免疫教程二基因工程

免疫教程二基因工程第1頁/共66頁免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig)抗體(antibody)分泌型Ig(secretedIg,SIg)膜型Ig(membraneIg,mIg)德國細(xì)菌學(xué)家Behring日本學(xué)者Kitasato抗毒素、免疫血清療法首屆生理學(xué)和醫(yī)學(xué)諾貝爾獎一、基本概念

牛牛文庫文檔分享第2頁/共66頁人工制備的抗體

多克隆抗體

(polyclonalantibody)

單克隆抗體

(monoclonalantibody)

基因工程抗體

(geneticengineeringantibody)Milstein、Kohler、Jerne單克隆抗體制備技術(shù)1984年獲諾貝爾獎

牛牛文庫文檔分享第3頁/共66頁

(一)基本結(jié)構(gòu)：Ig單體由兩條重鏈和兩條輕鏈經(jīng)二硫鍵連接而成。

二、免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)Edelman與Porter解析Ig結(jié)構(gòu)1972年獲諾貝爾獎(k或)

牛牛文庫文檔分享第4頁/共66頁(m鏈)(g鏈)(e鏈)(a鏈)(d鏈)

牛牛文庫文檔分享第5頁/共66頁

Ig的可變區(qū)和恒定區(qū)

重鏈可變區(qū)

(variableregionofheavychain,

VH)

輕鏈可變區(qū)

(variableregionoflightchain,

VL)可變區(qū)(variableregion,V)

牛牛文庫文檔分享第6頁/共66頁重鏈恒定區(qū)(constantregionofheavychain,

CH)功能區(qū):CH1~3(IgG、IgA、IgD)CH1~4(IgM、IgE)輕鏈恒定區(qū)(constantregionoflightchain,

CL)恒定區(qū)(constantregion,C)

牛牛文庫文檔分享第7頁/共66頁VH免疫球蛋白V區(qū)和C區(qū)結(jié)構(gòu)示意圖

牛牛文庫文檔分享第8頁/共66頁高變區(qū)(hypervariableregion,

HVR)又稱互補(bǔ)決定區(qū)(complementarity-determiningregion,

CDR)

VH和VL各有3個CDR(CDR1~3),共同組成

Ig的抗原結(jié)合部位。骨架區(qū)(frameworkregion,FR)VH和VL各有4個FR(FR1~4)

牛牛文庫文檔分享第9頁/共66頁免疫球蛋白CDR和FR結(jié)構(gòu)示意圖

牛牛文庫文檔分享第10頁/共66頁(二)Ig的水解片段1.木瓜酶水解Ig

2個相同的抗原結(jié)合片段

(fragmentofantigen-binding,

Fab)

1個可結(jié)晶片段

(fragment

crystallizable,

Fc)2.胃蛋白酶水解Ig

1個F(ab’)2

和1個pFc’

牛牛文庫文檔分享第11頁/共66頁

牛牛文庫文檔分享第12頁/共66頁(三)功能區(qū)或結(jié)構(gòu)域(domain)

免疫球蛋白超家族

(immunoglobulinsuperfamily,IgSF)

牛牛文庫文檔分享第13頁/共66頁

胚系Ig基因在基因組中以基因簇(geneclusters)的形式存在。重鏈基因簇(IGH)：含V,D,J,C基因片段

IGHV,IGHD,IGHJ,IGHCk輕鏈基因簇(IGK)：含V,J,C基因片段

IGKV,IGKJ,IGKC輕鏈基因簇(IGL)：含V,J,C基因片段

IGLV,IGLJ,IGLC三、免疫球蛋白的基因

牛牛文庫文檔分享第14頁/共66頁

人Ig基因片段基因片段Ig基因VDJC

IGH95(50)239(6)11(9)IGK90(60)051IGL60(30)077(4)Tonegawa1987年獲諾貝爾獎

牛牛文庫文檔分享第15頁/共66頁

牛牛文庫文檔分享第16頁/共66頁重排序列信號（RSS）rearrangementsingnalsequance

牛牛文庫文檔分享第17頁/共66頁Ig基因重排和表達(dá)等位基因排斥(Allelicexclusion)——

一旦VH-DH-JH重排成功，并且得到功能性表達(dá)，會抑制另一條同源染色體上等位基因的重排。同型排斥(isotypeexclusion)——Vκ或Vλ基因只有一個能重排、表達(dá)，Vκ基因首先重排并抑制Vλ基因的重排;只有當(dāng)Vκ基因重排不成功,Vλ基因才能進(jìn)行重排。

牛牛文庫文檔分享第18頁/共66頁轉(zhuǎn)換區(qū)switchregion

牛牛文庫文檔分享第19頁/共66頁基因工程抗體

(geneticengineeringantibody)

牛牛文庫文檔分享第20頁/共66頁抗體藥物銷售趨勢圖

牛牛文庫文檔分享第21頁/共66頁一、鼠單抗人源化

人源化抗體(humanizedantibody)

免疫原性降低，對各種水解酶的抵抗力增強(qiáng)；可根據(jù)需要使抗體連接用于治療或診斷的相應(yīng)物質(zhì)，以增強(qiáng)基因工程抗體的治療效果或提高診斷的敏感性。

牛牛文庫文檔分享第22頁/共66頁

用人抗體的恒定區(qū)取代鼠單抗的恒定區(qū)，使鼠單抗恒定區(qū)人源化，但保留鼠單抗的可變區(qū)。(一)人-鼠嵌合抗體

(human-mousechimericantibody)

牛牛文庫文檔分享第23頁/共66頁Fab和F(ab’)2嵌合抗體：將鼠的功能性抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)基因分別與人抗體的鏈和重鏈CH1恒定區(qū)基因重組，克隆到表達(dá)載體中。主要通過哺乳類細(xì)胞表達(dá)，最常用的是小鼠骨髓瘤細(xì)胞系和CHO細(xì)胞。

牛牛文庫文檔分享第24頁/共66頁

最大限度地減少鼠單抗的異源性，又能使人單抗獲得鼠單抗的特異性。(二)CDR移植抗體(CDR-graftedantibody)

人改型抗體(humanreshapedantibody)

牛牛文庫文檔分享第25頁/共66頁二、單價小分子抗體優(yōu)點(diǎn)：①分子量小而穿透力強(qiáng)；②不含F(xiàn)c段，可減少副作用；③能夠在大腸桿菌等原核細(xì)胞中表達(dá)，降低生產(chǎn)成本；④在體內(nèi)半衰期較短，廓清快；⑤基因操作較容易，可進(jìn)一步經(jīng)過改造，制備其他類型的基因工程抗體。

牛牛文庫文檔分享第26頁/共66頁

由重鏈Fd段和完整的輕鏈通過一個鏈間二硫鍵連接形成的異二聚體，只有一個抗原結(jié)合部位。(一)FabFab

牛牛文庫文檔分享第27頁/共66頁(二)Fv和ScFv(single-chainFv)

Fv段由VH和VL籍非共價鍵結(jié)合，是抗體分子中保留抗原結(jié)合部位的最小功能片段，其穩(wěn)定性差。FvScFv

牛牛文庫文檔分享第28頁/共66頁ScFv：

VH-linker-VL或VL-linker-VHLinker一般含有14～15個氨基酸殘基，應(yīng)用最廣的是含有重復(fù)出現(xiàn)的4個甘氨酸和一個絲氨酸的(Gly4Ser)3優(yōu)點(diǎn)：①比Fv穩(wěn)定；②保持單價結(jié)合抗原的親和力；③分子量小，組織穿透性較強(qiáng)。

牛牛文庫文檔分享第29頁/共66頁(三)單區(qū)抗體(singledomainantibody)及

最小識別單位(minimalrecognitionunit，MRU)

單區(qū)抗體是抗體分子中單獨(dú)具有結(jié)合抗原能力的重鏈可變區(qū)(VH)，MRU是來自CDR的短肽，可模擬親本抗體的抗原結(jié)合活性

FvScFv單區(qū)抗體

牛牛文庫文檔分享第30頁/共66頁單區(qū)抗體的優(yōu)越性：①穿透力強(qiáng)，有利于實(shí)際應(yīng)用；②不需將VH和VL基因分別克隆和進(jìn)行正確配對，制備時操作簡便；③只有VH而不需與VL相互作用，穩(wěn)定性較

Fv和ScFv更好；④其抗原結(jié)合部位的構(gòu)象較為特殊，VH抗體CDR襻插入抗原表面的凹陷中，這對于制備酶抑制性抗體有重要意義。

牛牛文庫文檔分享第31頁/共66頁MRU的優(yōu)越性：穿透能力強(qiáng)，半壽期短，顯像時本底低，適用于臨床顯像診斷。

牛牛文庫文檔分享第32頁/共66頁三、雙價和多價小分子抗體(一)化學(xué)交聯(lián)法

DTNB、O-PDM使2個ScFv在體外相連接，形成雙價小分子抗體。易引起抗體分子的抗原結(jié)合部位的結(jié)構(gòu)改變，降低抗體的活性。

牛牛文庫文檔分享第33頁/共66頁(二)二聚化結(jié)構(gòu)域融合法在單價小分子抗體的3’端連接具有二聚化傾向的結(jié)構(gòu)域(dimerizationdomain)

亮氨酸拉鏈(leucinezipper)a螺旋束(helixbundle)Ig的CH3區(qū)鏈親和素

牛牛文庫文檔分享第34頁/共66頁(三)接頭長度控制法

雙鏈抗體(diabody)

將ScFv的接頭縮短，使兩個ScFv分子間的VH和VL配對，發(fā)生非共價鍵結(jié)合，形成雙價小分子抗體。構(gòu)建時操作簡單，具有良好的性能和應(yīng)用前景。三鏈抗體(triabody)

四鏈抗體(tetrabody)

牛牛文庫文檔分享第35頁/共66頁雙鏈抗體三鏈抗體四鏈抗體

牛牛文庫文檔分享第36頁/共66頁四、雙特異性抗體

(bispecificantibody,BsAb)

(一)化學(xué)偶聯(lián)方法

SPDP、DTNB、O-PDM等化學(xué)交聯(lián)劑可將兩個不同抗原特異性的全抗體分子或其功能性片段連接成BsAb。

牛牛文庫文檔分享第37頁/共66頁化學(xué)偶聯(lián)方法：?簡便快速，產(chǎn)物容易純化

?易造成抗體分子的抗原結(jié)合部位發(fā)生改變，從而降低其活性

?交聯(lián)劑的致畸和致癌作用

?主要用于體外的實(shí)驗(yàn)研究。

牛牛文庫文檔分享第38頁/共66頁(二)雜交-雜交瘤方法

(hybrid-hybridoma)四源雜交瘤(quadroma)：使兩株各自分泌不同特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞再融合三源雜交瘤(trioma)：用一株雜交瘤細(xì)胞與免疫后的脾細(xì)胞融合

牛牛文庫文檔分享第39頁/共66頁①由于兩套重鏈和輕鏈之間可重新隨機(jī)組合，而目的BsAb僅占20％左右，所以必須從大量相似的Ig中費(fèi)時費(fèi)力地篩選出目的BsAb；②多倍體雜交瘤的穩(wěn)定性差，必須經(jīng)常對雜交瘤進(jìn)行克??；③分泌抗體的量少，且活性低，增加純化難度；④人源雜交瘤技術(shù)存在諸多問題，鼠源性BsAb用于人體會出現(xiàn)HAMA，故應(yīng)用受到限制。雜交-雜交瘤方法的主要缺點(diǎn)：

牛牛文庫文檔分享第40頁/共66頁(三)基因工程方法

主要是以Fab、Fv和ScFv等抗體分子片斷為基本構(gòu)件，用基因工程方法制備BsAb。

1.末端半胱氨酸殘基(Cys)共價交聯(lián)在兩種不同ScFv或帶鉸鏈區(qū)的Fab段的羧基端分別接上半胱氨酸殘基(SerCys或Gly4Cys)

牛牛文庫文檔分享第41頁/共66頁2.鏈間連接肽相連

單鏈雙特異性抗體

(single-chainbispecificantibody,scBsAb)

在DNA水平用一個柔性較強(qiáng)、長度合適的肽段將兩個ScFv首尾相接，常用的是Gly4Ser，而長肽鏈可用(Gly4Ser)3，形成雙ScFv的單肽鏈，經(jīng)過正確折疊成為BsAb。

牛牛文庫文檔分享第42頁/共66頁3.二聚化結(jié)構(gòu)域融合法

牛牛文庫文檔分享第43頁/共66頁4.構(gòu)建雙特異性雙鏈抗體

(bispecificdiabody)

將抗體A的VH和抗體B的VL用一短的接頭連接成一條雜合ScFv，同理將抗體A的VL和抗體B的VH連接成另一條雜合ScFv，構(gòu)建含有這兩條鏈的雙順反子表達(dá)載體，當(dāng)兩者同時表達(dá)時，由于短接頭的限制，使兩個不同特異性抗體的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)交叉組合。BAAB

牛牛文庫文檔分享第44頁/共66頁五、抗體融合蛋白(一)含F(xiàn)v段的抗體融合蛋白

1.免疫靶向性抗體融合蛋白

將毒素、酶、細(xì)胞因子等生物活性蛋白與含F(xiàn)v段的針對腫瘤的抗體片段融合，應(yīng)用于靶向治療惡性腫瘤。

牛牛文庫文檔分享第45頁/共66頁⑴重組免疫毒素(immunotoxin)

抗體分子與毒性蛋白的偶聯(lián)物

常用毒素：①細(xì)菌來源的毒素假單胞菌外毒素和白喉毒素②植物來源的毒素蓖麻毒素、肥皂草素及商陸抗病毒蛋白

牛牛文庫文檔分享第46頁/共66頁

毒素的細(xì)胞毒性作用使得所構(gòu)建的免疫毒素不能在真核細(xì)胞表達(dá)，而用大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)制備。植物毒素難于在原核細(xì)胞中表達(dá)，故很少用來構(gòu)建抗體融合蛋白，而多采用化學(xué)交聯(lián)的方法制備抗體與毒素的偶聯(lián)物。毒素都是異源蛋白，具有免疫原性，進(jìn)入人體后可誘導(dǎo)產(chǎn)生人抗異源毒素的抗體(humananti-toxinantibody,HATA)。

牛牛文庫文檔分享第47頁/共66頁⑵免疫細(xì)胞因子(immunocytokine)

用含F(xiàn)v的針對腫瘤的抗體片段與細(xì)胞因子融合，靶向治療腫瘤，降低毒副作用。較常見的有抗體-IL-2、抗體-IL-12、抗體-GM-CSF、抗體-TNF-a等。

牛牛文庫文檔分享第48頁/共66頁⑶抗體-酶融合蛋白①抗體導(dǎo)向的酶-前藥治療(antibody-directedenzymeprodrugtherapy,ADEPT)②抗體-核酸酶融合蛋白③抗體-溶栓劑融合蛋白

牛牛文庫文檔分享第49頁/共66頁2.免疫橋連性抗體融合蛋白由一個抗體分子與另一個具有特異靶向作用的分子構(gòu)建成融合蛋白，可同時結(jié)合效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞，使兩種不同細(xì)胞發(fā)生橋連。抗CD3-EGF

牛牛文庫文檔分享第50頁/共66頁(二)含F(xiàn)c段的抗體融合蛋白

免疫粘附素(immunoadhesin)：用抗體Fc段與細(xì)胞表面某些具有特異識別及結(jié)合功能的蛋白分子構(gòu)建的融合蛋白。①通過受體與配體間相互作用產(chǎn)生效應(yīng)②發(fā)揮Fc段的免疫功能：調(diào)理吞噬作用

ADCC效應(yīng)激活補(bǔ)體與蛋白A或抗Ig結(jié)合，利于純化和檢測延長融合蛋白的半壽期(如CD4-Fc融合蛋白)

牛牛文庫文檔分享第51頁/共66頁六、抗原化抗體

將特定抗原分子表位的編碼基因序列插入抗體重鏈可變區(qū)的CDR3部位，表達(dá)出具有該抗原表位的氨基酸組成和構(gòu)象以及免疫原性的重組抗體。應(yīng)用：①干擾或阻斷作用②制備新型疫苗

牛牛文庫文檔分享第52頁/共66頁七、細(xì)胞內(nèi)抗體(intrabody)◆將攜帶小分子抗體基因的表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)特定部位表達(dá)的抗體分子，結(jié)合細(xì)胞內(nèi)的靶抗原后能影響靶抗原的生物學(xué)活性?！魹榱诉_(dá)到不同的目的效應(yīng)，可以對小分子抗體基因進(jìn)行修飾，使其表達(dá)于細(xì)胞的不同部位，當(dāng)抗體與不同部位中的靶分子結(jié)合后，可以產(chǎn)生不同的效應(yīng)。

牛牛文庫文檔分享第53頁/共66頁應(yīng)用前景：①分子功能的研究

IL-2Ra

，erbB2②基因治療

?抗腫瘤基因治療

?抗艾滋病的基因治療針對HIV外殼蛋白gpl20、調(diào)節(jié)蛋白Tat

和Rev、逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶

?存在的問題

牛牛文庫文檔分享第54頁/共66頁

依賴于PCR技術(shù)、抗體分子在大腸桿菌的功能性表達(dá)以及噬菌體展示技術(shù)(phagedisplaytechnology)而發(fā)展起來的抗體工程技術(shù)。

抗體庫技術(shù)：

牛牛文庫文檔分享第55頁/共66頁一、噬菌體抗體庫技術(shù)(一)絲狀噬菌體(Filamentousphage)

纖絲狀病毒顆?；蚪M是單鏈環(huán)狀DNA

復(fù)制型DNA是病毒基因組DNA增殖的中間體，可被用作基因克隆的載體基因組共編碼10種蛋白外源蛋白的基因與基因Ⅷ或基因Ⅲ融合

表達(dá)在噬菌體表面

牛牛文庫文檔分享第56頁/共66頁(二)噬菌體展示技術(shù)

將蛋白分子或肽段的基因克隆到絲狀噬菌體的基因組DNA中，與噬菌體的外殼蛋白形成融合蛋白，在噬菌體的表面表達(dá)，使特定分子的基因型和表型統(tǒng)一在同一病毒顆粒內(nèi)，通過篩選噬菌體表面的能結(jié)合特定配體的蛋白，即可獲得相應(yīng)的編碼基因。

牛牛文庫文檔分