金華市淡色庫蚊對(duì)殺蟲劑的抗性基因提取分析,昆蟲學(xué)論文

PAGEPAGE6金華市淡色庫蚊對(duì)殺蟲劑的抗性基因提取分析,昆蟲學(xué)論文為探究導(dǎo)致金華市淡色庫蚊抗性變化的分子機(jī)制,利用PCR技術(shù)對(duì)金華市淡色庫蚊相關(guān)抗性基因進(jìn)行檢測.本研究綜合已報(bào)道淡色庫蚊抗性基因文獻(xiàn)和序列等信息,利用生物信息學(xué)手段,設(shè)計(jì)合適抗性基因引物,并利用該引物獲得高質(zhì)量的目的基因片段.共對(duì)乙酰膽堿酯酶(ace1),P450超家族(cyp6f1),非特異性酯酶(Est-2),鈉離子通道(vssc),糖原分支酶(NYD-GBE),肌球蛋白(NYD-MLC2)等6類基因進(jìn)行了PCR擴(kuò)增.1材料與方式方法1.1供試?yán)ハx淡色庫蚊金華現(xiàn)場品系1.2試劑UniversalGenomicDNAExtractionKitVer.3.0(大連TaKaRa公司,生產(chǎn)批號(hào):CA1201)、DNAMarkerDL2000(大連TaKaRa公司,生產(chǎn)批號(hào):B2701A)、ExTaqDNA聚合酶(大連TaKaRa公司,生產(chǎn)批號(hào):CKA270113).1.3儀器梯度PCR儀(美國Bio-rad公司,型號(hào)PTC-1148),低溫高速離心機(jī)(美國ThermoMicro公司,型號(hào)17R),電泳儀(美國Bio-rad公司,型號(hào)PowrPacBasic)等.1.4引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)已報(bào)道文獻(xiàn)以及抗藥性相關(guān)基因序列[1-4],采用VerctorNTI進(jìn)行序列比對(duì),選取保守序列區(qū)進(jìn)行引物設(shè)計(jì),擴(kuò)增片段應(yīng)基本涵蓋已報(bào)道的常見基因突變點(diǎn),引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成(表1).1.5方式方法1.5.1模板提取現(xiàn)場品系以及敏感品系第1代、第2代4齡幼蟲各取20只,分別勻漿混勻,按Univer-salGenomicDNAExtractionKit方式方法提取DNA.總DNA提取后,進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳做定性鑒定,保存于-70℃冰箱備用.1.5.2PCR反響體系10PCR緩沖液(含Mg2+)2l,dNTPs(2.5mmol/L)0.4l,TaqDNA聚合酶(5U/l)0.25l,引物(20mol/L)各1l,模板DNA2l,雙蒸水補(bǔ)足至20l.1.5.3反響程序94℃5min;94℃0.5min;50℃~60℃0.5min(不同引物進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整),72℃1min,35個(gè)循環(huán);72℃5min.1.5.4PCR產(chǎn)物的檢測1%瓊脂糖凝膠電泳,紫外觀察擴(kuò)增結(jié)果.1.5.5測序PCR產(chǎn)物序列測定由上海生工、大連寶生物公司完成.測得序列,利用軟件Chromas對(duì)照相應(yīng)峰圖進(jìn)行校對(duì).校對(duì)后新序列上傳Genbank數(shù)據(jù)庫,Accessionnumbers:HQ540599,HQ540604,HQ540609,HQ540622,HQ540627,HQ540632.2結(jié)果2.1PCR擴(kuò)增利用本課題設(shè)計(jì)的引物,經(jīng)PCR擴(kuò)增條件優(yōu)化,均擴(kuò)增到特異目的片段,見圖1.擴(kuò)增片段豐度高,且無非特異性雜帶和拖尾現(xiàn)象,可用于測序分析.2.2抗性相關(guān)基因序列分析金華現(xiàn)場品系與敏感品系抗性相關(guān)基因序列利用Vector序列分析軟件進(jìn)行比對(duì)分析.華而不實(shí)vssc基因序列差異較大,序列類似度僅有84.1%,但差異序列主要集中在內(nèi)含子區(qū),外顯子序列完全一樣;非特異性酯酶Est-2基因現(xiàn)場品系與敏感品系存在4個(gè)核苷酸的差異;ace1基因序列現(xiàn)場品系與敏感品系存在2個(gè)核苷酸的差異;P450超家族cyp6f1基因序列現(xiàn)場品系與敏感品系存在1個(gè)核苷酸的差異;NYD-GBE、NYD-MLC2基因序列現(xiàn)場品系與敏感品系無差異,類似度為100%.見圖2.2.3氨基酸序列分析為了進(jìn)一步了解抗性相關(guān)基因序列點(diǎn)突變對(duì)金華淡色庫蚊現(xiàn)場品系抗性表型的影響,我們利用軟件VerctorNTI軟件將發(fā)生點(diǎn)突變的序列翻譯成氨基酸序列,進(jìn)行比對(duì).結(jié)果顯示,ace1基因、cyp6f1基因、Est-2基因的點(diǎn)突變均為無意突變,不會(huì)導(dǎo)致氨基酸序列變化.3討論高質(zhì)量的基因片段的克隆是獲得好的序列分析結(jié)果的基礎(chǔ)和重要前提.用于序列測定的PCR產(chǎn)物一般要求特異度高,不能存在非特異性擴(kuò)增片段或拖尾現(xiàn)象等.另外,目的片段產(chǎn)量要高,以提高信噪比或提高克隆測序時(shí)的轉(zhuǎn)化成功率.國內(nèi)外關(guān)于庫蚊抗性基因擴(kuò)增的文獻(xiàn)報(bào)道固然較多,但檢測方式方法較為混亂[5-8],所以很難直接用于本課題研究.因而本課題在已有文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上,利用生物信息學(xué)技術(shù),對(duì)相關(guān)抗性基因擴(kuò)增方式方法進(jìn)行了改進(jìn)或新建.本研究在設(shè)計(jì)經(jīng)過中首先通過Genbank下載相應(yīng)的抗性基因序列.利用序列分析軟件Vector對(duì)下載的基因序列進(jìn)行比對(duì).通過比對(duì),發(fā)現(xiàn)目的基因片段區(qū)的保守序列,并在該保守序列區(qū)檢索適于作為引物的序列,進(jìn)行引物設(shè)計(jì).引物設(shè)計(jì)完成后,利用NCBI的BLAST功能在Genbank庫內(nèi)對(duì)相近進(jìn)行檢索,檢查其特異性.如發(fā)現(xiàn)設(shè)計(jì)引物與其他基因片段在3段一樣堿基6個(gè),即舍棄重新設(shè)計(jì).后經(jīng)試驗(yàn)證明,本研究所用引物均具有較好的特異性.本次用于抗性基因監(jiān)測的蚊種群主要來自于主城區(qū).抗性表型測試顯示[9],金華市淡色庫蚊主城區(qū)品系對(duì)常見殺蟲劑的抗性水平,除了氯菊酯,基本接近敏感品系.該結(jié)果與抗性基因測序結(jié)果相一致.本研究中檢測的6個(gè)基因片段中,金華市淡色庫蚊現(xiàn)場品系與敏感品系的氨基酸序列完全一樣.金華市淡色庫蚊主城區(qū)品系氯菊酯抗性水平明顯高于敏感品系.在本研究中抗性基因測序結(jié)果無法解釋其抗性產(chǎn)生原因,可能已檢測的基因片段未覆蓋突變位點(diǎn),或存在其他未知抗性機(jī)制.金華市淡色庫蚊主城區(qū)品系氯菊酯抗性產(chǎn)生機(jī)制,還有待進(jìn)一步研究.以下為以下為以下為以下為參考文獻(xiàn)[1]丁矛.昆蟲抗藥性相關(guān)基因芯片的研制及其應(yīng)用[D].杭州:浙江大學(xué)昆蟲科學(xué)研究所,2006.[2]公茂慶,劉波,胡小邦,等.淡色庫蚊Cyp6f1基因的克隆及表示出差異的鑒定[J].中華衛(wèi)生殺蟲藥械,2008,14(2):100-104.[3]孫靜,錢瑾,孫立新,等.淡色庫蚊抗性相關(guān)基因Nyd-Gbe基因的克隆與分析[J].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2006,26(7):477-480.[4]錢瑾,孫靜,孫立新,等.淡色庫蚊抗藥性相關(guān)基因Nyd-Mlc2基因的克隆與分析[J].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2006,26(7):473-476.[5]TomaL,MenegonM,RomiR,etal.StatusofinsecticideresistanceinCulexpipiensfieldpopulationsfromnorth-easternareasofItalybeforethewithdrawalofOPcompounds[J].PestManagSci,2018,67(1):100-106.[6]ChenL,ZhongD,ZhangD,etal.MolecularecologyofpyrethroidknockdownresistanceinCulexpipienspallensmosquitoes[J].PLoSOne,2018,5(7):11681.[7]TantelyML,TortosaP,AloutH,etal.InsecticideresistanceinCu-lexpipiensquinquefasciatusandAedesalbopictusmosquitoesfromLaReunionIsland[J].InsectBiochemMolBiol,2018,40(4):317-24.[8]MatamboTS,PaineMJ,CoetzeeM,etal.SequencecharacterizationofcytochromeP450CYP6P9inpyrethro