抗體。當(dāng)前35頁，總共48頁。第二節(jié)單克隆抗體生產(chǎn)技術(shù)單克隆抗體技術(shù)：將正常的B淋巴細(xì)胞與缺陷型的骨髓瘤細(xì)胞融合，所得細(xì)胞在HAT選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到能分泌針對某一抗原的均質(zhì)抗體的雜交瘤細(xì)胞（該細(xì)胞既可分泌抗體又可在體外大量增殖）。1975年，Kohler和Milstein制備了單克隆抗體，并于1984年獲得諾貝爾生理學(xué)與醫(yī)學(xué)獎。當(dāng)前36頁，總共48頁。第二節(jié)單克隆抗體生產(chǎn)技術(shù)親本選擇及動物免疫骨髓瘤細(xì)胞選擇細(xì)胞融合雜交細(xì)胞篩選雜交細(xì)胞的克隆培養(yǎng)單克隆抗體生產(chǎn)當(dāng)前37頁，總共48頁。1、骨髓瘤細(xì)胞選擇理想的雜交瘤細(xì)胞系具有下列特征：①能在體外連續(xù)生長，倍增期短于24小時；②缺乏HGPRT酶；③克隆效應(yīng)高；④在動物中有致腫瘤性；⑤與小鼠淋巴細(xì)胞融合率相當(dāng)高；⑥本身不合成Ig，且不抑制雜交瘤細(xì)胞中的Ig合成基因。當(dāng)前38頁，總共48頁。1、骨髓瘤細(xì)胞選擇常用骨髓瘤細(xì)胞系有：NS1、SP2／0、X63等。保存：防止突變、定期篩選（8-氮鳥嘌呤）防止支原體污染（胎牛血清）融合時保證骨髓瘤細(xì)胞處于對數(shù)生長期，良好的形態(tài)，活細(xì)胞計數(shù)高于95％。當(dāng)前39頁，總共48頁。2、親本選擇及動物免疫親本：通常選用小鼠。正常供體和骨髓瘤細(xì)胞種系發(fā)生越近緣，產(chǎn)生的雜交瘤就越穩(wěn)定(反之亦然)。因為融合用的小鼠骨髓瘤細(xì)胞大多數(shù)是從BALB/C純系小白鼠取得，所以用BALB/C作脾細(xì)胞供體最為合適。

動物免疫：選用6-12周齡Balb/c小鼠，將可溶性抗原10-15ug/100ul+等量弗氏完全佐劑注射小鼠腹腔

2-4周后加強免疫（量減半，改用不完全佐劑，可反復(fù)多次）沖擊免疫（融合前3天進行）當(dāng)前40頁，總共48頁。2、親本選擇及動物免疫免疫脾細(xì)胞懸液的制備：頸椎脫臼法處死小鼠無菌取脾臟

注射器內(nèi)管擠壓釋放淋巴細(xì)胞1000r/min離心5min收集細(xì)胞0.91%NH4Cl4℃重懸細(xì)胞（破裂紅細(xì)胞）加培養(yǎng)液終止NH4Cl作用離心收集細(xì)胞細(xì)胞計數(shù)當(dāng)前41頁，總共48頁。3、飼養(yǎng)細(xì)胞的種類與制備（1）常用飼養(yǎng)細(xì)胞：①胸腺細(xì)胞,用量為106/0.2ml②正常的脾細(xì)胞；③傳代培養(yǎng)中的大鼠胚胎成纖維細(xì)胞；④腹腔巨噬細(xì)胞：其用量為2×104/0.2ml，腹腔細(xì)胞是使用得最普遍的飼養(yǎng)細(xì)胞。（2）收集：飼養(yǎng)細(xì)胞一般在融合前一天制備，用平衡鹽溶液（PBS）洗滌腹腔，離心收集后調(diào)整密度，培養(yǎng)于HAT培養(yǎng)基中。當(dāng)前42頁，總共48頁。4、細(xì)胞融合（1）融合比例：

骨髓瘤細(xì)胞：脾細(xì)胞=1：5或1：10（2）融合劑：40%PEG（分子量1000-4000）（3）培養(yǎng)：融合24小時后加HAT培養(yǎng)液2周后改用HT培養(yǎng)液2周