蛋白免疫快速診斷應用技術

關于蛋白免疫快速診斷應用技術第一頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期三交流提綱

前言一）、免疫檢測基礎知識及免疫檢測技術的進展綜述二）、快速免疫檢測技術現(xiàn)狀和前景展望三）、快速免疫檢測技術的應用介紹四）、思考——

胸懷大志，放眼世界，立志細節(jié)第二頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期三前言：1、個人所從事的行業(yè)和專業(yè)的限制1）醫(yī)學專業(yè)、生物專業(yè)、化學專業(yè)（人）2）臨床免疫類檢驗試劑（人用）的開發(fā)3）對客戶/臨床需求有所了解2、有可能找到的共同點1）所采用技術方法具有共同點2）為了共同的目標——為人類健康服務第三頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期三一、免疫檢測基礎知識及免疫檢測技術的進展綜述

免疫學技術的范疇1、對具有免疫活性物質的定性、定量測定2、對免疫系統(tǒng)的組成成分的數(shù)量、狀態(tài)的測定第四頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期三一、免疫檢測基礎知識及免疫檢測技術的進展綜述

免疫學技術的應用特點1、對象——“包羅萬象”2、方法——“兼容并蓄”第五頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期三一、免疫檢測技術的進展綜述

抗原的概念與屬性1、免疫原性——可識別、可反應性（誘導機體產生免疫應答的特性）2、免疫反應性

——選擇結合性（和免疫應答產物特異性結合的特性）第六頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期三一、免疫檢測技術的進展綜述

抗原抗體反應的特點1、特異性2、可逆性3、適合比例性第七頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期三一、免疫檢測技術的進展綜述

免疫學檢測技術評價標準1、Specificity（特異）2、Sensitivity（敏感）3、Simplicity（簡便）4、Safety（安全）5、Saving（節(jié)約）第八頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期三一、免疫檢測技術的進展綜述

免疫檢測技術的進展1、經典的免疫分析技術凝集反應、沉淀反應、溶血反應、補體結合實驗特點：成本低、技術簡單、結果易于判斷，但不易于實現(xiàn)自動化。2、現(xiàn)代的免疫分析技術熒光免疫標記、放射性免疫標記、酶免疫標記、鑭系（稀土）元素免疫標記、膠體顆粒標記、臨床化學免疫分析技術、發(fā)光免疫標記、流式免疫微球技術及生物傳感器技術等。特點：靈敏、特異、快速、易于測定及實現(xiàn)自動化。第九頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期三二、快速免疫檢測技術的過去、現(xiàn)狀和未來POCT概念的引入POCT——PointofCareTesting不需要固定的場地、不需要太多的時間、也不需要特定的地方、在沒有實驗室設備的條件下也能完成檢測。檢測可在患者身邊或者靠近患者的地方完成。Testsdesginedtobeatornearthesitewherethepatientislocated,thatdonotrequirepermanentspace,andthatareperformedoutsidethephysicalfacilitiesoftheclinicallaboratory.(美國病理家學會CollegeofAmericanPathologists）

第十頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期三二、快速免疫檢測技術的過去、現(xiàn)狀和未來POCT技術已使用了上千年1、約公元前1500年法老的私人醫(yī)生注意到有些人的尿液吸引了很多螞蟻，而另一些人的尿液則沒有。2、后來發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象與尿液中的葡萄糖濃度有關第十一頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期三二、快速免疫檢測技術的過去、現(xiàn)狀和未來美國FDA對簡便實驗的定義1988年美國臨床實驗室改良法案：臨床豁免權1、全自動化儀器直接使用未處理過的標本/毛細管血（指尖血）、鼻拭子或尿液；2、對標本只需進行基本的、無技術要求的處理，包括去污；3、對試劑只需要進行基本的、無技術要求的處理，例如，將試劑A和試劑B混勻4、分析步驟不需要操作者干預5、不需要技巧或專門知識第十二頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期三二、快速免疫檢測技術的過去、現(xiàn)狀和未來美國FDA對簡便實驗的定義6、無需電子或機械設備保養(yǎng)7、所得結果不需要操作者校準、解釋和計算8、結果易讀，例如陽性或陰性，直接讀出數(shù)值，線條很明顯或無線條存在，即等級明顯9、試驗性能可與可溯源的參考方法相比較10、有用戶可看懂的快速參考指南

/cdrh/ovid/guidance/1171.pdf第十三頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期三二、快速免疫檢測技術的過去、現(xiàn)狀和未來POCT的術語1、護理點/床邊/即時檢驗（PointofCareTesting)2、近患者檢驗(NearPatientTesting)3、醫(yī)務室檢驗(PhysiciansOfficeTesting)4、床邊檢驗(BesideTesting)5、實驗室外檢驗(Extra-laboratoryTesting)6、分散檢驗(DecentralizedTesting)7、機構外檢驗(OffsiteTesting)8、輔助檢驗(AncillaryTesting)9、替換點檢驗(AlternativeSiteTesting)第十四頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期三二、快速免疫檢測技術的過去、現(xiàn)狀和未來看看發(fā)生了什么變化？不需要專業(yè)的操作者需要專業(yè)的操作者不需要專業(yè)的裝置需要專業(yè)的裝置第十五頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期三二、快速免疫檢測技術的過去、現(xiàn)狀和未來POCT產品都在哪里應用日間病房救護車醫(yī)生研究室血庫社區(qū)衛(wèi)生診所環(huán)境實驗室健康義診家庭康復機構消防隊康復中心第十六頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期三二、快速免疫檢測技術的過去、現(xiàn)狀和未來為什么要推動POCT產品？護理過程最佳化病人護理產出災難救助測試平臺法規(guī)要求工業(yè)吸引力勞動力問題第十七頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期三二、快速免疫檢測技術的過去、現(xiàn)狀和未來POCT產品的優(yōu)點操作人員不需要技術背景周轉時間的改善提高了治療的忠誠度檢測越好，做的越頻繁樣品量少經濟利益減少住院天數(shù)減少并發(fā)癥第十八頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期三二、快速免疫檢測技術的過去、現(xiàn)狀和未來POCT產品的優(yōu)點：周轉時間摘自Price,BMJ2001的文章試驗實驗室POCT分鐘（變化%）尿液分析404-36（90）妊娠785-71（94）葡萄糖106-4（60）第十九頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期三二、快速免疫檢測技術的過去、現(xiàn)狀和未來POCT產品的缺陷操作者無技術背景結果質量差，與實驗室結果有一定差異不經濟資料不便記錄第二十頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期三二、快速免疫檢測技術的過去、現(xiàn)狀和未來當前POCT的應用（1）1、乳膠凝集試驗實驗時間為10-15分鐘快速、基本不需要儀器試劑可以冷凍敏感性差8-10%的反應結果不好解釋2、直接熒光抗體試驗30-60分鐘，需要多個步驟需要有昂貴的熒光顯微鏡及熟練的操作人員第二十一頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期三二、快速免疫檢測技術的過去、現(xiàn)狀和未來當前POCT的應用（2）3、FISH(熒光原位雜交）需要一段已知的DNA序列需要一臺熒光顯微鏡，且有熟練顯微鏡操作的人員步驟多，實驗時間為1-2小時4、免疫層析（滲濾）試驗敏感性高、特異性強總實驗時間5-15分鐘不需要儀器、也不需要基本的培訓樣品不需要特殊處理免疫層析（滲濾）產品是繼尿試紙條和血糖試條之后，當前最為受歡迎的POCT產品第二十二頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期三二、快速免疫檢測技術的過去、現(xiàn)狀和未來免疫滲濾試驗主要由兩部分組成：膜滲濾裝置和標記結合物。前者為一塑料小盒，其中填滿吸水性物質，面上緊貼放置一片吸附有抗體(以雙抗體夾心法測抗原為例)的硝酸纖維膜，標記結合物為免疫金。A：金標記抗體B：標本中的抗原C：包被抗體D：NC膜E：吸水材料F：塑料盒第二十三頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期三二、快速免疫檢測技術的過去、現(xiàn)狀和未來免疫層析試驗免疫層析法中滴加在膜一端的樣品溶液受膜的毛細管作用(基于層析作用的橫流（lateralflow）)向另一端移動。移動過程中被分析物與固定在膜上某一區(qū)域的受體(抗原或者抗體)結合而被固相化，無關物質則越過該區(qū)域而被分離，然后通過標記物顯色來判定試驗結果，以膠體金為標記物的實驗稱為膠體金免疫層析試驗。第二十四頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期三二、快速免疫檢測技術的過去、現(xiàn)狀和未來POCT的未來？？？？微流體技術？納米技術？第二十五頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期三三、快速免疫層析技術的應用介紹能用來做什么傳染病抗原或抗體測定腫瘤標志物測定激素測定農藥殘留測定抗生素測定毒素測定藥物濫用（毒品）測定第二十六頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期三三、快速免疫層析技術的應用介紹針對檢驗、我們能做什么傳染病抗原或抗體測定腫瘤標志物測定？？？？激素測定農藥殘留測定抗生素測定毒素測定藥物濫用（毒品）測定立足需求，充分考慮和整合各種優(yōu)勢資源！第二十七頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期三三、快速免疫層析技術的應用介紹我們要怎么去做調研：我們要做采用什么平臺技術平臺建設：我們建立快速免疫層析技術平臺項目：我們要做什么項目？準備：我們擁有了哪些資源，我們還缺少什么資源？第二十八頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期三三、快速免疫層析技術的應用介紹免疫層析技術平臺硬件：實驗室；設備；生產車間？軟件：SOP?人員：專業(yè)培訓、團隊建設第二十九頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期三三、快速免疫層析技術的應用介紹如何去開發(fā)一個膠體金層析產品

——以尿妊娠試紙（HCG)為例第三十頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期三三、快速免疫層析技術的應用介紹尿妊娠試紙（HCG)的反應原理圖雙抗體夾心法第三十一頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期三三、快速免疫層析技術的應用介紹尿妊娠試紙（HCG)的產品研發(fā)準備1、生物材料的準備：配對的單克隆抗體（特異性針對HCG-α,β亞基)二抗2、主要生產材料硝酸纖維素膜（特定孔徑、流速）樣品墊結合墊吸收墊（吸水紙）、片材（PVC襯板）等第三十二頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期三三、快速免疫層析技術的應用介紹尿妊娠試紙（HCG)的研發(fā)準備3、主要設備點膜儀噴金儀干燥設備粘帖裝置切刀第三十三頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期三三、快速免疫層析技術的應用介紹尿妊娠試紙（HCG)部分材料的工藝和質量控制1、特異性的單克隆抗體親和力特異性穩(wěn)定性第三十四頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期三三、快速免疫層析技術的應用介紹尿妊娠試紙（HCG)部分材料的工藝和質量控制2、標記物與蛋白偶聯(lián)顆粒大小顆粒的均一性顆粒的形狀標記物與蛋白的最佳比例標記影響影響因素考慮第三十五頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期三三、快速免疫層析技術的應用介紹尿妊娠試紙（HCG)部分材料的工藝和質量控制蛋白與膠體金的偶聯(lián)：最佳pH測定：取若干1.5ml的試管，分別加入1ml膠體金用K2CO3將pH分別調為3，4，5，6，7，8，9，10；加入過量待標記蛋白；取96孔培養(yǎng)板，按pH從高到低分別將上述膠體金分別取100μl加入孔中，重復三次；每孔分別加入20μl濃度為10%的NaCl溶液，混合，室溫下放置10min；觀察膠體金顏色變化，記錄保持紅色的最低pH第三十六頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期三三、快速免疫層析技術的應用介紹尿妊娠試紙（HCG)部分材料的工藝和質量控制蛋白與標記物的偶聯(lián)：最佳偶聯(lián)比例確定：以目測法確定膠體金與待標記蛋白質用量比例，將標記的蛋白質逐級稀釋后（由5μg～45μg另設對照管），各取等體積順序加入一系列裝有1ml膠體金的試管中，5min后，在上述各管內分別加入0.1ml10%氯化鈉。第三十七頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期三三、快速免疫層析技術的應用介紹尿妊娠試紙（HCG)部分材料的工藝和質量控制3、樣品墊

玻璃纖維、聚酯膜、纖維素濾紙、無紡布等多種材質，多種規(guī)格，批間穩(wěn)定。樣品墊的作用：減緩樣品滲透速度，有利于樣品在結合墊上均勻分布；去除樣品中雜質顆粒；調節(jié)樣品等。樣本墊可使用化學物質進行浸漬處理，從而減少樣本差異，提高試驗的靈敏度。通?？梢詫⑾礈靹⒄承栽鰪妱?、阻滯劑及鹽滲入樣本墊然后加以干燥，該工藝可避免使用復雜辨識劑/追跡緩沖液的麻煩，使檢測一步完成。第三十八頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期三三、快速免疫層析技術的應用介紹尿妊娠試紙（HCG)部分材料的工藝和質量控制4、結合墊玻璃纖維、聚酯膜、纖維素濾紙、無紡布等多種材質，多種規(guī)格，批間穩(wěn)定。結合墊的作用主要為：

-吸附一定量的標結合物顆粒；

-吸附并持續(xù)不斷的將樣品轉移到NC膜上；

-保持標結合物顆粒的穩(wěn)定性；

-保證標結合物顆粒定量完全釋放等。第三十九頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期三三、快速免疫層析技術的應用介紹尿妊娠試紙（HCG)部分材料的工藝和質量控制5、硝酸纖維素膜(Nitrocellulose)：推薦使用Millipore，S&S等國外公司的硝酸纖維素膜。

NC膜的作用：-在檢測線和對照線條帶區(qū)域固定抗體；-樣品在NC膜上流動并與試劑混合發(fā)生免疫反應；

-反應在NC膜上顯色，讀檢測結果

NC膜的重要參數(shù)：孔徑、對稱性、層析速度、蛋白結合力、強度、表面質量、厚度、批間均一性等。第四十頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期三三、快速免疫層析技術的應用介紹尿妊娠試紙（HCG)部分材料的工藝和質量控制5、硝酸纖維膜硝酸纖維膜的分類標準(μm和s)μm:指的是膜孔徑，此說法實際上是沿用了一直以來的一個形象稱呼。

s:以秒為單位的定義為，每4cm膜，水的層析時間是**s.

換算情況大致為：8μm=135s；6μm=180s不同秒數(shù)的膜對反應的影響通過速度越快和包被在T線的物質反應時間也就越短，讀數(shù)快，那么靈敏度也就越低。反之，反應時間長，讀數(shù)慢，也就靈敏度高。同時還有一個問題是，反應時間越長，發(fā)生非特異性結合的可能性就越大，所以過長時間的反應不一定就能夠真正的提升靈敏度。

135s一般用在雙抗體夾心法，180s一般用在競爭法.

第四十一頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期三三、快速免疫層析技術的應用介紹尿妊娠試紙（HCG)部分材料的工藝和質量控制5、硝酸纖維膜如何選擇物理性能膜的物理性能主要是2個參數(shù)，膜厚度和寬度厚度不均勻影響生物原料在膜上的擴散性能，點出來的C/T線寬窄不一，另外也影響爬速；寬度(檢測區(qū)的長度)和爬速及靈敏度的關系跑水性能注入足夠溶液到槽內，將不同批次膜每隔1cm做一次標記（總長大于4cm）并放到傾斜支架，整個支架下端放入溶液槽，膜開始吸液，計時。記錄每個標記處的通過時刻，并與對照組比較。跑板時，理論上溶液呈水平線形式上吸，觀測是否有波浪傾斜或包圍潤濕等反?，F(xiàn)象。點樣測試

C/T線出線時間和靈敏度

第四十二頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期三