基因克隆與表達(dá)

基因克隆與表達(dá)第1頁(yè)/共74頁(yè)基因克隆(genecloning)RACE技術(shù)服務(wù)基因表達(dá)(geneexpression)-原核基因表達(dá)-真核基因表達(dá)第2頁(yè)/共74頁(yè)基因克隆

GeneCloning第3頁(yè)/共74頁(yè)概述克隆載體受體細(xì)胞體外重組的策略基因克隆工作流程第4頁(yè)/共74頁(yè)一、概述確定了遺傳信息的攜帶者揭示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機(jī)理提出了中心法則和操縱子學(xué)說(shuō)，破譯了遺傳密碼概述第5頁(yè)/共74頁(yè)1973年Cohen完成第一個(gè)基因工程實(shí)驗(yàn)經(jīng)體外重組獲得雜合DNA雜合子轉(zhuǎn)化入大腸桿菌所需元件：

限制性內(nèi)切酶連接酶載體受體細(xì)胞第6頁(yè)/共74頁(yè)通過(guò)體外重組技術(shù),將一段目的DNA經(jīng)切割、連接插入適當(dāng)載體，并導(dǎo)入受體細(xì)胞，擴(kuò)增形成大量子代分子的過(guò)程。

基因克?。ǚ肿涌寺olecularcloning）第7頁(yè)/共74頁(yè)基因克隆的核心體外重組(Recombination):人工將一段目的DNA插入一個(gè)載體的過(guò)程。

第8頁(yè)/共74頁(yè)基因克隆的技術(shù)路線

目的基因載體體外重組重組子（雜合DNA）轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞篩選陽(yáng)性克隆大量擴(kuò)增，獲得子代DNA第9頁(yè)/共74頁(yè)第10頁(yè)/共74頁(yè)二、克隆載體復(fù)制基因(replicator)選擇性記號(hào)克隆位點(diǎn)第11頁(yè)/共74頁(yè)三、受體細(xì)胞1、定義：外源DNA導(dǎo)入的細(xì)胞，是重組體擴(kuò)增的場(chǎng)所。2、要求：易于接納外源DNA

無(wú)特異的內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶載體復(fù)制、擴(kuò)增不受阻與載體有互補(bǔ)性第12頁(yè)/共74頁(yè)四、體外重組的策略粘-粘連接：最有效、最快捷第13頁(yè)/共74頁(yè)4、T-A克隆T-vector兩條鏈的5’端含有一個(gè)游離的TPCR過(guò)程中，普通的Taq酶可在產(chǎn)物的3’端多加一個(gè)A第14頁(yè)/共74頁(yè)五、基因克隆的工作流程（一）目的基因的獲得（二）體外重組（三）轉(zhuǎn)化—Cacl2法、電擊法（四）重組子的篩選及鑒定1、篩選：平板法（抗生素、藍(lán)白斑）2、鑒定：長(zhǎng)度鑒定：酶切、PCR（五）測(cè)序第15頁(yè)/共74頁(yè)樣品的要求目標(biāo)基因序列（最好附原始測(cè)序報(bào)告）；克隆模板（包括：菌液、質(zhì)粒、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、從其他質(zhì)粒上酶切得到的DNA片段等）及檢測(cè)結(jié)果和背景資料；載體及其圖譜（常用載體可由我方免費(fèi)提供）；注明克隆要求，克隆使用的酶切位點(diǎn)。第16頁(yè)/共74頁(yè)服務(wù)流程載體構(gòu)建流程為：酶切、凝膠回收、連接、轉(zhuǎn)化、鑒定、測(cè)序。第17頁(yè)/共74頁(yè)完成時(shí)間2周內(nèi)完成。第18頁(yè)/共74頁(yè)最終產(chǎn)品構(gòu)建好的重組質(zhì)粒，不少于1μg；含有重組質(zhì)粒的菌株；電泳圖譜，測(cè)序圖譜，酶切圖。第19頁(yè)/共74頁(yè)

快速擴(kuò)增cDNA末端

—RACE第20頁(yè)/共74頁(yè)技術(shù)背景RACE的基本概念不同廠家RACE試劑盒的介紹RACE技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)存在的問(wèn)題及解決辦法最終產(chǎn)品的要求第21頁(yè)/共74頁(yè)技術(shù)背景得到某基因的片段、全長(zhǎng)或近全長(zhǎng)cDNA的方法：建立和篩選cDNA和DNA文庫(kù)。利用GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的表達(dá)序列標(biāo)簽(expresssequencetags,ESTs)拼接出全長(zhǎng)或近全長(zhǎng)cDNA。是多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)即PCR。cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù)。用RNase保護(hù)、S1核酸酶譜和引物延伸等方法來(lái)保證mRMA5′末端的獲取，但又需要大量的mRNA。第22頁(yè)/共74頁(yè)RACE的優(yōu)點(diǎn)此方法是通過(guò)PCR實(shí)現(xiàn)的，無(wú)需建立cDNA文庫(kù)，可以在很短的時(shí)間內(nèi)獲得有利用價(jià)值的信息；節(jié)約了實(shí)驗(yàn)所花費(fèi)的經(jīng)費(fèi)和時(shí)間；只要引物設(shè)計(jì)正確，在初級(jí)產(chǎn)物的基礎(chǔ)上可以獲得大量的感興趣基因的全長(zhǎng)；第23頁(yè)/共74頁(yè)RACE的基本概念cDNA末端快速擴(kuò)增(rapidamplificationofcDNAends,RACE)技術(shù)是基于PCR技術(shù)由已知的部分cDNA序列來(lái)獲得完整cDNA序列的一種方法，為Frohman在1985年首次報(bào)道。3’RACE和5’RACE第24頁(yè)/共74頁(yè)基本原理和方法利用Oligo(dT)對(duì)mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄的同時(shí)在兩頭加上通用接頭(引物)，從而可利用基因特異的引物(genespecificprimer，GSP)通過(guò)PCR反應(yīng)快速獲得目的序列的5′端和3′端。?T重復(fù)寡核苷酸只有胸腺嘧啶組成的核苷酸鏈第25頁(yè)/共74頁(yè)3’RACE原理示意圖第26頁(yè)/共74頁(yè)RACE產(chǎn)物的鑒定和全長(zhǎng)cDNA的獲得3′或5′雙鏈cDNA限制性內(nèi)切酶酶切克隆3′和5′重疊序列的連接RACE產(chǎn)物的3′和5′末端序列的分析合成相應(yīng)引物PCR獲得全長(zhǎng)cDNA第27頁(yè)/共74頁(yè)樣品種類樣品要求動(dòng)物、植物、微生物組織提取TotalRNA的材料要新鮮，請(qǐng)您采樣后立即存于液氮或-80℃后保存不超過(guò)一個(gè)星期，或加入防止RNA降解的樣品穩(wěn)定劑，。RNA如要提供RNA，要求總RNA＞50μg，濃度＞0.5μg/μl；mRNA＞100ng，濃度＞10ng/μl；OD260/OD280值：1.9至2.0，以我方電泳膠圖、紫外分析儀定量為準(zhǔn)。如果基因的含量較低或者未知序列較長(zhǎng)，樣品量需相應(yīng)增加。注意：a)建議由我方提取RNA；b)對(duì)于客戶提供的RNA，由于樣品原因可能沒(méi)有結(jié)果或結(jié)果不好，其損失和責(zé)任全部由樣品提供方承擔(dān)；c)由樣品質(zhì)量產(chǎn)生的任何問(wèn)題，其損失和責(zé)任應(yīng)全部由樣品提供方承擔(dān)。樣品要求第28頁(yè)/共74頁(yè)不同廠家RACE試劑盒的介紹clontechSMARTRACEInvitrogenGeneRacerTMKitBDSMARTTMRACE(SwitchingMechanismAt5'endoftheRNATranscript)第29頁(yè)/共74頁(yè)RACE技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)RACE技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有2個(gè)：1.3個(gè)連續(xù)的酶促反應(yīng)（逆轉(zhuǎn)錄、TdT加尾、PCR擴(kuò)增）

TdT加尾反應(yīng)是用脫氧核糖核酸末端轉(zhuǎn)移酶（TDT）催化，它可將dT依次加在寡核苷酸的3’端2.RACE的引物即使3個(gè)酶促反應(yīng)均平穩(wěn)順利進(jìn)行，但結(jié)果也通常會(huì)出現(xiàn)一些非特異性產(chǎn)物或非全長(zhǎng)的產(chǎn)物背景。第30頁(yè)/共74頁(yè)存在的問(wèn)題及解決辦法反轉(zhuǎn)錄RNA的質(zhì)量有高質(zhì)量的不被核糖核酸酶降解的RNA，RNA的完整性至關(guān)重要。一旦RNA降解就要重新提取，免得后期工作沒(méi)有結(jié)果既浪費(fèi)時(shí)間又浪費(fèi)試劑，給試驗(yàn)帶來(lái)麻煩。反轉(zhuǎn)錄提前終止

模板中有特殊的二級(jí)結(jié)構(gòu)，反轉(zhuǎn)錄提前終止。通過(guò)提高反轉(zhuǎn)錄的溫度，加大反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系以及反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中一直保持已變性的RNA模板處于50℃以上，避免以解開二級(jí)結(jié)構(gòu)的RNA再恢復(fù)原來(lái)的結(jié)構(gòu)，以達(dá)到5’末端。

第31頁(yè)/共74頁(yè)RACE引物的設(shè)計(jì)在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中總結(jié)如下經(jīng)驗(yàn)：引物不能設(shè)計(jì)在保守區(qū)簡(jiǎn)并引物區(qū)。各引物之間盡量不要重疊，由于引物的重疊，會(huì)引起很嚴(yán)重的引物多聯(lián)體現(xiàn)象，不能準(zhǔn)確地?cái)U(kuò)增。盡量多設(shè)計(jì)引物，以減少PCR擴(kuò)增的非特異性。也可以考慮在PCR鑒定陽(yáng)性克隆的時(shí)候另設(shè)計(jì)一對(duì)引物，便于鑒定的正確性。第32頁(yè)/共74頁(yè)P(yáng)CR擴(kuò)增及產(chǎn)物的克隆

PCR擴(kuò)增存在的問(wèn)題一方面可能未找到最佳擴(kuò)增條件而導(dǎo)致產(chǎn)生許多不確定的、不需要的產(chǎn)物，有時(shí)甚至沒(méi)有目的產(chǎn)物；另一方面，可能根本就沒(méi)有擴(kuò)增到任何產(chǎn)物。

增加PCR擴(kuò)增效率，提高擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性解決方法：熱啟動(dòng)PCR(hotstartPCR)，長(zhǎng)距離PCR(longdistancePCR)和降落PCR(touch－downPCR)以及加大反應(yīng)體系中Mg2+的濃度提高擴(kuò)增效率。單引物的線性擴(kuò)增問(wèn)題：堅(jiān)持做單引物對(duì)照，并減少引物的濃度。第33頁(yè)/共74頁(yè)AB

M12M34M56CA：ThefirstPCR；BC：NestPCRM：2000marker；1：5GSP11+NAP；2：NAP；3：5GSP332+AUAP；4,6：AUAP；5：5GSP333+AUAP圖多輪PCR擴(kuò)增的電泳結(jié)果Fig.ResultsofPCRamplified第34頁(yè)/共74頁(yè)圖5’RACE、3’RACE克隆的片段與GsAP2序列拼接的結(jié)果Fig.Thecontigresultof5’RACE、3’RACEandGsAP2bysoftware

第35頁(yè)/共74頁(yè)完成時(shí)間完成時(shí)間3-6周內(nèi)完成。對(duì)于有些RNA難以抽提的材料或樣品材料本身質(zhì)量問(wèn)題，時(shí)間較長(zhǎng)，會(huì)在1周內(nèi)和客戶協(xié)商約定時(shí)間。特殊樣品除外。第36頁(yè)/共74頁(yè)最終產(chǎn)品

擴(kuò)增全片段測(cè)序報(bào)告一份擴(kuò)增片段的電泳圖含未知末端片段的質(zhì)粒載體及細(xì)菌一份第37頁(yè)/共74頁(yè)RACE技術(shù)應(yīng)用RACE技術(shù)主要是應(yīng)用于對(duì)全長(zhǎng)cDNA序列的獲得，但對(duì)該技術(shù)進(jìn)行一定的修改后，也可在其它方面顯示出極高的應(yīng)用價(jià)值。RACE技術(shù)與生物信息學(xué),例如EST庫(kù)相結(jié)合,具有快速,高效克隆新基因的特點(diǎn),為快速釣取基因家族候選新成員提供新思路,如果一個(gè)基因是多基因家族的一個(gè)成員,用基因特異引物(GSP)可能同時(shí)擴(kuò)增幾個(gè)高度同源的Cdna.李紅等利用一條cDNA作為探針,通過(guò)BLASTN從GenBank中整合出了7條更長(zhǎng)的EST,通過(guò)設(shè)計(jì)引物,利用RACE擴(kuò)增,得到了7條新基因.相比單純尋找新基因的全長(zhǎng),此種方法的結(jié)合充分利用了信息巨大的基因資源庫(kù),得到了更多的信息,獲得新基因速度更快*效果更高,屬一種頗具規(guī)模化的方法,很有應(yīng)用前景。隨著RACE技術(shù)的不斷改進(jìn)和完善,優(yōu)化PCR擴(kuò)增的條件以提高擴(kuò)增的效率和忠實(shí)性，RACE技術(shù)必將在基因克隆以及基因家族和基因表達(dá)變化等研究中發(fā)揮極大的作用。第38頁(yè)/共74頁(yè)基因的表達(dá)GeneExpression第39頁(yè)/共74頁(yè)一．表達(dá)系統(tǒng)：基因工程中用來(lái)獲得有功能的異源蛋白質(zhì)的體系，包括克隆載體，表達(dá)載體及受體細(xì)胞。

第40頁(yè)/共74頁(yè)第41頁(yè)/共74頁(yè)據(jù)受體細(xì)胞的不同可分為：1．原核表達(dá)系統(tǒng)：將外源基因引入原核細(xì)胞，并使其在原核細(xì)胞中以發(fā)酵形式快速高效地表達(dá)、合成基因產(chǎn)物的體系。2．真核表達(dá)系統(tǒng)：使外源基因在真核細(xì)胞中表達(dá)的體系。第42頁(yè)/共74頁(yè)二．原核生物基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)特點(diǎn)第43頁(yè)/共74頁(yè)原核生物染色體DNA是裸露的環(huán)形DNA，其轉(zhuǎn)錄和翻譯是偶聯(lián)的連續(xù)進(jìn)行。原核生物形成多順?lè)醋觤RNA：mRNA在合成過(guò)程中和多個(gè)核糖體結(jié)合，翻譯形成多條肽鏈。

第44頁(yè)/共74頁(yè)3、一般不含內(nèi)含子（intron），沒(méi)有轉(zhuǎn)錄及翻譯后加工系統(tǒng)

4、原核生物中功能相關(guān)的基因串聯(lián)在一起，形成操縱子。第45頁(yè)/共74頁(yè)五．原核表達(dá)載體：

適用于在原核細(xì)胞中表達(dá)外源基因的載體。主要元件：強(qiáng)啟動(dòng)子

SD順序篩選標(biāo)志其它調(diào)控基因

第46頁(yè)/共74頁(yè)技術(shù)關(guān)鍵：克隆基因插入原核序列3’端而維持正確閱讀框架。選擇合適酶切位點(diǎn)加人工合成的DNA接頭構(gòu)建位相載體第47頁(yè)/共74頁(yè)優(yōu)點(diǎn)：表達(dá)效率高產(chǎn)物穩(wěn)定

易鑒定：融合蛋白分子量大，電泳可鑒定易純化：利用融合原核多肽的特性第48頁(yè)/共74頁(yè)P(yáng)tac：IPTG誘導(dǎo)GST融合蛋白—直接純化產(chǎn)物切割方便：

pGEX-1T—凝血酶

pGEX-2T凝血酶

pGEX-3TX因子位相載體融合型載體pGEX系列第49頁(yè)/共74頁(yè)服務(wù)概述目前本實(shí)驗(yàn)室主要采用原核表達(dá)體系為pET載體系列與pGEX載體系列，表達(dá)菌株為BL21(DE3)系列菌株和Rosseta系列菌株，如有特殊需要，我們還單獨(dú)可以提供特殊菌株與載體。第50頁(yè)/共74頁(yè)樣品要求待測(cè)基因序列信息；基因片段；待測(cè)組織材料或RNA；待表達(dá)基因已嘗試表達(dá)的方法與結(jié)果；表達(dá)基因的特殊要求（帶何種標(biāo)簽及標(biāo)簽的位置）；純化方式；最終表達(dá)量等。第51頁(yè)/共74頁(yè)服務(wù)流程 1、客戶提供的基因片段。2、構(gòu)建重組載體質(zhì)粒：把目的基因片段與相同酶切后的表達(dá)載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌克隆菌株感受態(tài)細(xì)胞，篩選轉(zhuǎn)化子，測(cè)序鑒定。3、把重組載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)或Rosseta系列表達(dá)菌株中，篩選轉(zhuǎn)化子。4、重組表達(dá)質(zhì)粒在表達(dá)菌株中的誘導(dǎo)表達(dá)。5、表達(dá)產(chǎn)物的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）分析。6、表達(dá)產(chǎn)物的純化（按照柱材說(shuō)明書操作）。7、純化產(chǎn)物免疫學(xué)活性的鑒定（ELISA或WESTERNBLOTTING檢測(cè)）第52頁(yè)/共74頁(yè)完成時(shí)間1~2月。第53頁(yè)/共74頁(yè)最終產(chǎn)品完整實(shí)驗(yàn)報(bào)告含有目的基因的表達(dá)載體質(zhì)粒以及對(duì)應(yīng)的菌株。純化的目的蛋白第54頁(yè)/共74頁(yè)八、原核表達(dá)系統(tǒng)的缺點(diǎn)1、沒(méi)有轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)，不能識(shí)別、剪除內(nèi)含子2、缺乏翻譯后加工系統(tǒng)，不能對(duì)翻譯的蛋白質(zhì)進(jìn)一步修飾加工第55頁(yè)/共74頁(yè)真核表達(dá)系統(tǒng)的必要性及優(yōu)勢(shì)1.

具轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)2.

具翻譯后修飾系統(tǒng)3.

可實(shí)現(xiàn)真正的分泌表達(dá)4.基因治療第56頁(yè)/共74頁(yè)真核基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)調(diào)控特點(diǎn)（一）真核基因組的復(fù)雜性真核基因組龐大，具大量非編碼序列mRNA豐度不同結(jié)構(gòu)復(fù)雜：染色質(zhì)、核膜、線粒體表達(dá)調(diào)控多樣不連續(xù)性：內(nèi)含子、外顯子沒(méi)有操縱子結(jié)構(gòu)

第57頁(yè)/共74頁(yè)(二）真核表達(dá)系統(tǒng)組成：真核表達(dá)載體受體細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移方式第58頁(yè)/共74頁(yè)據(jù)受體細(xì)胞及表達(dá)載體的不同分為3種：酵母表達(dá)系統(tǒng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)第59頁(yè)/共74頁(yè)（三）轉(zhuǎn)化1、原生質(zhì)體法：去除厚壁2、電穿孔法：效率較高第60頁(yè)/共74頁(yè)（四）外源基因的表達(dá)1、胞內(nèi)表達(dá)2、分泌表達(dá)：在MCS前加入信號(hào)肽序列第61頁(yè)/共74頁(yè)（五）缺點(diǎn)不能實(shí)現(xiàn)全部的翻譯后修飾功能第62頁(yè)/共74頁(yè)酵母真核表達(dá)目前本實(shí)驗(yàn)室主要采用酵母表達(dá)體系的載體為pPIC9k與pPIC3.5k，表達(dá)菌株為畢赤酵母GS115與KM71，如有特殊需要，我們還單獨(dú)可以提供特殊菌株與載體。樣品要求，以及實(shí)驗(yàn)報(bào)告同原核表達(dá)。第63頁(yè)/共74頁(yè)哺乳細(xì)胞真核表達(dá)1

隨著愈來(lái)愈多的治療疾病的藥物蛋白質(zhì)被發(fā)現(xiàn)，高純度活性蛋白的獲得具有更大的意義。2通過(guò)各種真核表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)外源蛋白是目前研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域，也是今后蛋白質(zhì)工程技術(shù)一個(gè)重要的研究方向。3它不僅可以表達(dá)克隆的cDNA，而且還可以表達(dá)真核基因組DNA，表達(dá)的蛋白質(zhì)可以被適當(dāng)?shù)匦揎?糖基化等)。第64頁(yè)/共74頁(yè)樣品要求1.目的基因序列信息2.基因片段—亞克隆模板（包括：菌液、質(zhì)粒、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、從其他質(zhì)粒上酶切得到的DNA片段等）及檢測(cè)結(jié)果和背景資料；3.待表達(dá)基因的特殊要求（帶何種標(biāo)簽及標(biāo)簽的位置）4.純化方式；5.最終表達(dá)量等。第65頁(yè)/共74頁(yè)服務(wù)流程

哺乳動(dòng)物細(xì)胞的瞬時(shí)表達(dá)：

1、獲得含合適限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的目的基因片段：合成基因或者客戶提供(cDNA、基因