細(xì)胞工程制藥技術(shù)

關(guān)于細(xì)胞工程制藥技術(shù)第一頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三第一節(jié)概述細(xì)胞工程動植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞融合技術(shù)細(xì)胞器移植技術(shù)和細(xì)胞重組技術(shù)體外受精技術(shù)染色體工程技術(shù)DNA重組技術(shù)第二頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三第二節(jié)細(xì)胞融合技術(shù)第三頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三（一）細(xì)胞融合（cellfusion)，又稱體細(xì)胞雜交（somatichybridiazation），是指兩個(gè)或更多個(gè)相同或不同細(xì)胞通過膜融合形成單個(gè)細(xì)胞的過程。一、細(xì)胞融合技術(shù)的建立和發(fā)展第四頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三Muller于1838年觀察到脊椎動的腫瘤細(xì)胞能在體內(nèi)自發(fā)地融合產(chǎn)生多核的腫瘤細(xì)胞。Virchow于1858年描述了正常組織、發(fā)炎組織以及腫瘤組織中的多核細(xì)胞現(xiàn)象。Luginbuhl于1873年觀察到天花病人的血液中也有多核的血細(xì)胞存在。Lange于1875年第一個(gè)觀察到脊椎動物（蛙類）的血液細(xì)胞發(fā)生融合的過程。Cienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在無脊椎動中發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞合并現(xiàn)象。1958年日本學(xué)者岡田（Okada）發(fā)現(xiàn)仙臺病毒具有觸發(fā)動物細(xì)胞融合的效應(yīng)。1974年華裔加拿大學(xué)者高國楠創(chuàng)立了聚乙二醇（PEG）化學(xué)融合法。1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞而產(chǎn)生能分泌預(yù)定單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。20世紀(jì)80年代出現(xiàn)了電融合技術(shù)。（二）細(xì)胞融合研究進(jìn)展第五頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三生物種類細(xì)胞來源成功年代煙草兩個(gè)種間苷藍(lán)——青菜大豆——馬唐草矮牽?！埫婊ù篼湣ㄉ篼湣蠖剐←湣珷颗Ｓ筒恕蠖褂衩住蠖勾蠖埂巴愣勾篼湣Q豆大豆——草香木犀酵母菌——雞大豆——煙草大豆——秋水仙人——胡蘿卜番茄——馬鈴薯人——小鼠葉——葉葉——根愈傷組織——葉葉——花瓣種子——種子葉——懸浮細(xì)胞葉——花瓣葉——懸浮細(xì)胞葉——懸浮細(xì)胞懸浮細(xì)胞——懸浮細(xì)胞葉——根懸浮細(xì)胞——葉原生質(zhì)體——血紅細(xì)胞懸浮細(xì)胞——葉懸浮細(xì)胞——葉腹水癌細(xì)胞——原生質(zhì)體葉——根尖纖維肉瘤細(xì)胞——畸胎瘤細(xì)胞197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972幾種細(xì)胞融合成功的例子第六頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三植物融合細(xì)胞成長狀態(tài)對比,右瓶為地面融合的細(xì)胞，左瓶中為太空微重力環(huán)境下融合的細(xì)胞

第七頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三動物細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)使用的小白鼠第八頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三細(xì)胞融合的意義理論上說任何細(xì)胞，都有可能通過體細(xì)胞雜交而成為新的生物資源。這對于種質(zhì)資源的開發(fā)和利用具有深遠(yuǎn)的意義。融合過程不存在有性雜交過程中的種性隔離機(jī)制的限制，為遠(yuǎn)緣物種間的遺傳物質(zhì)交換提供了有效途徑。體細(xì)胞雜交產(chǎn)生的雜種細(xì)胞含有來自雙親的核外遺傳系統(tǒng)，在雜種的分裂和增殖過程中雙親的葉綠體、線粒體DNA亦可發(fā)生重組，從而產(chǎn)生新的核外遺傳系統(tǒng)。淋巴細(xì)胞雜交瘤和單克隆抗體的制備。第九頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三二、動物細(xì)胞融合和體細(xì)胞雜交植物細(xì)胞融合過程人造小鼠培育過程示意圖第十頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三顯微鏡下細(xì)胞融合過程第十一頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三融合過程中兩個(gè)細(xì)胞膜從彼此接觸到破裂形成細(xì)胞橋的變化過程圖解第十二頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三1、仙臺病毒法仙臺病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合經(jīng)四個(gè)階段：①兩種細(xì)胞在一起培養(yǎng)，加入病毒，在4℃條件下病毒附著在細(xì)胞膜上。并使兩細(xì)胞相互凝聚；②在37℃中，病毒與細(xì)胞膜發(fā)生反應(yīng)，細(xì)胞膜受到破環(huán)，此時(shí)需要Ca2+和Mg2+，最適pH為8.0一8.2；②細(xì)胞膜連接部穿通，周邊連接部修復(fù)，此時(shí)需Ca2+和ATP；④融合成巨大細(xì)胞，仍需ATP。（一）促進(jìn)細(xì)胞融合的方法第十三頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三病毒促使細(xì)胞融合的主要步驟如下：兩個(gè)原生質(zhì)體或細(xì)胞在病毒黏結(jié)作用下彼此靠近；通過病毒與原生質(zhì)體或細(xì)胞膜的作用使兩個(gè)細(xì)胞膜間互相滲透，胞質(zhì)互相滲透；兩個(gè)原生質(zhì)體的細(xì)胞核互相融合，兩個(gè)細(xì)胞融為一體；進(jìn)入正常的細(xì)胞分裂途徑，分裂成含有兩種染色體的雜種細(xì)胞。第十四頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三用滅活的病毒誘導(dǎo)的動物細(xì)胞融合過程示意圖

第十五頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三

優(yōu)點(diǎn)是易得，用法簡單，融合效果穩(wěn)定。聚乙二醇(PEG)結(jié)構(gòu)為：HOH2C（CH20CH2）nCH2OH，分子量大于

200小于6000者均可用作細(xì)胞融合劑。PEG濃度以W/W；如將10克PEG與10mlEagLe氏液混合（假定1ml

培養(yǎng)液為1g重)，即成50％PEG溶液。PEG經(jīng)高壓滅菌后，與溫?zé)岬腅ngle氏液混合。通常用分子量低于1000的PEG作融合劑最好，50％PEG溶液能產(chǎn)生最多雜交細(xì)胞。PEG溶液在pH6.0時(shí)細(xì)胞融合率最高。2、聚乙二醇（PEG）法第十六頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三聚乙二醇（PEG）法細(xì)胞融合過程第十七頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三PEG的作用機(jī)理：Kao等認(rèn)為，由于PEG分子具有輕微的負(fù)極性，故可以與具有正極性基團(tuán)的水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等形成H鍵，從而在質(zhì)膜之間形成分子橋，其結(jié)果是使細(xì)胞質(zhì)膜發(fā)生粘連進(jìn)而促使質(zhì)膜的融合；另外，PEG能增加類脂膜的流動性，也使細(xì)胞的核、細(xì)胞器發(fā)生融合成為可能。

PEG誘導(dǎo)融合的特點(diǎn)：其優(yōu)點(diǎn)是融合成本低，勿需特殊設(shè)備；融合子產(chǎn)生的異核率較高；融合過程不受物種限制。其缺點(diǎn)是融合過程繁瑣，PEG可能對細(xì)胞有毒害。

第十八頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三聚乙二醇（PEG）法細(xì)胞融合步驟（1）將兩種不同親本細(xì)胞各5×l06混勻；（2）離心沉淀，吸去上清液；（3）加1ml50％PEG溶液，用吸管吹打，使之與細(xì)胞接觸1分鐘；（4）加9ml培養(yǎng)液，離心沉淀，吸去上清液；（5）加5ml培養(yǎng)液，分別接種5個(gè)直徑60mm平皿，每個(gè)平皿加培養(yǎng)液至5ml，37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（6）6—24小時(shí)后，換成選擇培養(yǎng)液篩選雜交細(xì)胞。第十九頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三第二十頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三3、電融合法

電融合法是80年代出現(xiàn)的細(xì)胞融合技術(shù)，在直流電脈沖的誘導(dǎo)下，細(xì)胞膜表面的氧化還原電位發(fā)生改變，使異種細(xì)胞粘合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂，進(jìn)而質(zhì)膜開始連接，直到閉和成完整的膜，形成融合體。電融合法的優(yōu)點(diǎn)：融合率高、重復(fù)性強(qiáng)、對細(xì)胞傷害小；裝置精巧、方法簡單、可在顯微鏡下觀察或錄像觀察融合過程；免去PEG誘導(dǎo)后的洗滌過程、誘導(dǎo)過程可控性強(qiáng)。第二十一頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三電融合的基本過程：細(xì)胞膜的接觸：當(dāng)原生質(zhì)體置于電導(dǎo)率很低的溶液中時(shí)，電場通電后，電流即通過原生質(zhì)體而不是通過溶液，其結(jié)果是原生質(zhì)體在電場作用下極化而產(chǎn)生偶極子，從而使原生質(zhì)體緊密接觸排列成串；膜的擊穿：原生質(zhì)體成串排列后，立即給予高頻直流脈沖就可以使原生質(zhì)膜擊穿，從而導(dǎo)致兩個(gè)緊密接觸的細(xì)胞融合在一起。

第二十二頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三電融合誘導(dǎo)法原理示意圖第二十三頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三（二）雜交瘤技術(shù)第二十四頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三第二十五頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三第二十六頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三只針對某一抗原決定簇的抗體分子稱為單克隆抗體。第二十七頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三

單克隆抗體技術(shù)的核心是用骨髓瘤細(xì)胞(myelomacell)與經(jīng)特定抗原免疫刺激的B淋巴細(xì)胞(antigenstimulatedBlymphoblast)融合得到雜交瘤細(xì)胞(hybridomacell)，雜交瘤細(xì)胞既能像骨髓瘤細(xì)胞那樣在體外無限增殖，又具有B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體的能力。因此，單克隆抗體技術(shù)又稱為雜交瘤技術(shù)(hybridomatechnology

）。第二十八頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三NielsK.Jerne

G.Kohler

C.Milstein

第二十九頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三雜交瘤技術(shù)的基本原理第三十頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三雜交瘤細(xì)胞的制備1、骨髓瘤細(xì)胞選擇及選擇性培養(yǎng)基骨髓瘤細(xì)胞本身不能分泌抗體選擇次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）第三十一頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三HAT培養(yǎng)基次黃嘌呤（hypoxanthine，H）氨基喋呤（aminopterin，A）胸腺嘧啶脫氧核苷（thymidine，T）次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）第三十二頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三2、免疫小鼠

免疫程序是取6—8周齡Balb／C雌鼠，基礎(chǔ)免疫2周，靜脈再加強(qiáng)免疫一次，3—5天后用于融合。免疫時(shí)是否采用佐劑和事先處理抗原，要依抗原性的強(qiáng)弱而定。一般來講可溶性抗原用完全佐劑效果較好?？乖客瑯优c抗原強(qiáng)弱有關(guān)，以IgG為例，第一次為100g，第二次為50g，免疫途徑第一次可經(jīng)腹腔注射。對于細(xì)胞性抗原不用佐劑，每次腹腔注射1×l06一1×107。第三十三頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三3、脾細(xì)胞的制備(1)引頸處死小鼠，用酒精消毒體表；(2)無菌條件下取出脾臟，剃除結(jié)締組織和脂肪，用5ml無血清培養(yǎng)液沖洗一次；(3)把脾臟置于已消毒的90一100目不銹鋼網(wǎng)或尼龍紗網(wǎng)中；(4)在脾中部切開一小口，用注射器芯從一端輕輕壓擠，再用無血清培養(yǎng)液沖洗，令細(xì)胞通過紗網(wǎng)，收集入平皿中，或用注射器向脾臟內(nèi)注入3ml無血清培養(yǎng)液，反復(fù)抽吸數(shù)次方法獲取細(xì)胞，再制成細(xì)胞懸液亦可；(5)把細(xì)胞懸液注入50ml離心管中，加l0一20ml培養(yǎng)液：輕輕吹打數(shù)次，室溫中置5分鐘；(6)離心(800一1000轉(zhuǎn)／分)計(jì)數(shù)、備用。第三十四頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三4、細(xì)胞準(zhǔn)備（1）收集骨髓瘤細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)液洗3次(37℃)，計(jì)數(shù)活力細(xì)胞(不少于90％)；（2）收集小鼠脾細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)液洗3次(37℃)，并計(jì)細(xì)胞數(shù)和測定活力細(xì)胞；（3）按1：5或1：10混合脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞后，離心棄去上清，并以消毒濾紙吸凈多余上清。第三十五頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三5、細(xì)胞融合(1)將1ml40％的PEG液一滴滴加入列細(xì)胞團(tuán)中，在60秒內(nèi)加完，同時(shí)并不斷輕微轉(zhuǎn)動離心管或用手指輕彈離心管；(2)在不斷轉(zhuǎn)動離心管中加1ml無血清培養(yǎng)液，60秒鐘內(nèi)加完；(3)于5分鐘內(nèi)慢慢加完20ml無血清培養(yǎng)液；此時(shí)細(xì)胞對機(jī)械損傷非常敏感，(4)離心(800轉(zhuǎn)／分，8分鐘)，去上清，用完全培養(yǎng)液10ml懸浮，輕輕混勻；(5)取96孔板，每孔加50l；(6)取等體積細(xì)胞懸液，向另一96孔板中加50l

；(7)送入5％CO2，溫箱中37℃培養(yǎng)，24小時(shí)后更換成HAT選擇性培養(yǎng)掖。第三十六頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三6、融合后細(xì)胞培養(yǎng)(1)融合后7—10天用HAT培養(yǎng)液半量換液(留一半舊的加一半新的)后每隔2—3天半量換液一次；(2)兩周后可改用HA培養(yǎng)液半量換液，或仍用HAT培養(yǎng)液；(3)2—3周后出現(xiàn)雜交細(xì)胞集落，細(xì)胞個(gè)大、圓且透明；(4)待集落增殖生長至1／3孔時(shí)，應(yīng)進(jìn)行抗體檢測。第三十七頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三HAT培養(yǎng)基次黃嘌呤（hypoxanthine，H）氨基喋呤（aminopterin，A）胸腺嘧啶脫氧核苷（thymidine，T）次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）第三十八頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三7、抗體檢測免疫熒光試驗(yàn)放射免疫試驗(yàn)(RIA)聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)第三十九頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三8、單克隆抗體的大量制備體內(nèi)法培養(yǎng)法第四十頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三單克隆抗體的應(yīng)用單克隆抗體具有高度的特異性與靈敏性，可以廣泛地用于臨床醫(yī)學(xué)的疾病診斷，以提高疾病診斷的準(zhǔn)確性。利用單克隆抗體技術(shù)可以生產(chǎn)各種免疫疫苗，這不僅能大大降低生產(chǎn)成本，同時(shí)也增加了疫苗的安全性。單克隆抗體還有可能用于某些腫瘤的治療，是人類戰(zhàn)勝癌癥十分有望的潛在技術(shù)。單克隆抗體技術(shù)還可廣泛用于各種基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究，從而推動現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展。

第四十一頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三人源單克隆抗體主要困難（1）缺乏合適的人骨髓瘤細(xì)胞株作為融合親本?，F(xiàn)有的細(xì)胞株大多是融合率不高，雜交瘤抗體產(chǎn)生水平低，而且細(xì)胞不穩(wěn)定，易喪失抗體分泌能力；（2）獲得抗原特異的人B淋巴細(xì)胞十分困難，因?yàn)閷θ藖碚f，高度免疫獲得抗原特異的B淋巴細(xì)胞的方法顯然是不可行的；（3）大量繁殖雜交瘤細(xì)胞以獲得所需量的抗體，鼠類雜交瘤可通過小鼠腹腔接種雜交瘤細(xì)胞誘生腹水達(dá)到這一目的，但是人雜交瘤細(xì)胞在鼠類中誘生腹水是很困難的。第四十二頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三第四十三頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三單克隆抗體工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用

單克隆抗體的生產(chǎn)包括細(xì)胞培養(yǎng)、提純和制劑等工藝。作為治療藥品應(yīng)用的單克隆抗體則必須采用生物反應(yīng)器，大規(guī)模培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞。

單克隆抗體藥物：1986年，美國FDA批準(zhǔn)了第一個(gè)單克隆抗體藥物上市，距今已經(jīng)整整20多年了。截止到現(xiàn)在，全世界共有21個(gè)治療用抗體藥物被批準(zhǔn)上市，實(shí)現(xiàn)200億美元的銷售額，在國際，也在國內(nèi)形成了抗體藥物開發(fā)熱潮。

第四十四頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三單克隆抗體工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用

單抗藥主要用于癌癥和免疫性疾病的治療?，F(xiàn)在有5大單抗藥物占據(jù)了80%的市場份額，其中羅氏制藥Roche和基因泰克（NYSE:

DNA）聯(lián)合開發(fā)上市的單抗藥物有3個(gè)，分別為Avastin、Herceptin和Rituxan；另外還有雅培公司（NYSE:

ABT）的Humira和強(qiáng)生公司（NYSE:

JNJ）的Remicade。5大單抗藥主宰市場的趨勢到2012年不會發(fā)生太大的變化，仍將占有70%的市場。至2012年，Biogen（Nasdaq:

BIIB）、安進(jìn)（Nasdaq:

AMGN）和UCB（布魯塞爾證券交易市場：UCB.BR）也將有單抗藥物上市。第四十五頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三第四十六頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三第四十七頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三第四十八頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三第四十九頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三三、植物原生質(zhì)體融合和體細(xì)胞雜交植物原生質(zhì)培養(yǎng)和細(xì)胞融合可用產(chǎn)生遠(yuǎn)緣雜種；是目前植物細(xì)胞及基因工程的核心技術(shù)。第五十頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三植物原生質(zhì)體培養(yǎng)通過一定方法除去細(xì)胞壁，而得到一個(gè)裸露的植物細(xì)胞，即為原生質(zhì)體(Protoplast)。游離的原生質(zhì)體像正常的植物細(xì)胞那樣具有全能性，在一定條件下培養(yǎng)可以重新再生出完整植株。第五十一頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三

自1970年首次獲得煙草原生質(zhì)體再生植株成功以來，通過原生質(zhì)體獲得再生植株的植物約有280余種，其中有20種為我國首先報(bào)道。原生質(zhì)體培養(yǎng)包括原生質(zhì)體的分離、培養(yǎng)、植株再生等過程。第五十二頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三(一)原生質(zhì)體的制備：1、材料來源與預(yù)處理：（1）材料來源：可以用各種組織和器官，但多應(yīng)用葉片、愈傷組織及懸浮培養(yǎng)細(xì)胞。以及莖尖、根尖、子葉和胚性組織。

第五十三頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三（2）預(yù)處理：

A.預(yù)質(zhì)壁分離：17-20℃酶液中靜置半小時(shí)，再于28—34℃保溫，或?qū)⒉牧现糜谂c酶液中糖濃度相同的溶液中預(yù)培養(yǎng)1h左右，再浸于酶液中消化即可達(dá)到質(zhì)壁分離目的；

B.預(yù)培養(yǎng):

將除去下表皮的葉片于誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天，再用酶消化去壁，所得原生質(zhì)體分裂頻率較高；

C.暗處理:將室溫下生長5—7個(gè)星期的植物材料在黑暗中放置30h以上，取其葉片制備的原生質(zhì)體有活力；

D.光處理:將葉片于日光或燈光下照射2—6h令其萎蔫，利于撕除下表皮及原生質(zhì)體分離；

E.低溫處理:夏季應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)材料其萌動種子應(yīng)于4℃過夜后再播種，從其植株葉片上分離的原生質(zhì)體培養(yǎng)效果較佳。第五十四頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三2.制備原生質(zhì)體的酶類：高等植物細(xì)胞壁主要成分為a-纖維素，其次為半纖維素、果膠質(zhì)及蛋白質(zhì)。細(xì)胞生長的不同階段及不同物種的細(xì)胞壁組成與結(jié)構(gòu)不同，木質(zhì)化及次生加厚的細(xì)胞壁不被酶消化，故選擇材料和消化細(xì)胞壁的酶類是制備原生質(zhì)體關(guān)鍵。第五十五頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三常用的酶類有：A.纖維素酶，如OnozukaR—10及RS，國內(nèi)常用的為EA3—867，其中含少量果膠酶；B.果膠酶，如MacerozymeR—10又叫離析酶，主要含果膠酶，活力較高，其含雜酶較多，用量不超過2％，作用時(shí)間長有毒害作用；此外亦用PectalyaseY—23，也叫離析軟化酶，活力極高，葉片用量一般為0．1％，懸浮細(xì)胞為0．05％；C.崩潰酶（Driselase)，為一種粗酶制劑，具有纖維素酶及果膠酶活性；D.半纖維素酶，如RhozymeHP150，用于懸浮細(xì)胞、豆科根瘤、幼苗子葉及根細(xì)胞原生質(zhì)體的分離;E蝸牛酶，主要用于體細(xì)胞原生質(zhì)體分離。第五十六頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三

酶液配制：

需加入甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、葡萄糖硫酸酯、CaCl2·2H20(0.1mmol/l一10mo1／l)及KH2PO4(0.75mmol/l)等滲透穩(wěn)定劑，以維持原生質(zhì)體完整性。酶液pH值相當(dāng)重要，纖維素酶及果膠酶單獨(dú)使用時(shí)，其pH分別以5.4及5.8為宜；混合使用時(shí)pH5.4-pH5.6為宜，降至4．8以下則原生質(zhì)體破裂。酶液配制后需以0.45um微孔膜過濾除菌，而不可采用加熱滅菌法。第五十七頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三3．原生質(zhì)體分離及純化（1）分離：原生質(zhì)體分離有機(jī)械法及酶消化法，前者產(chǎn)量極低而不多用、后者又分一步法及二步法。一步法是將材料在2l一28℃用纖維素酶及果膠酶混合液一次性處理2—24h。二步法是將材料先用果膠酶降解胞間膠層得到單細(xì)胞，再用纖維素酶脫壁而釋放原生質(zhì)體。第五十八頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三（2）純化

A.沉降法:原生質(zhì)體混合物經(jīng)微孔過濾后，低速（150g）離心5min,沉淀再用與酶液具相同糖濃度溶液反復(fù)洗3-4次，后用培養(yǎng)液洗滌備用；

B.飄浮法:

離心法純化的原生質(zhì)體若含較多碎片及少量老細(xì)胞時(shí)．可用20％蔗糖離心，原生質(zhì)體浮于液面．碎片及老細(xì)胞沉降而得以純化，純度高，但產(chǎn)量低；

C.不連續(xù)梯度離心法：將原生質(zhì)粗提液置于不連續(xù)濃度梯度的溶液中，經(jīng)離心后分離不同比重的原生質(zhì)體。第五十九頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三

4．原生質(zhì)體活力測定

純化的原生質(zhì)體需經(jīng)活力測定后方可用于培養(yǎng)。（1）根據(jù)形態(tài)特征判斷其活力：原生質(zhì)體呈綠色（若來源于葉片）及圓而鼓者為活原生質(zhì)體。（2）熒光染料活體染色法：熒光素染料可自由透過細(xì)胞膜，在細(xì)胞內(nèi)被酯酶水解為熒光素，后者不能自由透過細(xì)胞膜而滯留于細(xì)胞內(nèi)，在熒光顯微鏡下根據(jù)熒光強(qiáng)度即可判斷原生質(zhì)體死活。（3）酚藏花紅染色法：活原生質(zhì)體能吸收呈紅色，無活性的則不能吸收而無色。第六十頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三（二）原生質(zhì)體培養(yǎng)：

1.培養(yǎng)方法：（1）固體培養(yǎng)：平板培養(yǎng)法，1.2%瓊脂。（2）液體培養(yǎng)：

A.淺層培養(yǎng)法:其過程是將1mL原生質(zhì)體懸液置于直徑4cm培養(yǎng)皿或25mL三角瓶中使成薄層后于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)．初期振搖1—2次，防止粘壁；

B.固液結(jié)合培養(yǎng)法：在混好原生質(zhì)體的固體培養(yǎng)基表面加一層相同成分的液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。效果較好。第六十一頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三2.培養(yǎng)條件：密度：平板培養(yǎng)103~104個(gè)/ml,

液體培養(yǎng)104~105個(gè)/ml溫度：多數(shù)為25-28oC,少數(shù)16~37oC光照：500lx,18h或2800lx連續(xù)光照多數(shù)要求黑暗或弱光第六十二頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三3.細(xì)胞壁再生及細(xì)胞分裂：

l-3天即再生新細(xì)胞壁，表現(xiàn)為體積增加、膨大，再由圓變橢圓。可用質(zhì)壁分離法證實(shí)。也可用0.1%ST型或WBL型熒光增白劑染色，經(jīng)前者染色，有細(xì)胞壁者在熒光顯微鏡下呈藍(lán)色熒光。經(jīng)后者染色，有細(xì)胞壁者發(fā)射綠色熒光。在原生質(zhì)培養(yǎng)過程中，胞質(zhì)增加，液泡減少，葉綠體或顆粒內(nèi)含物分散于泡質(zhì)中或圍繞于細(xì)胞核周圍．常在1一2周內(nèi)發(fā)生第一次分裂。不同細(xì)胞分裂頻率不同。第六十三頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三4、愈傷組織或胚狀體形成

原生質(zhì)體再生的細(xì)胞一旦開始分裂，就可能繼續(xù)生長：

A形成細(xì)胞團(tuán)，發(fā)育成愈傷組織；

B.形成胚狀體，再產(chǎn)生植株；

C.形成愈傷組織，再形成胚狀體。隨著細(xì)胞分裂及細(xì)胞團(tuán)形成，已與常規(guī)細(xì)胞和組織培養(yǎng)相同，故培養(yǎng)3—4周需添加含一定量低滲穩(wěn)定劑的新培養(yǎng)基，以滿足細(xì)胞的營養(yǎng)，亦利于細(xì)胞團(tuán)及小愈傷組織的生長。第六十四頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三

5.植株再生

大多經(jīng)愈傷組織誘導(dǎo)分化再生為完整植株。當(dāng)愈傷組織達(dá)到1—2mm時(shí)，轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)器官分化。分化培養(yǎng)基與原生質(zhì)體培養(yǎng)基差別在于：

(1)只用蔗糖為碳源，不加滲透穩(wěn)定劑；

(2)與原生質(zhì)體培養(yǎng)基相反，細(xì)胞分裂素濃度高于生長素;(3)在誘導(dǎo)器官分化過程中，一般采用15001x左右的高光強(qiáng)。誘導(dǎo)器官分化的溫度與原生質(zhì)體培養(yǎng)基本相同。

第六十五頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三

（三）原生質(zhì)體培養(yǎng)的目的：

1、利用原生質(zhì)體不具細(xì)胞壁的特性可以進(jìn)行細(xì)胞器移植和外源物的攝取，原生質(zhì)體之間可以進(jìn)行融合而產(chǎn)生雜種細(xì)胞(即體細(xì)胞雜交）。2、是植物基因工程的理想受體，用外源遺傳物質(zhì)對植物原生質(zhì)體進(jìn)行改造和轉(zhuǎn)化，然后誘導(dǎo)分裂、分化再生出能育的完整基因工程植株。3、也是研究細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、體細(xì)胞無性系變異和植物病理學(xué)研究的有用工具。第六十六頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三A-E,培養(yǎng)的歐當(dāng)歸(LevisticumofficinaleKoch))原生質(zhì)體分裂再生成植株的過程

F-L,培養(yǎng)過程的核變化；F.多核，G.核穿壁，H.無絲分裂，I.染色體橋，J.2n=22，K.L.多倍體.A-D當(dāng)歸(Angelicasinensis(Oliv)Diels)原生質(zhì)體培養(yǎng)成再生苗

E-H,紅豆草(OnobrychisvicaefoliaScop))原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株第六十七頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三第六十八頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三第六十九頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三第七十頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三（四）原生質(zhì)體融合：

在外界因素作用下，兩個(gè)或兩個(gè)以上植物細(xì)胞合并成一個(gè)多核細(xì)胞的過程稱為植物細(xì)胞融合，或植物體細(xì)胞雜交。但由于植物細(xì)胞具有堅(jiān)硬的細(xì)胞壁，不能直接融合，需經(jīng)酶消化除去細(xì)胞壁釋放出原生質(zhì)體，后者生理、生化及遺傳學(xué)特性與完整細(xì)胞基本相同。在適當(dāng)條件下來源不同的植物原生質(zhì)體可產(chǎn)生融合作用，并可再生細(xì)胞壁，形成完整植株。第七十一頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期三1、作用：(1)可實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣雜交，獲得種間雜種，克服有性