目的基因的克隆與分離

關(guān)于目的基因的克隆與分離第一頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二第五講目的基因的克隆與分離目的基因：準備要分離、改造、擴增或表達的基因。第二頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二第一節(jié)基因組DNA片斷化一、限制性內(nèi)切酶法用限制性內(nèi)切酶把基因組DNA切成不同大小的片斷。酶切第三頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二由于帶有粘性末端，產(chǎn)物可以直接與載體連接。1.優(yōu)點2.缺點目的基因內(nèi)部也可能有該內(nèi)切酶的切點。目的基因也被切成碎片！BamHIBamHIBamHIgene第四頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二二、隨機片斷化1.限制性內(nèi)切酶局部消化法控制內(nèi)切酶的用量和消化時間，使基因組中的酶切位點只有一部分被隨機切開。①內(nèi)切酶識別位點的堿基數(shù)影響所切出的產(chǎn)物的長度和隨機程度。（1）限制性內(nèi)切酶的選用原則第五頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二1）4bp的內(nèi)切酶平均每46（4096）bp一個切點。2）6bp的內(nèi)切酶平均每44（256）bp一個切點。隨機程度高。如HaeⅢ、AluI、Sau3A。②內(nèi)切酶粘性末端能與常用克隆位點相連。（Sau3A—BamHI）第六頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二2.機械切割法（1）超聲波超聲波強烈作用于DNA，可使其斷裂成約300bp的隨機片斷。（2）高速攪拌1500轉(zhuǎn)/分下攪拌30min，可產(chǎn)生約8kb的隨機片斷。第七頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二1976年H.G.Khorana提出了用化學(xué)方法合成基因的設(shè)想，并于1979年在science上發(fā)表了率先成功地合成大腸桿菌酪氨酸t(yī)RNA基因的論文。第二節(jié)化學(xué)合成目的基因一、目前常用的方法磷酸二酯法、磷酸三酯法、亞磷酸三酯法、固相合成法自動化合成法。第八頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二①保護dNTP的5’端P或3’端-OH③用酸或堿的脫保護（1）原理1.磷酸二酯法②帶保護的單核苷酸連接保證合成反應(yīng)的定向進行。帶5’保護的單核苷酸與帶3’保護的另一個單核苷酸以磷酸二酯鍵連接起來。第九頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二（2）合成過程下一個5’端保護的單核苷酸又可以同3’端保護的二核苷酸聚合。第十頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二原理與磷酸二酯法一樣。只是參加反應(yīng)的單核苷酸都是在3’端磷酸和5’-OH上都先連接了一個保護基團。2.磷酸三酯法第十一頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二將第一個核苷酸的3’-OH端固定在固相支持物上。固相磷酸三酯合成法是目前通用的合成方法。合成的二核苷酸連接處有三個酯鍵！第十二頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二固相磷酸三酯合成過程固相支持物結(jié)果是全保護的DNA：5’DMT,3’固相支持物,核苷酸之間對氯苯。最后脫保護固相支持物固相支持物C第十三頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二化學(xué)合成的DNA片斷一般在200bp以內(nèi)。二、化學(xué)合成DNA片斷的組裝用T4多核苷酸激酶使各個片段的5’端帶上磷酸。1.互補連接法預(yù)先設(shè)計合成的片斷之間都有互補區(qū)域，不同片斷之間的互補區(qū)域能形成有斷點的完整雙鏈。（2）5’端磷酸化（1）互補配對（合成的DNA單鏈的5’端是-OH）第十四頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二T4DNA連接酶T4多核苷酸激酶使5’-OH磷酸化完整的DNA雙鏈（3）連接酶連成完整雙鏈第十五頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二2.互補延伸連接法預(yù)先設(shè)計的片斷之間有局部互補區(qū)，可以相互作為另一個片斷延長的引物，用DNA聚合酶延伸成完整的雙鏈。3’5’5’3’5’3’T4DNA連接酶Klenow片段引物第十六頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二1.直接合成基因三、寡聚核苷酸化學(xué)合成的優(yōu)點2.合成引物（20mer左右）（1）mRNA的含量很低，很難作cDNA3.合成探針序列4.定點突變合成合成帶有定點突變的基因片斷。（2）有些基因比較短，化學(xué)合成費用較低第十七頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二DNA合成儀5.合成人工接頭或銜接物含有各種酶切位點人工接頭（Adaptor）或銜接物（Linker）序列。EcoRIEcoRILinkerAdaptor第十八頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二將某種生物細胞的整個基因組DNA切割成大小合適的片斷，并將所有這些片斷都與適當?shù)妮d體連接，引入相應(yīng)的宿主細胞中保存和擴增。理論上講，這些重組載體上帶有了該生物體的全部基因，稱為基因文庫。一、基因文庫的構(gòu)建1.基因文庫（genelibrary）第三節(jié)目的基因的保存與文庫構(gòu)建第十九頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二（2）目前常用的載體2.構(gòu)建基因文庫的載體選用載體能夠容載的DNA片斷大小直接影響到構(gòu)建完整的基因文庫所需要的重組子的數(shù)目。載體容量越大，所要求的DNA片斷數(shù)目越少，所需的重組子越少。（1）對載體的要求載體系列：容量為24kpcosmid載體：容量為50kbYAC：容量為1MbBAC:容量為300kb第二十頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二斷點完全隨機，片斷長度合適于載體連接。不能用一般的限制性內(nèi)切酶消化法。（1）染色體DNA大片段的制備3.基因文庫構(gòu)建的一般步驟超聲波（300bp）或機械攪拌（8kb）。①物理切割法：內(nèi)切酶Sau3A進行局部消化?？傻玫?0-30kb的隨機片斷。②酶切法：第二十一頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二（2）載體與基因組DNA大片段的連接①粘性末端直接連接載體與外源DNA大片段的兩個末端都有相同的粘性末端。如：Sau3A與BamHI的酶切末端。直接連接、人工接頭或同聚物加尾。②人工接頭法（adapter）人工合成的限制性內(nèi)切酶粘性末端片斷。第二十二頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二各種酶的接頭可以向公司定做或購買。接上人工接頭粘性末端CCCCCC末端轉(zhuǎn)移酶粘性末端③同聚物加尾第二十三頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二第二十四頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二4.基因組文庫的大小一個文庫要包含99%的基因組DNA時所需要的克隆數(shù)目。N=ln(1-p)ln(1-f)p:文庫包含了整個基因組DNA的概率（99%）f:插入載體的DNA片斷的平均長度占整個基因組DNA的百分數(shù)N：所需的重組載體數(shù)（克隆數(shù)）第二十五頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二例如：人的基因組是3×109bp，插入DNA片斷的平均長度如果是1.7×104bpN=ln(1-p)ln(1-f)=ln(1-99%)ln(1-f)=4.61×GfN=4.61×GfG：Genome大??；f：fragment大小N=4.61×Gf=4.61×3×1091.7×104=8.1×105第二十六頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二1.cDNA以mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄出的DNA稱cDNA。2.cDNAlibrary二、cDNA文庫的構(gòu)建mRNAcDNA3’3’5’5’反轉(zhuǎn)錄酶引物利用某種生物的總mRNA合成cDNA，再將這些cDNA與載體連接，轉(zhuǎn)入細菌細胞中進行保存和擴增，稱cDNA文庫。第二十七頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二（1）不含內(nèi)含子序列。（2）可以在細菌中直接表達。（3）包含了所有編碼蛋白質(zhì)的基因。（4）比DNA文庫小的多，容易構(gòu)建。4.構(gòu)建cDNA文庫的一般步驟（1）總RNA（totalRNA）提取3.cDNA文庫的特點提取總RNA有商業(yè)化的試劑盒（kit）。第二十八頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二分離mRNA用商業(yè)化的OligodT纖維柱。利用mRNA都含有一段polyA尾巴，將mRNA從總RNA（rRNA、tRNA等）中分離純化。mRNA只占總RNA的1%-2%。（2）mRNA的分離純化①原理②mRNA的分離純化Column（柱）第二十九頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二第三十頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二反轉(zhuǎn)錄酶（3）cDNA的合成①cDNA第一鏈合成逆轉(zhuǎn)錄酶能以RNA為模板合成DNA。用OligodT（或隨機引物）作引物，合成cDNA的第一鏈。mRNAcDNA3’5’5’AAAAAAATTTTTTTOligodT引物第三十一頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二用堿處理或用RNaseH降解mRNA-DNA雜交分子中的mRNA。mRNAcDNA3’

3’

5’

5’

反轉(zhuǎn)錄酶引物mRNAcDNA第一鏈3’

3’

5’

5’

引物cDNA第一鏈3’

5’

引物②

降解mRNA模板或RNaseH堿第三十二頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二剩下的cDNA單鏈的3’末端一般形成一個彎回來的雙鏈發(fā)卡結(jié)構(gòu)（機理不明），可成為合成第二條cDNA鏈的引物。用DNA聚合酶合成第二鏈DNA。cDNA第一鏈5’cDNA第二鏈合成DNA聚合酶cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’3’③cDNA第二鏈合成第三十三頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二④去掉發(fā)卡結(jié)構(gòu)核酸酶S1用核酸酶S1可以切掉發(fā)卡結(jié)構(gòu)（但這會導(dǎo)致cDNA中有用的序列被切掉?。?。cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’3’cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’3’5’3’第三十四頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二第三十五頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二這種酶能識別mRNA-cDNA雜交分子中的mRNA，并將其降解成許多小片斷。妙用RNaseH小片斷正好成為DNA聚合酶的引物，用來合成岡崎片斷。DNAPolI除去引物并修補后再使用DNA連接酶連成一整條DNA鏈。第三十六頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二mRNAcDNA3’5’反轉(zhuǎn)錄酶引物mRNAcDNA第一鏈3’5’引物mRNAcDNA第一鏈3’5’mRNAmRNADNA聚合酶DNA聚合酶cDNA第二鏈cDNA第一鏈3’5’RNaseHDNAligase去引物第三十七頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二第三十八頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二在雙鏈cDNA末端接上人工接頭，即可與載體連接，轉(zhuǎn)入受體菌?；蚪柚┒宿D(zhuǎn)移酶給載體和雙鏈cDNA的3’端分別加上幾個C或G，成為粘性末端。5.cDNA與載體連接：接上人工接頭粘性末端CCCCCC末端轉(zhuǎn)移酶第三十九頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二第四十頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二6.cDNA文庫的大小一個cDNA文庫要包含99%的mRNA時所需要的克隆數(shù)目。N=ln(1-p)ln(1-)p:文庫包含了完整mRNA的概率（99%）:某一種低豐度（不足14份拷貝）mRNA占細胞整個mRNA的比例N：所需的重組載體數(shù)（克隆數(shù)）1n1n第四十一頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二三、文庫的查詢（screening）用目的基因探針與文庫中的重組載體進行Southernblot雜交。文庫載體探針電泳后雜交放射自顯影測序分析第四十二頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二第四節(jié)目的基因的分離和擴增一、目的基因的分離1.探針柱分離特異mRNA根據(jù)已知的基因序列合成探針，結(jié)合到纖維素柱上，用來分離純化該基因的mRNA。富集特定基因的mRNA或cDNA模板。第四十三頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二纖維柱探針DNA探針DNA探針DNA探針DNATotalmRNA纖維柱探針DNA探針DNA探針DNA探針DNA過柱與探針堿基互補的mRNA結(jié)合到柱上，其它mRNA流走。特異mRNA洗脫RT-PCR第四十四頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二2.mRNA消解雜交原理：羥基磷灰石柱結(jié)合單鏈DNA-RNA或DNA-DNA雙鏈，不結(jié)合單鏈DNA。（Hydroxylapatitecolumn）第四十五頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二從表達A蛋白和不表達A蛋白的組織細胞中分別提取和分離總mRNA。將表達A蛋白的組織mRNA合成cDNA第一鏈。再同不表達A蛋白的總mRNA雜交成cDNA-mRNA雙鏈。不能雜交的cDNA就包括特異表達的A基因的cDNA單鏈。用羥磷灰石柱收集單鏈cDNA，合成為雙鏈DNA進行擴增、克隆、測序。第四十六頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二AAA組織B組織總mRNA（A）總mRNA（B）含蛋白A的mRNA不含蛋白A的mRNA總cDNA第一鏈A雜交內(nèi)含蛋白A的cDNA羥磷灰石柱過柱吸收RNA-DNA單鏈濾過羥磷灰石柱BAPCRcDNA文庫第四十七頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二3.mRNA差異顯示PCR（DDRT-PCR）mRNAdifferentialdisplayRT-PCR原理：利用幾乎所有mRNA3’的polyA尾巴合成polyT的錨定引物

，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA的第一鏈，然后加入隨機引物合成第二鏈，得到與mRNA對應(yīng)的標簽，變性膠電泳，比較不同來源的cDNA帶，有差異的基因進一步克隆。（1）3’端的錨定引物Oligo(dT)引物的3’端加兩個核苷酸（倒數(shù)第二個不再是T）。

AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA3’5’NMTTTTTTTTM：A、GorCN:A、G、TorC5’3’第四十八頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二（2）12種錨定引物AGTTTTTTTT5’3’CGTTTTTTTT5’3’GGTTTTTTTT5’3’TGTTTTTTTT5’3’AATTTTTTTT5’3’CATTTTTTTT5’3’GATTTTTTTT5’3’TATTTTTTTT5’3’ACTTTTTTTT5’3’CCTTTTTTTT5’3’GCTTTTTTTT5’3’TCTTTTTTTT5’3’第四十九頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二（3）5’端的隨機引物10mer

AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA3’5’NMTTTTTTTT5’3’擴增cDNA第一鏈。RTNMTTTTTTTT5’cDNA3’NNNNNNNNNN5’3’NNNNNNNNNN5’3’cDNA第二鏈，并PCR第五十頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二（4）隨機引物與錨定引物成對擴增12種錨定引物，若與20種隨機引物，可組成240組引物。引物組合：240組能分出20000多條帶！實驗結(jié)果：如果每條帶相當于一種mRNA，20000mRNA基本上反映了一種特定細胞中全部的mRNA。在測序膠上，每組擴出50-100條長度為100-500bp的帶。第五十一頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二（5）隨機-錨定引物PCR的產(chǎn)物電泳比較不同組織的240組引物組合PCR產(chǎn)物在測序膠中電泳。選擇有差異的帶，進一步PCR作探針。篩選文庫，找到差別基因的全長序列。第五十二頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二二、PCR擴增獲得目的基因1.直接從基因組中擴增（1）提取基因組DNA作模板（2）根據(jù)目的基因序列設(shè)計引物（3）PCR擴增真核生物基因組含有內(nèi)含子！適合擴增原核生物基因。第五十三頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二原核基因組部分原核細胞提取基因組DNAPCR擴增第五十四頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二（1）提取基因組totalRNA（2）反轉(zhuǎn)錄合成總cDNA作模板（4）PCR擴增（3）根據(jù)目的基因序列設(shè)計引物2.從mRNA中擴增:RT-PCR原核生物不易得到mRNA，也不含有polyA尾。適合擴增真核生物基因。第五十五頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二目的基因的引物1反轉(zhuǎn)錄成目的基因cDNA第一鏈目的基因的引物2目的基因cDNA第二鏈PCRmRNA第五十六頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二克隆外源基因第五十七頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二外源DNA載體DNA重組分子原核細胞真核細胞擴增或表達表達連接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)電穿孔或顯微注射受體細胞基因的重組與轉(zhuǎn)移第五十八頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二第五十九頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二一、粘性末端的連接DNA連接酶把相互靠近的5’端磷酸與3’-OH連到一起。第五節(jié)DNA片段的體外連接第六十頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二1.兩段DNA的連接依靠粘性末端第六十一頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二2.DNA片斷與載體的連接依靠粘性末端第六十二頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二第六十三頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二ligasenick第六十四頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二二、齊平末端（bluntend）的連接5’端與3’端并列靠近的時間太短，不容易被連接酶連接。1.直接連接T4DNA連接酶雖然能連接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。5’5’5’5’3’3’3’3’-OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5’3’-OH-PP-HO-5’3’第六十五頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二1972年，斯坦福大學(xué)的P.Labban和P.Kaiser提出。（1）同聚加尾法2.人工加尾形成“粘性末端”DNA末端轉(zhuǎn)移酶能在沒有模板的情況下給DNA的3’-OH端加上脫氧核苷酸。①原理：分別給載體和插入片斷加上互補的核苷酸。②加尾—堿基互補第六十六頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二④缺點：③優(yōu)點：能把任何片段連接起來不能把插入片段再切下來。非酶切位點第六十七頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二用T4DNA連接酶連到平端DNA上，然后再用酶切，形成一個人工粘性末端。（2）銜接物(linker)連接①linker用化學(xué)合成法合成的一段10-12bp的特定限制性內(nèi)切酶識別位點序列的平端雙鏈。GGAATTCCCCTTAAGGEcoRIlinker：②linker的作用第六十八頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二

第六十九頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二

第七十頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二④缺點：1）可以用內(nèi)切酶把插入片段切下來。如果插入片段內(nèi)部也有該酶位點，不能切下完整的插入片段2）能給載體連接上Polylinker:③優(yōu)點：第七十一頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二（3）DNA接頭(adapter)連接法1978年康內(nèi)爾大學(xué)的吳瑞教授發(fā)明。5‘p-GATCCCGG-OH3’

GGCC-p5’BamHIadapter用T4DNA連接酶連到DNA分子的兩端，直接成為人工粘性末端。①adapter一頭平末端、另一頭粘性末端（某種酶切位點序列）。②adapter的作用第七十二頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’HO-GGCC-p5’BamHIadapterP--P5‘p-GATCCCGG-GGCC--CCGG-GGCCCTAG-P5’5‘p-GATCCCGG-GGCC-CCGGGGCCCTAG-P5’CCGGGATCCCGG-OHGGCCCTAGGGCC-P5’接頭自我連接第七十三頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二第七十四頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二接頭與接頭會彼此以粘性末端接在一起，影響與DNA片段的連接。③優(yōu)點：連上后就能用。④缺點：先用小牛腸堿性磷酸酶（CIP）處理接頭，水解掉其5’端的磷酸，防止自我連接。（以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。）⑤防止自我連接第七十五頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二5‘p-GATCCCGG-OHHO-GGCC-P

P-CCGG-OHHO-GGCCCTAG-P5’

CCGGGATCCCGG-OHHO-GGCCCTAGGGCC5’接頭之間不能形成磷酸二酯鍵自我連接！

5‘GATCCCGG-OHHO-GGCC5’

5’CCGG-OHHO-GGCCCTAG5’CIP處理-OHHO-第七十六頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’HO-GGCC-p5’BamHIadapterP--P

5‘GATCCCGG-HO-GGCC

CCGG-OH-GGCCCTAG5’5’GATCCCGG-OH3’HO-GGCC5’缺口缺口HO--OHCIP處理T4ligase雖然有缺口，但仍然能與DNA片斷連接。第七十七頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二三、PCR產(chǎn)物的連接1.在引物的5’端設(shè)計酶切位點符合載體的多克隆位點；（1）設(shè)計原則（2）帶酶切位點的引物的結(jié)構(gòu)3’端15~20bp與模板互補；5’端6~10bp是某個內(nèi)切酶的識別序列。（5’端多余的3~5bp屬保護堿基）避免與所擴增的DNA片斷內(nèi)部酶切位點重復(fù)。第七十八頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二引物1GCAGAATTC

互補序列模板EcoRI位點5’--3’GCAGAATTC

互補序列5’--3’3’模板GCAGAATTC

互補序列PCR產(chǎn)物5’--3’3’復(fù)性延伸模板模板3’3’第七十九頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二GCTAGCCGG

互補序列模板BamHI位點-5’3-’5’復(fù)性延伸模板模板3’3’GCTAGCCGG

互補序列-5’3’-模板5’GCTAGCCGG

PCR產(chǎn)物互補序列-5’3’-引物2第八十頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二帶酶切位點的PCR產(chǎn)物GCAGAATTC

PCR產(chǎn)物5’--3’GCTAGCCGG

PCR產(chǎn)物-5’3’-CGTCTTAAGCGATCGGCCEcoRI位點BamHI位點AATTC

PCR產(chǎn)物5’--3’GCTAG

PCR產(chǎn)物-5’3’-GCEcoRIBamHI兩頭各有一個粘性末端！第八十一頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二2.與T載體直接連接（1）PCR產(chǎn)物兩個3’端一般都有一個ATaqDNA聚合酶的特性：在DNA雙鏈的3’端再加上一個多余的核苷酸（優(yōu)先加A）。（2）T載體的兩個3’端人為地各加一個T利用TaqDNA聚合酶，當原料中只有dTTP時，被迫在平端載體上添加T！第八十二頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二AAdNTPTTdTTPTaqDNA聚合酶載體PCR產(chǎn)物TATA第八十三頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二四、DNA體外連接應(yīng)注意的事項插入片斷與載體的酶切位點互補相同的粘性末端才能有效地連接。盡量避免平端連接。決不能進行非粘性末端連接。第八十四頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二EcoRIEcoRIEcoRI（1）用相同的酶切（2）用同尾酶切BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII都產(chǎn)生GATC4個堿基的粘性末端。第八十五頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二2.DNA插入的方向正確用雙酶切由于產(chǎn)生的粘性末端不同，只能以固定方向連接。EcoRIBamHIEcoRIBamHIEcoRIBamHI第八十六頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二3.插入基因的開放閱讀框（ORF）正確（1）DNA定向插入（2）起始密碼尤其當載體上有ATG起始密碼的時候，更要注意。ATGGAATTC載體ATGCGGAATTCT插入片斷EcoRIEcoRIATGGAATTCT重組但移碼突變！第八十七頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二4.防止載體自身環(huán)化連接（1）提高插入片斷的用量連接反應(yīng)體系中，插入片斷比載體多10倍以上。（2）用堿性磷酸酶處理載體載體切口的5’磷酸被除去，不能自我連接。但可以與插入片斷以單鏈連接。5’3’載體插入片斷第八十八頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二1.載體自身環(huán)化連接（能存活）2.載體之間互相連接（能存活）3.插入片段互相連接（不能存活）4.一個載體與幾個插入片段重組（能存活）五、載體和外源DNA插入片段的連接結(jié)果5.幾個載體與一個插入片段重組（能存活）第八十九頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二第九十頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二1.目的增加受體菌細胞膜的通透性。第六節(jié)重組體導(dǎo)入細菌細胞一、感受態(tài)大腸桿菌的制備第九十一頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二使用喪失了限制體系的大腸桿菌。如K12系列的大腸桿菌。2.菌種第九十二頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二第九十三頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二用CaCl2處理大腸桿菌，能增加膜的通透性。3.制備原理第九十四頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二4.制備過程培養(yǎng)大腸桿菌OD600至0.3-0.4Onice5-10min4℃離心收集菌用冰冷的60mMCaCl2重懸4℃離心收集菌4℃離心收集菌分裝、-70℃凍存用冰冷的60mMCaCl2重懸Onice30min用冰冷的60mMCaCl2重懸第九十五頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二二、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌（1）轉(zhuǎn)化（transformation)大腸桿菌捕獲質(zhì)粒DNA的過程。（2）轉(zhuǎn)染（transfection)大腸桿菌捕獲噬菌體DNA的過程。1.外源DNA導(dǎo)入細菌的幾種方法（3）轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction)借助噬菌體把外源DNA導(dǎo)入細菌的過程。第九十六頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二每gDNA轉(zhuǎn)化成功的細菌克隆數(shù)。3.轉(zhuǎn)化方法2.轉(zhuǎn)化率簡單，但轉(zhuǎn)化效率不高（106-108/gDNA）。（1）熱休克法（heatshock）轉(zhuǎn)化效率高（高于109/gDNA）。（2）電轉(zhuǎn)化法electronporation第九十七頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二10ng載體DNA100L感受態(tài)菌Onice混合，靜置10分鐘42oC1分鐘加入1mLLB培養(yǎng)基37℃搖1小時10-100L轉(zhuǎn)化液涂含抗菌素的平板吸附DNA攝入DNA（1）熱休克法第九十八頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二LB培養(yǎng)受體菌至OD600=0.5-0.6冰浴15分鐘，2℃離心集菌冰冷的水重懸菌體2℃離心集菌冰冷的水重懸菌體2℃離心收集菌體少量冰冷的水重懸分裝成50-300L電轉(zhuǎn)儀調(diào)為2.5kV,25F脈沖控制器200-400

0.5g質(zhì)粒DNAOnice混合加入1mLSOC培養(yǎng)液37℃中速震蕩60分鐘10-100L轉(zhuǎn)化液涂含抗菌素的平板轉(zhuǎn)化（2）電轉(zhuǎn)化法第九十九頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二4.平板培養(yǎng)基培養(yǎng)細菌10-100L轉(zhuǎn)化液涂于含抗菌素的平板37℃過夜第一百頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二環(huán)形重組質(zhì)粒質(zhì)粒自我連接線性載體或DNA片斷進入細菌會被降解。①環(huán)形質(zhì)粒數(shù)（1）重組質(zhì)粒5.影響轉(zhuǎn)化率的因素第一百零一頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二①生長狀態(tài)制備感受態(tài)菌必須使用對數(shù)生長期的菌。②必須在冰冷的條件下制備。要充分，使細菌細胞膜失去一些蛋白。④儲存感受態(tài)菌要在-70℃以下。③CaCl2處理⑤使用感受態(tài)菌時必須迅速融化。融化后一般不能再次凍存使用。（2）感受態(tài)細胞（competentcells)

第一百零二頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二把重組的噬菌體DNA或Cosmid質(zhì)粒DNA包裝成具有感染能力的噬菌體顆粒。6.體外包裝的噬菌體的轉(zhuǎn)導(dǎo)（1）體外包裝（invitropackaging）（2）轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）通過受體菌細胞表面的DNA接受器位點（receptorsite)，使帶有外源基因的重組體DNA注入受體大腸桿菌進行擴增。第一百零三頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二cI857基因是個溫度敏感性阻遏蛋白基因，感染細菌后，在32℃下培養(yǎng)細菌時能夠保持溶源性。但當溫度升高到44℃-45℃時，就會導(dǎo)致cI基因編碼的阻遏蛋白失活，DNA復(fù)制、外殼蛋白合成。便于提取外殼蛋白。（3）cI857基因突變的噬菌體

但由于該噬菌體的S基因上有一個突變，所以細菌還不裂解。第一百零四頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二cI857其它基因溶源狀態(tài)（DNA不轉(zhuǎn)錄、不翻譯）DNA阻遏蛋白阻遏蛋白44℃-45℃DNA轉(zhuǎn)錄、翻譯合成外殼蛋白32℃第一百零五頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二噬菌體1外殼蛋白基因E發(fā)生了無義突變，不能合成頭部蛋白，但能合成其它外殼蛋白（尾部蛋白）。在cI857基因突變的噬菌體的基礎(chǔ)上，選擇兩種外殼蛋白的突變型噬菌體。（4）互補型噬菌體

外殼蛋白基因D發(fā)生了無義突變，不能合成頭部的包裝識別蛋白，但能合成其它外殼蛋白（頭部、尾部蛋白）。噬菌體2第一百零六頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期二(5)體外包裝過程

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