分子生物學(xué)DNA復(fù)制、損傷與修復(fù)

第一節(jié)DNA的復(fù)制(Replication,DNAbiosynthesis)

指DNA雙鏈在細(xì)胞分裂以前進(jìn)行的復(fù)制過程。哺乳動(dòng)物的細(xì)胞周期第一頁，共102頁。（一）半保留復(fù)制

DNA在復(fù)制時(shí)，以親代DNA的每一股作模板，合成完全相同的兩個(gè)雙鏈子代DNA，每個(gè)子代DNA中都含有一股親代DNA鏈，這種現(xiàn)象稱為DNA的半保留復(fù)制(semi-conservativereplication)。意義：半保留復(fù)制說明DNA在代謝上的穩(wěn)定性。經(jīng)過許多代的復(fù)制，DNA鏈仍可保持完整，這在生物的遺傳上是十分重要的。一、DNA復(fù)制特征第二頁，共102頁。DNA以半保留方式進(jìn)行復(fù)制，是在1958年由M.Meselson和

F.Stahl所完成的實(shí)驗(yàn)所證明。該實(shí)驗(yàn)首先將大腸桿菌在含15N的培養(yǎng)基中培養(yǎng)約十五代，使其DNA中的堿基氮均轉(zhuǎn)變?yōu)?5N。將大腸桿菌移至只含14N的培養(yǎng)基中同步培養(yǎng)一代、二代、三代。分別提取DNA，作CsCl密度梯度離心.半保留復(fù)制證據(jù)第三頁，共102頁。（以原核生物大腸桿菌為例）原料：dNTP，Mg++雙鏈DNA模板引物（primer），常是RNA，有游離的3’OH。引物酶（primase，DnaG），用于合成復(fù)制所必需的RNA引物

解螺旋酶(helicase),DnaB,由DnaA和DnaC協(xié)助在復(fù)制的起始點(diǎn)（OriC）上解開雙螺旋。與復(fù)制有關(guān)的酶和因子第四頁，共102頁。復(fù)制的起始點(diǎn)與方向

親代DNA開鏈，復(fù)制起始點(diǎn)呈叉型移動(dòng)復(fù)制叉親代DNA分子3’5’3’5’復(fù)制起始點(diǎn)（ori）：DNA復(fù)制要從DNA分子的特定部位開始，此部位稱復(fù)制起始點(diǎn)

原核：一個(gè)起始點(diǎn)，約245bp,特殊的重復(fù)序列

真核：多個(gè)起始點(diǎn)ori第五頁，共102頁。E.coli復(fù)制起始點(diǎn)oriC跨度為245bp，包括兩個(gè)關(guān)鍵序列：13bp的序列和9bp序列,它是決定和控制E.coli染色體復(fù)制的唯一片段。

13bp序列區(qū)，每一個(gè)順序都由GATC開始，富含A和T，有助于螺旋解開，控制復(fù)制何時(shí)開始。第六頁，共102頁。

9bp重復(fù)序列，重復(fù)出現(xiàn)4次，能與起始蛋白dnaA特異結(jié)合，當(dāng)dnaA蛋白（約20種）結(jié)合于ori的4個(gè)部位上時(shí)復(fù)制開始。

dnaA蛋白（一種專一的蛋白）和ori結(jié)合后，雙螺旋解開形成復(fù)制叉。故dnaA蛋白與啟動(dòng)解鏈有關(guān),dnaA蛋白是起始的關(guān)鍵成分。第七頁，共102頁。大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)成串排列的重復(fù)序列

GATCTNTTNTTT成串排列的三個(gè)13bp序列共有序列共有序列TTATCCACA

DnaA蛋白結(jié)合位點(diǎn)四個(gè)9bp序列DnaADnaB(解螺旋酶)SSB大腸桿菌DNA復(fù)制起點(diǎn)在起始階段的結(jié)構(gòu)模型第八頁，共102頁。復(fù)制方向DNA合成的方向單向、雙向？

1個(gè)起始點(diǎn)第九頁，共102頁。復(fù)制中的大腸桿菌染色體放射自顯影圖

(Caims實(shí)驗(yàn))

將3H-胸苷標(biāo)記大腸桿菌DNA，經(jīng)過近兩代的時(shí)間，3H-胸苷摻入大腸桿菌DNA。用溶菌酶把細(xì)胞壁消化掉，使完整的大腸桿菌染色體DNA釋放出來，放射自顯影，得到上圖。非復(fù)制部分（C）銀粒子密度較低，由一股放射性鏈和一股非放射性鏈構(gòu)成。已復(fù)制部分站整個(gè)染色體的三分之二，其中一條雙鏈（B

）僅有一股鏈?zhǔn)菢?biāo)記的，另外一股雙鏈（A

）的兩股鏈都是標(biāo)記的，銀粒子密度為前二者的兩倍。染色體全長約為1100微米。環(huán)狀DNA的復(fù)制ABCABC第十頁，共102頁。雙向復(fù)制oriori復(fù)制子oriori

真核生物兩個(gè)相鄰復(fù)制起始點(diǎn)之間的DNA片段以起始點(diǎn)為中心，向兩個(gè)方向進(jìn)行復(fù)制第十一頁，共102頁。多個(gè)起始點(diǎn)第十二頁，共102頁。二、DNA復(fù)制的酶學(xué)1.模板：解開成單鏈的DNA母鏈3.DNA聚合酶，DNA-pol2.底物dNTP：dATP，dGTP，dCTP，dTTP4.引物（primer）：RNA引物5.其他酶和蛋白質(zhì)因子第十三頁，共102頁。一、復(fù)制的化學(xué)反應(yīng)生成磷酸二酯鍵N1OH3`5`+dN2TPN1N2-OH3`5`+PPiDNApol3’——TAGAAGACCTATTGGCC——5’5’——ATCTTCTGGATAACCGG——3’第十四頁，共102頁。二、解鏈相關(guān)酶類1.解旋酶(helicase)2.拓?fù)洚悩?gòu)酶（topoisomeraseI、II）

3.單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB)第十五頁，共102頁。

DNA解旋酶(helicase)（解鏈酶）

功能：DNA的雙螺旋解鏈（解DNA雙鏈），解開一對堿基，需2分子ATP，

作用點(diǎn)：DNA上局部單鏈處，向雙鏈方向解鏈。

種類：E.coli有四種解螺旋酶，I、II、III和rep蛋白。I、II、III中任一種沿模板5'-3'方向移動(dòng)，rep蛋白沿模板3'-5'方向移動(dòng)。5′3′5′3′rep第十六頁，共102頁。2.拓?fù)洚悩?gòu)酶（Topo）DNA正超螺旋與負(fù)超螺旋負(fù)超螺旋正超螺旋DNA雙螺旋拓?fù)洚悩?gòu)酶第十七頁，共102頁。第十八頁，共102頁。

首先在大腸桿菌中被發(fā)現(xiàn)，它可使DNA的一條鏈發(fā)生斷裂和再連接，反應(yīng)無需供給能量。

另外，DNA復(fù)制時(shí)負(fù)超螺旋的消除，亦由拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ來完成，但它對正超螺旋無作用。Ⅰ型拓?fù)洚悩?gòu)酶第十九頁，共102頁。

由兩個(gè)A亞基和兩個(gè)B亞基組成，即A2B2。它能使DNA的兩條鏈同時(shí)發(fā)生斷裂和再連接，當(dāng)它引入負(fù)超螺旋以消除復(fù)制叉前進(jìn)帶來的扭曲張力時(shí)，需要由ATP提供能量。

兩種拓?fù)洚悩?gòu)酶在DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和重組中均發(fā)揮重要作用。Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶第二十頁，共102頁。拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑：喜樹堿類拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑：依托泊苷，多柔比星，阿霉素類等第二十一頁，共102頁。3.單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）作用：防止單鏈DNA重新形成雙鏈，防止單鏈DNA被核酸酶水解SSB第二十二頁，共102頁。三、DNA聚合酶（DNA-pol）即依賴于DNA的DNA聚合酶（DDDP）

真核生物有多種：

DNA-pol

、、、、…

原核生物有3種：

DNA-polⅠ、Ⅱ、Ⅲ第二十三頁，共102頁。DNA聚合酶功能5′3′聚合作用5′3′外切酶3′5′外切酶活性第二十四頁，共102頁。大腸桿菌三種DNA聚合酶比較DNA聚合酶Ⅱ分子量每個(gè)細(xì)胞的分子統(tǒng)計(jì)數(shù)5′-3′聚合酶作用3′-5′核酸外切酶作用5′-3′核酸外切酶作用轉(zhuǎn)化率主要功能活性（nt/min）

DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶Ⅲ（復(fù)合物）109，000400+++1校讀,修復(fù)1000120，00040++-0.05400，00010-20+++50復(fù)制100000特性不清填補(bǔ)缺口50第二十五頁，共102頁。四、引物酶(Primase)和引發(fā)體

5′5′催化RNA引物合成的酶叫引物酶，它是一種特殊的RNA聚合酶DNA合成需在RNA引物的基礎(chǔ)上進(jìn)行RNA引物5′3′5′3′第二十六頁，共102頁。DnaA引發(fā)體（primosome）：包括解螺旋酶、DnaC、引物酶及DNA復(fù)制的起始區(qū)域5′3′3′5′引物酶DnaC引發(fā)體解螺旋酶第二十七頁，共102頁。

小結(jié)主要成員

主要作用DnaA識(shí)別復(fù)制起始位點(diǎn)解螺旋酶解開DNA雙鏈SSB維持已解開單鏈DNA的穩(wěn)定引物酶合成RNA引物TOPO使打結(jié)、纏繞、正超螺旋的DNA松馳DNA-polⅢDNA復(fù)制DNA-polⅠ水解引物、填補(bǔ)空隙、修復(fù)作用DNA連接酶催化雙鏈DNA中單鏈缺口的連接第二十八頁，共102頁。第三節(jié)DNA生物合成過程1.復(fù)制的起始2.鏈的延長3.復(fù)制的終止第二十九頁，共102頁。一復(fù)制的起始(一)DNA解成單鏈

由特定蛋白質(zhì)識(shí)別復(fù)制起始位點(diǎn)（ori），在解螺旋酶、TOPO酶及單鏈DNA結(jié)合蛋白的共同作用下，DNA解鏈，解旋，形成復(fù)制叉

倒Y第三十頁，共102頁。(二)引發(fā)體的生成

解旋酶解開雙鏈后引物酶進(jìn)入形成引發(fā)體5′3′3′5′引物酶DnaC引發(fā)體解旋酶第三十一頁，共102頁。（三）RNA引物的合成

5′5′RNA引物5′3′5′3′第三十二頁，共102頁。參與復(fù)制起始的蛋白因子

名稱

功能DnaA蛋白辨認(rèn)起始點(diǎn)

解螺旋酶（DnaB，Rep）解開DNA雙鏈DnaC協(xié)助解螺旋酶

引物酶（DnaG）催化RNA引物生成SSB穩(wěn)定解開的單鏈拓?fù)洚悩?gòu)酶理順DNA鏈OriCE.coli復(fù)制起始點(diǎn)第三十三頁，共102頁。領(lǐng)頭鏈的合成第三十四頁，共102頁。復(fù)制過程簡圖第三十五頁，共102頁。555RNA酶OHP5DNA-polⅠdNTP55PATPADP+Pi55DNA連接酶

隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接第三十六頁，共102頁。二、真核生物DNA生物合成（一）DNA的復(fù)制只發(fā)生在S期（二）多復(fù)制子（三）真核細(xì)胞含有5種DNA聚合酶（四）端粒復(fù)制染色體兩端DNA子鏈上最后復(fù)制的RNA引物，去除后留下空隙。第三十七頁，共102頁。53355335+5333355第三十八頁，共102頁。1.端粒telemer：指真核生物染色體線性DNA分子末端的結(jié)構(gòu)。

2.結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：（1）由末端單鏈DNA序列和蛋白質(zhì)構(gòu)成。（2）末端DNA序列是多次重復(fù)的富含G、C堿基的短序列。第三十九頁，共102頁。3.功能：（1）維持染色體的穩(wěn)定性（2）維持DNA復(fù)制的完整性

4.端粒酶：由RNA和蛋白質(zhì)組成（1）RNA發(fā)揮模板作用（2）蛋白質(zhì)發(fā)揮逆轉(zhuǎn)錄酶活性第四十頁，共102頁。端粒酶的催化延長作用爬行模型第四十一頁，共102頁。DNA聚合酶復(fù)制子鏈進(jìn)一步加工第四十二頁，共102頁。

引物合成后，由DNApolⅢ（在真核細(xì)胞為DNA聚合酶和)催化，按堿基配對原則，將dNTP逐一添加到引物3’

末端，形成磷酸二酯鍵，使新合成的鏈不斷延長

二復(fù)制的延長3’——AAGACCTATT——5’5’——TTCTGGATAA——3’DNAPolI,IIandIII5’-DNA-OH

5’-DNA-O-P-N-OHPP++

dNTPs第四十三頁，共102頁。前導(dǎo)鏈后隨鏈3’5’3’5’延長5’5’5’3’3’5’3’3’5’SSBDNAPolymerase岡崎片斷RNA引物引物酶5’3’5’TOPOⅡ解旋酶第四十四頁，共102頁。（三）終止階段

原核生物基因是環(huán)狀DNA，雙向復(fù)制的復(fù)制片段在復(fù)制的終止點(diǎn)(ter)處匯合。oriter

E.coli8232oriterSV40500第四十五頁，共102頁。半不連續(xù)復(fù)制(semi-discontinuousreplication)領(lǐng)頭鏈連續(xù)復(fù)制而隨從鏈不連續(xù)復(fù)制，就是復(fù)制的半不連續(xù)性。3535解鏈方向3′5′3′3′5′領(lǐng)頭鏈(leadingstrand)隨從鏈(laggingstrand)第四十六頁，共102頁?；蚪M能獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制的功能單位稱為復(fù)制子(replicon)，每個(gè)復(fù)制子都含有控制復(fù)制起始的起點(diǎn)(origin)，可能還有終止復(fù)制的終點(diǎn)(terminus)。每個(gè)起始點(diǎn)產(chǎn)生兩個(gè)移動(dòng)方向相反的復(fù)制叉，復(fù)制完成時(shí)，復(fù)制叉相遇并匯合連接。習(xí)慣上把兩個(gè)相鄰起始點(diǎn)之間的距離定為一個(gè)復(fù)制子。（2）復(fù)制子第四十七頁，共102頁。

DNA復(fù)制時(shí)，以復(fù)制起始點(diǎn)為中心，向兩個(gè)方向進(jìn)行復(fù)制.但在低等生物中,也可進(jìn)行單向復(fù)制（如滾環(huán)復(fù)制）①.原核細(xì)胞：染色體和質(zhì)粒固定起點(diǎn)雙向復(fù)制，②.

真核生物：染色體DNA，復(fù)制時(shí)多個(gè)起始點(diǎn)。（3）復(fù)制方向第四十八頁，共102頁。第四十九頁，共102頁。第五十頁，共102頁。三、需要引物

DNA聚合酶不能直接聚合游離的dNTP，必須由一段核酸片段提供3’OH末端作為引物(primer)，才能開始聚合子代DNA鏈。

RNA引物的大小，在原核生物中通常為50～100個(gè)核苷酸，而在真核生物中約為10個(gè)核苷酸。RNA引物的堿基順序，與其模板DNA的堿基順序相配對。四、雙向復(fù)制

DNA復(fù)制時(shí)，以復(fù)制起始點(diǎn)為中心，向兩個(gè)方向進(jìn)行復(fù)制。但在低等生物中，也可進(jìn)行單向復(fù)制（如滾環(huán)復(fù)制）。

第五十一頁，共102頁。

五、半不連續(xù)復(fù)制（semidiscontinuousreplication）

由于DNA聚合酶只能以5’→3’方向聚合子代DNA鏈，即模板DNA鏈的方向必須為3’→5’。因此，分別以兩條親代DNA鏈作為模板聚合子代DNA鏈時(shí)的方式是不同的。定義：在DNA復(fù)制過程中，親代DNA分子中以3’→5’方向的母鏈作為模板指導(dǎo)新的鏈以5’→

3’方向連續(xù)合成;另一股以5’→

3’為方向的母鏈則指導(dǎo)新合成的鏈以5’→

3’方向合成1000—2000個(gè)核苷酸長度的許多不連續(xù)的片段（崗崎片段）。這種復(fù)制方式稱之為半不連續(xù)復(fù)制。第五十二頁，共102頁。PPPOH+OHPPPOHPPPPPPOHOH+PDNA合成方向不可能是3′→5′的解釋第五十三頁，共102頁。5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’

前導(dǎo)鏈隨從鏈崗崎片段半不連續(xù)復(fù)制

以3'→5'方向的親代DNA鏈作模板的子代鏈在復(fù)制時(shí)基本上是連續(xù)進(jìn)行的，其子代鏈的聚合方向?yàn)?'→3'，這一條鏈被稱為領(lǐng)頭鏈(leadingstrand)。而以5'→3'方向的親代DNA鏈為模板的子代鏈在復(fù)制時(shí)則是不連續(xù)的，其鏈的聚合方向也是5'→3'，這條鏈被稱為隨從鏈(laggingstrand)。

第五十四頁，共102頁。前導(dǎo)鏈：在引物的3’端按5’→3’方向連續(xù)不斷地合成的DNA鏈。隨從鏈：在引物的3’端按5’→3’方向不連續(xù)合成的DNA鏈。岡崎片段：隨從鏈上不連續(xù)合成的DNA短片段（不包括引物）

由于親代DNA雙鏈在復(fù)制時(shí)是逐步解開的，因此，隨從鏈的合成是一段一段的。DNA在復(fù)制時(shí)，由隨從鏈所形成的一些子代DNA短鏈稱為岡崎片段(Okazakifragment)。

岡崎片段的大小，在原核生物中約為1000～2000個(gè)核苷酸，而在真核生物中約為100個(gè)核苷酸。

第五十五頁，共102頁。五、DNA聚合酶（DNApolymerase）聚合酶III——主要的復(fù)制酶，兼有校讀、糾錯(cuò)的功能有從5’——3’延伸多核苷酸鏈的聚合酶活性，有模板依賴性，其延伸的方式是依據(jù)堿基互補(bǔ)配對的原則，將原料dNTP與末端核苷酸游離的3’OH以3’,5’磷酸二酯鍵連接，同時(shí)釋出一個(gè)PPi

。DNA聚合酶延伸多核苷酸鏈的方向總是5’3’

有從3’——5’外切酶的活性，以切除可能錯(cuò)配的核苷酸第五十六頁，共102頁。聚合酶I用于切除引物RNA,并填補(bǔ)留下的空隙

有從5’——3’延伸多核苷酸鏈的聚合酶的活性；有從3’——5’外切酶的活性，以切除可能錯(cuò)配的核苷酸；有從5’——3’外切酶的活性，其作用是切除引物聚合酶II活性弱,作用與聚合酶III相似有從5’——3’延伸多核苷酸鏈的聚合酶活性；有從3’——5’外切酶的活性第五十七頁，共102頁。323個(gè)氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段/Klenow片段

604個(gè)氨基酸DNA聚合酶活性

5核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶DNA-polⅠKlenow片段是實(shí)驗(yàn)室合成DNA，進(jìn)行分子生物學(xué)研究中常用的工具酶。

第五十八頁，共102頁。六、DNA連接酶（ligase）

將不連續(xù)的DNA片段以3’，5’磷酸二酯鍵連接起來，原核生物通過分解NAD為NMN和Pi提供能量，真核生物則消耗ATP第五十九頁，共102頁。復(fù)制的終止由DNA聚合酶I完成切除引物，并且填補(bǔ)空隙，由DNA連接酶將DNA片段連接起來。第六十頁，共102頁。

一個(gè)復(fù)制子只含有一個(gè)專一的復(fù)制起點(diǎn)和復(fù)制結(jié)束的終點(diǎn)。一個(gè)完整的復(fù)制子在一個(gè)細(xì)胞周期只復(fù)制一次(真核)。

原核生物染色體和質(zhì)粒都是獨(dú)立（只有單一個(gè)）復(fù)制子；真核細(xì)胞染色體中有多個(gè)復(fù)制子組成。第六十一頁，共102頁。（七）真核生物端粒的形成端粒(telomere)是指真核生物染色體線性DNA分子末端的結(jié)構(gòu)部分，通常膨大成粒狀。其共同的結(jié)構(gòu)特征是由一些富含G、C的短重復(fù)序列構(gòu)成可重復(fù)數(shù)十次至數(shù)百次。線性DNA在復(fù)制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出現(xiàn)縮短。故需要在端粒酶（telomerase）的催化下，進(jìn)行延長反應(yīng)。

端粒酶是一種RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體，它可以其RNA為模板，通過逆轉(zhuǎn)錄過程對末端DNA鏈進(jìn)行延長。第六十二頁，共102頁。端粒（telomere）

染色體線性DNA分子末端通常膨大成粒狀共同的結(jié)構(gòu)特征:

富含TG

短重復(fù)序列維持染色體穩(wěn)定端粒酶（telomerase）

RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體逆轉(zhuǎn)錄酶延長末端DNA鏈進(jìn)行第六十三頁，共102頁。在真核生物，由端粒酶（telomerase）催化,在真核線性DNA的末端形成一種特殊的結(jié)構(gòu)并與蛋白質(zhì)結(jié)合成端粒（telomere）。

端粒由成百個(gè)6個(gè)核苷酸的重復(fù)序列所組成（人為TTAGGG，四膜蟲為TTGGGG）。端粒的功能為穩(wěn)定染色體的末端結(jié)構(gòu)，防止染色體間末端連接，并可補(bǔ)償滯后鏈5′-末端在消除RNA引物后造成的空缺。復(fù)制可使端粒5′末端縮短，而端粒酶（telomerase）可外加重復(fù)單位到5′-末端上，結(jié)果使端粒維持一定的長度。第六十四頁，共102頁。4、

DNA的幾種復(fù)制方式（1）、

直線雙向復(fù)制單點(diǎn)雙向，T7多點(diǎn)雙向，真核染色體DNA（2）、θ型復(fù)制：環(huán)狀雙鏈DNA，對稱復(fù)制，單向或雙向（E.coli.）（3）、

滾環(huán)復(fù)制：環(huán)狀單鏈DNA，Φx174（4）、

D環(huán)復(fù)制（取代環(huán)復(fù)制）：不對稱復(fù)制，線粒體、葉綠體DNA。兩條鏈的復(fù)制起點(diǎn)不在同一點(diǎn)上，一條鏈先復(fù)制，另一條鏈保持單鏈而被取代：當(dāng)一條鏈復(fù)制到一定程度時(shí)才暴露出另一條鏈的復(fù)制起點(diǎn)，另一條鏈才開始復(fù)制。第六十五頁，共102頁。第六十六頁，共102頁。第六十七頁，共102頁。三、滾環(huán)復(fù)制和D環(huán)復(fù)制滾環(huán)復(fù)制(rollingcirclereplication)：是某些低等生物的復(fù)制形式，如X174和M13噬菌體等。第六十八頁，共102頁。35553335'滾環(huán)復(fù)制的過程3-OH5-P5'5335第六十九頁，共102頁。D環(huán)復(fù)制(D-loopreplication)：是線粒體DNA(mitochondrialDNA，mtDNA)的復(fù)制形式。dNTPDNA-polγ

第七十頁，共102頁。線粒體(mitochodriaDNA,mtDNA)哺乳動(dòng)物線粒體mtDNA是一個(gè)長度為16.5kb的緊密雙鏈閉合環(huán)狀分子，外環(huán)為重鏈（H鏈），內(nèi)環(huán)為輕鏈（L鏈），以D環(huán)復(fù)制方式進(jìn)行。第七十一頁，共102頁。第二節(jié)DNA的損傷一、DNA的損傷（突變）由自發(fā)的或環(huán)境的因素引起DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的任何異常的改變稱為DNA的損傷，也稱為突變（mutation）。常見的DNA的損傷包括堿基脫落、堿基修飾、交聯(lián)，鏈的斷裂，重組等。（一）引起突變的因素1．自發(fā)因素(1)自發(fā)脫堿基：由于N-糖苷鍵的自發(fā)斷裂，引起嘌呤或嘧啶堿基的脫落。每日可達(dá)近萬個(gè)核苷酸殘基。(2)自發(fā)脫氨基：胞嘧啶自發(fā)脫氨基可生成尿嘧啶，腺嘌呤自發(fā)脫氨基可生成次黃嘌呤。每日可達(dá)幾十到幾百個(gè)核苷酸殘基。(3)復(fù)制錯(cuò)配：由于復(fù)制時(shí)堿基配對錯(cuò)誤引起的損傷，發(fā)生頻率較低。第七十二頁，共102頁。2．物理因素

由紫外線、電離輻射、X射線等引起的DNA損傷。其中，X射線和電離輻射常常引起DNA鏈的斷裂，而紫外線常常引起嘧啶二聚體的形成，如TT，TC，CC等二聚體。這些嘧啶二聚體由于形成了共價(jià)鍵連接的環(huán)丁烷結(jié)構(gòu)，因而會(huì)引起復(fù)制障礙。

第七十三頁，共102頁。3．化學(xué)因素(1)脫氨劑：如亞硝酸與亞硝酸鹽，可加速C脫氨基生成U，A脫氨基生成I。(2)烷基化劑：這是一類帶有活性烷基的化合物，可提供甲基或其他烷基，引起堿基或磷酸基的烷基化，甚至可引起鄰近堿基的交聯(lián)。(3)DNA加合劑：如苯并芘，在體內(nèi)代謝后生成四羥苯并芘，與嘌呤共價(jià)結(jié)合引起損傷。(4)堿基類似物：如5-FU等，可摻入到DNA分子中引起損傷或突變。(5)斷鏈劑：如過氧化物，含巰基化合物等，可引起DNA鏈的斷裂。

第七十四頁，共102頁。（二）DNA突變的類型堿基的轉(zhuǎn)換

第七十五頁，共102頁。第三節(jié)DNA損傷的修復(fù)

DNA損傷的修復(fù)方式可分為直接修復(fù)和取代修復(fù)兩大類。

第七十六頁，共102頁。

⌒hv

UV→TT→光復(fù)活酶→

修復(fù)TT（一）直接修復(fù)1．光復(fù)活（lightrepairing）

這是一種廣泛存在的修復(fù)作用。光復(fù)活能夠修復(fù)任何嘧啶二聚體的損傷。其修復(fù)過程為：

光復(fù)活酶（photo-lyase)識(shí)別嘧啶二聚體并與之結(jié)合形成復(fù)合物→在300～600nm可見光照射下，酶獲得能量，將嘧啶二聚體的丁酰環(huán)打開，使之完全修復(fù)→光復(fù)活酶從DNA上解離。

第七十七頁，共102頁。2．轉(zhuǎn)甲基作用

在轉(zhuǎn)甲基酶的催化下，將DNA上的被修飾的甲基去除。此時(shí)，轉(zhuǎn)甲基酶自身被甲基化而失活。3．直接連接

DNA斷裂形成的缺口，可以在DNA連接酶的催化下，直接進(jìn)行連接而封閉缺口。

第七十八頁，共102頁。（二）取代修復(fù)1．切除修復(fù)(excisionrepairing)

這也是一種廣泛存在的修復(fù)機(jī)制，可適用于多種DNA損傷的修復(fù)。該修復(fù)機(jī)制可以分別由兩種不同的酶來發(fā)動(dòng)，一種是核酸內(nèi)切酶，另一種是DNA糖苷酶?！锌尚迯?fù)TT，電離輻射，某些化學(xué)誘變劑造成的DNA結(jié)構(gòu)的破壞

參加的酶有：特異的核酸內(nèi)切酶；外切酶；聚合酶；連接酶。第七十九頁，共102頁。第八十頁，共102頁。第八十一頁，共102頁。第八十二頁，共102頁。2．重組修復(fù)(recombinationrepairing)

這是DNA的復(fù)制過程中所采用的一種有差錯(cuò)的修復(fù)方式。(重組修復(fù)，復(fù)制后修復(fù)

)

第八十三頁，共102頁。3．SOS修復(fù)

由DNA損傷或抑制復(fù)制的處理所引起的一系列復(fù)雜的誘導(dǎo)效應(yīng)，稱為應(yīng)急反應(yīng)（SOS）。這是一種在DNA分子受到較大范圍損傷并且使復(fù)制受到抑制時(shí)出現(xiàn)的修復(fù)機(jī)制，以SOS借喻細(xì)胞處于危急狀態(tài)。

DNA分子受到長片段高密度損傷，使DNA復(fù)制過程在損傷部位受到抑制。損傷誘導(dǎo)一種特異性較低的新的DNA聚合酶，以及重組酶等的產(chǎn)生。由這些特異性較低的酶繼續(xù)催化損傷部位DNA的復(fù)制，復(fù)制完成后，保留許多錯(cuò)誤的堿基，從而造成突變。

第八十四頁，共102頁。DNA損傷與藥物評(píng)價(jià)1.遺傳毒性試驗(yàn)遺傳毒性研究在藥物研發(fā)中處于比較的重要位置。遺傳毒性試驗(yàn)?zāi)軝z出DNA損傷及其損傷的固定。以基因突變、較大范圍染色體損傷、重組和染色體數(shù)目改變形式出現(xiàn)的DNA損傷的固定，一般被認(rèn)為是可遺傳效應(yīng)的基礎(chǔ)，并且是惡性腫瘤發(fā)展過程的環(huán)節(jié)之一。在檢測這些類別損傷的試驗(yàn)中呈陽性的化合物為潛在人類致癌劑和/或致突變劑。由于在人體中已建立了某些化合物的暴露和致癌性之間的關(guān)系，而對于遺傳性疾病尚難以證明有類似的關(guān)系，故遺傳毒性試驗(yàn)主要用于致癌性預(yù)測。第八十五頁，共102頁。實(shí)驗(yàn)方法

Ames試驗(yàn)（污染物致突變性檢測）是檢測化學(xué)物質(zhì)基因突變的常用方法。沙門氏菌回復(fù)突變試驗(yàn)鼠傷寒沙門氏菌（Salmonellatyphimurium）的組氨酸營養(yǎng)缺陷型（his－）菌株，在含微量組氨酸的培養(yǎng)基中，除極少數(shù)自發(fā)回復(fù)突變的細(xì)胞外，一般只能分裂幾次，形成在顯微鏡下才能見到的微菌落。受誘變劑作用后，大量細(xì)胞發(fā)生回復(fù)突變，自行合成組氨酸，發(fā)育成肉眼可見的菌落。第八十六頁，共102頁。在評(píng)價(jià)突變危害中常用的有特殊重要意義的試驗(yàn)第八十七頁，共102頁。第八十八頁，共102頁。TK基因突變試驗(yàn)

TK基因突變試驗(yàn)是一種哺乳動(dòng)物體細(xì)胞基因正向突變試驗(yàn),近年來其應(yīng)用價(jià)值有明顯的提高。TK基因突變試驗(yàn)的檢測終點(diǎn)是胸苷激酶（thymidinekinase，TK）基因的突變。在人類，TK基因定位于17號(hào)染色體長臂遠(yuǎn)端；在小鼠則定位于11號(hào)染色體。故TK基因的突變屬于常染色體基因突變。第八十九頁，共102頁。TK基因的產(chǎn)物胸苷激酶在體內(nèi)催化從脫氧胸苷（TdR）生成胸苷酸（TMP）的反應(yīng)。在正常情況下，此反應(yīng)并非生命所必需，原因是體內(nèi)的TMP主要來自于脫氧尿嘧啶核苷酸（dUMP），即由胸苷酸合成酶催化的dUMP甲基化反應(yīng)生成TMP。但如在細(xì)胞培養(yǎng)物中加入胸苷類似物（如三氟胸苷，即TFT——trifluorothymidine），則TFT在胸苷激酶的催化下可生成三氟胸苷酸，進(jìn)而摻入DNA，造成致死性突變，故細(xì)胞不能存活。若TK基因發(fā)生突變，導(dǎo)致胸苷激酶缺陷，則TFT不能磷酸化，亦不能摻入DNA，故細(xì)胞在含有TFT的培養(yǎng)基中能夠生長，即表現(xiàn)出對TFT的抗性。根據(jù)突變集落形成數(shù)，計(jì)算突變頻率，以判定受試物的致突變性。第九十頁，共102頁。試驗(yàn)采用的靶細(xì)胞系主要有小鼠淋巴瘤細(xì)胞L5178Y以及人類淋巴母細(xì)胞TK6和WTK1等。其基因型均為tk+/-。TK基因突變試驗(yàn)可檢出包括點(diǎn)突變、大的缺失、重組、染色體異倍性和其他較大范圍基因組改變在內(nèi)的多種遺傳改變。第九十一頁，共102頁。轉(zhuǎn)基因小鼠基因突變試驗(yàn)轉(zhuǎn)基因小鼠基因突變試驗(yàn)可在整體狀態(tài)下檢測基因突變,比較不同組織(包括生殖腺)的突變率,確定靶器官,對誘發(fā)的遺傳改變作精確分析等。國外已陸續(xù)發(fā)展了多種用于突變檢測的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,其中3種已投入商品化生產(chǎn),MutaTM小鼠、Big-BlueTM小鼠和Xenomouse小鼠,它們分別采用大腸桿菌乳糖操縱子的LacZ和/或Lacl作為誘變的靶基因。第九十二頁，共102頁。反向限制性酶切位點(diǎn)突變分析法(inverserestrictionsitemutation,iRSM)

iRSM適用于快速檢測誘變劑所致體內(nèi)外DNA的突變，這些突變的特點(diǎn)是使某一酶切位點(diǎn)變?yōu)榱硪幻盖形稽c(diǎn)。該方法建立者Jenkins等首先將iRSM應(yīng)用于化學(xué)誘變劑所致動(dòng)物體內(nèi)p53基因的突變檢測:小鼠分別口服N-乙基N-亞硝基脲(ENU)、2-乙酰氨基芴(2-AAF)和二甲基酰肼(DMH)3天后,以iRSM方法相應(yīng)地檢測小鼠脾、骨髓和肝組織p53基因第6內(nèi)含子區(qū)域的Apa→Ava位點(diǎn)反向突變。結(jié)果表明ENU誘發(fā)肝組織p53基因突變的發(fā)生率為33%,2-AAF使肝組織突變的發(fā)生率為25%,這一陽性突變率反映出了不同誘變劑對相應(yīng)組織的致突變強(qiáng)度,進(jìn)一步驗(yàn)證了該方法的高靈敏度和準(zhǔn)確性。它具有靈敏度高、快速、操作簡便、以及突變