實時熒光定量PCR實驗結(jié)果分析

實時熒光定量PCR實驗結(jié)果分析第1頁/共30頁定量分析絕對定量相對定量定量PCR應(yīng)用定性分析SNP分析，基因掃描陰陽性判定熔解曲線分析第2頁/共30頁絕對定量：HowMany–優(yōu)點：給出目標(biāo)基因初始模板的絕對數(shù)量，數(shù)據(jù)容易處理–缺點：必須有標(biāo)準(zhǔn)品，做標(biāo)準(zhǔn)曲線–應(yīng)用：病毒拷貝數(shù)；轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)；轉(zhuǎn)基因成分百分含量檢測絕對定量與相對定量相對定量:HowMuch–優(yōu)點：需要/不需要標(biāo)準(zhǔn)品；使用廣泛–缺點：數(shù)據(jù)理解困難–應(yīng)用：差異表達分析；芯片評估14500copies第3頁/共30頁108106102104絕對定量第4頁/共30頁108106102104T絕對定量第5頁/共30頁絕對定量第6頁/共30頁108106102104T絕對定量第7頁/共30頁105copies/well絕對定量第8頁/共30頁1/3Blank1/31/31/31.11ng/2ul0.37ng/2ul0.12ng/2ul10.0ng/2ul3.33ng/2ul相對定量第9頁/共30頁TControl CT=21.3SampleA CT=22.8SampleB CT=19.3相對定量第10頁/共30頁Control CT=21.3 =1.5ng/tube1SampleA CT=22.8 =0.5ng/tube0.33SampleB CT=19.3=6.0ng/tube4Fold相對定量第11頁/共30頁相對定量數(shù)據(jù)處理?管家基因校準(zhǔn)(NormalizationGene)–得出每個細(xì)胞中的[目的基因]–目標(biāo)基因vs.管家基因?對照樣品校準(zhǔn)(CalibratorSample)–得出相對于某個樣品的基因表達量,1Xsample.–處理的vs.未處理的，6hrvs.0hr,病理vs.正?！?目標(biāo)基因管家基因處理后處理前ERBB2GAPDHSampleCalibrator第12頁/共30頁按比例稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定樣本初始模板濃度至少需要兩個標(biāo)準(zhǔn)曲線GOI≥referencegene標(biāo)準(zhǔn)曲線確定反應(yīng)擴增效率相對定量——標(biāo)準(zhǔn)曲線相對定量第13頁/共30頁相對定量：??CT法

依據(jù)：平均相對含量%=2–平均ΔΔCT數(shù)據(jù)處理：△C（t）GOI-△C（t）ref=△C（t）

△C（t）sample-△C（t）calibrator=△△C（t）好處：不做標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)用范圍：擴增效率較高，目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因擴增效率一致并且相互獨立擴增；不做標(biāo)準(zhǔn)曲線，高通量檢測（芯片評估）；不要求很高的精度第14頁/共30頁應(yīng)用實例-基因表達分析

利用TaqMan技術(shù)研究ERBB2在乳腺腫瘤組織標(biāo)本中的表達差異第15頁/共30頁實驗設(shè)計流程RNA提取RT-qPCR實驗結(jié)果分析RNA定量反轉(zhuǎn)錄(RT)設(shè)計qPCR實驗方法AurumTotalRNAkitiScriptcDNASynthesisKit第16頁/共30頁材料和方法已知在50%的乳腺腫瘤樣本中，ERBB2表達異常，因此可以作為一個檢測標(biāo)準(zhǔn)選用GAPDH作為內(nèi)標(biāo)基因

－FAM標(biāo)記的ERBB2探針

－VIC標(biāo)記的GAPDH探針標(biāo)準(zhǔn)品（質(zhì)粒）構(gòu)造標(biāo)準(zhǔn)曲線多重PCR反應(yīng)陰性對照

－無RNA對照（空白）－無逆轉(zhuǎn)錄酶對照（監(jiān)控基因組污染）第17頁/共30頁RNA定性及定量分析Experion?RNAStdSensChip5-500ng/ml100-6,000ntExperion?RNAHighSensChip0.1-5ng/ml100-6,000nt乳癌組織RNA正常乳腺組織

RNA5hr.at90°CIntactIntact7hr.at90°CIntact7hr.degradationGAPDHgeneIntact5hr.degradation第18頁/共30頁一步法＆兩步法在不同的反應(yīng)管中運行RT&PCR1.反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

加熱滅活反轉(zhuǎn)酶2.PCR反應(yīng)2.PCR反應(yīng)1.反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)25°C5min42°C30min85°C5min冷卻至4°CiScriptcDNASynthesisKit第19頁/共30頁設(shè)計qPCR實驗方法定性條件摸索熒光化學(xué)物質(zhì)SYBRGREEN染料Taqman探針定量PCR條件優(yōu)化單雙通道相互驗證Fam標(biāo)記目標(biāo)基因探針VIC標(biāo)記看家基因探針第20頁/共30頁動態(tài)溫度梯度5-6oCBelow10oCAbovePCR優(yōu)化-溫度確定預(yù)設(shè)退火溫度第21頁/共30頁PCR優(yōu)化-熔解曲線第22頁/共30頁}Realannealingrange

PCR優(yōu)化-擴增曲線第23頁/共30頁RT-qPCR實驗95oC,15min94oC,15sec60oC,1minplatereadgotostep3,39moretimes10oC,foreverEnd目標(biāo)基因：未知樣品生成標(biāo)準(zhǔn)曲線：標(biāo)準(zhǔn)品梯度監(jiān)控系統(tǒng)故障：陽性對照監(jiān)控污染：陰性對照/基因組對照校準(zhǔn)生物學(xué)誤差：看家基因降低其余誤差：重復(fù)實驗第24頁/共30頁結(jié)果分析-絕對曲線Color2-VICdetectionforGAPDHColor1–FAMdetectionforERBB2第25頁/共30頁結(jié)果分析-單雙通道相互驗證ERBB2單雙通道相互驗證的實驗結(jié)果A.MultiplexReactionsHealthyRNACarcinoma28.4826.4228.6826.9828.7826.9828.65±0.1526.80±0.32B.SingleplexreactionsHealthyRNACarcinoma28.6727.0928.7126.6828.7326.7028.70±0.0326.82±0.24第26頁/共30頁結(jié)果分析-擴增曲線樣品擴增：正常vs腫瘤PMT1-FAMdetection-ERBB2PMT2-VICdetection-GAPDH腫瘤腫瘤正常第27頁/共30頁HealthyRNATumorRNAGAPDHERBB210951052213024929550085730136000130800Copiesng/μlTotalRNAERBB2

copies/GAPDHcopies1095/95500=0.0111052/85730=0.0122130/136000=0.0172492/130800=0.0197HealthyRNATumorRNA0.0110.0180.018/0.011＝1.63HealthyTissueCarc.TissueRelativeExpression00.20.40.60.811.21.41.61.82結(jié)果計算-雙標(biāo)準(zhǔn)曲線第28頁/共30頁結(jié)果計算-2-ΔΔc(t)法ΔΔC(t)=4.41-5.18 =-0.77±0.182-ΔΔc(t)=1.51－1.93結(jié)果與雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法相近HealthyRNABBER2GAPDHΔC(t)28.4023.