生化技術(shù)蛋白質(zhì)酶抗體標(biāo)記

關(guān)于生化技術(shù)蛋白質(zhì)酶抗體標(biāo)記第一頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二標(biāo)記的概念

指以共價(jià)鍵的方式將放射性元素（如3H、14C、32P、35S、125I）或非放射性物質(zhì)（如地高辛、生物素、酶、熒光素）結(jié)合到某些生命物質(zhì)（如DNA、RNA、寡核苷酸、抗體、抗原及某些小分子物質(zhì)）上的過(guò)程

標(biāo)記技術(shù)已在序列測(cè)定、分子雜交、免疫分析等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用；主要用于生命物質(zhì)的定性、定量由示蹤物和被標(biāo)記物構(gòu)成的復(fù)合物稱(chēng)為探針或某物的標(biāo)記物第二頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二第一節(jié)核酸標(biāo)記第三頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二核酸標(biāo)記是指能與特定核酸序列（靶序列）發(fā)生特異性互補(bǔ)（雜交），并含示蹤物的已知核酸片段（DNA或RNA）第四頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二一、標(biāo)記物的制備及類(lèi)型20C，70Y磷酸化法切口平移法廣泛用于分子克隆過(guò)程；

缺點(diǎn)：①只能在核酸的5’端引進(jìn)一個(gè)放射性原子，會(huì)限制探針的比活度②探針含有模板DNA雙鏈序列片段，在某些情況下，探針的互補(bǔ)鏈會(huì)競(jìng)爭(zhēng)靶DNA與探針的結(jié)合20C，80Y中期體外轉(zhuǎn)錄RNA探針?lè)ù朔ê铣尚矢?，不需分離模板DNA，但應(yīng)避免RNase污染(一)制備方法第五頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二(二)核酸標(biāo)記類(lèi)型(同位素)核素標(biāo)記通常采用的同位素有32P、33P、35S，其中32P活性強(qiáng)，信號(hào)比較好放射性探針與固相載體上的靶核酸雜交后，洗滌除去未雜交的探針，再通過(guò)X-射線衍射和放射自顯影檢測(cè)分析結(jié)果（但此法須在特殊實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，防止同位素傷人）非同位素標(biāo)記以生物素、地高辛和熒光素等非核素為示蹤物，采用發(fā)光法或生色法檢測(cè)（此法靈敏度與核素標(biāo)記相仿，但無(wú)核素污染問(wèn)題，已成為標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)）第六頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二二、非核素標(biāo)記

生物素、地高辛等非放射性示蹤物都很容易摻入到DNA或RNA中制成核酸探針。其信號(hào)可采用熒光染料、堿性磷酸酶、辣根過(guò)氧化物酶直接與生物素偶聯(lián)，或用熒光染料、堿性磷酸酶與抗地高辛抗體偶聯(lián)進(jìn)行檢測(cè)此法標(biāo)記量足（一次反應(yīng)可標(biāo)記數(shù)mg），穩(wěn)定性好（有效期可達(dá)2年）第七頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二（一）地高辛（DIG）1.雙鏈DNA探針標(biāo)記①隨機(jī)引物介導(dǎo)法隨機(jī)引物：不均一的寡核苷酸混合物（6~12核苷酸單鏈DNA）模板：?jiǎn)捂淒NA酶：DNA-pol（klenow片段）合成原料：dNTP混合物標(biāo)記物：Dig-dUTP其他試劑第八頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二隨機(jī)引物介導(dǎo)法是將線性DNA模板上多處與隨機(jī)引物雜交，在DNA-pol的催化作用下，新鏈中摻入DIG-dUTP,從而提高標(biāo)記的靈敏度（高效、高靈敏度）

試劑及操作（課本）第九頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二第十頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二②切口平移法原理：當(dāng)雙鏈DNA分子的一條鏈有切口時(shí)，E.coli-DNA-polⅠ可將核苷酸殘基（如Dig-11-dUTP）加到切口處的3’-OH端；又由于該酶具有5’→3’外切酶活性，所以它可從切口的5’端除去核苷酸。5’端除去和3’端加入核苷酸同時(shí)進(jìn)行，導(dǎo)致切口沿著DNA模板鏈移動(dòng)第十一頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二第十二頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二2.單鏈DNA探針制備單鏈DNA探針的優(yōu)點(diǎn)不存在互補(bǔ)雙鏈，避免了DNA雙鏈在重新復(fù)性時(shí)形成無(wú)效雜交體的可能性方法①合成可克隆于噬菌粒或M13噬菌體載體上的DNA片段，并以其作為模板合成與其互補(bǔ)的探針（為DNA）②將克隆于特定載體（帶有可被噬菌體依賴(lài)于DNA的RNA-pol識(shí)別的啟動(dòng)子）上的靶序列轉(zhuǎn)錄成RNA探針；再在反轉(zhuǎn)錄酶的催化作用下制備cDNA探針

方法①需分離探針和未標(biāo)記的核酸，而方法②只需用不含RNase的DNase降解即可；故克隆DNA片段的體外轉(zhuǎn)錄法是合成單鏈DNA探針的較好方法第十三頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二3.PCR合成DNA探針第十四頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二第一次循環(huán)之前于95℃變性7min，隨后每次循環(huán)的條件是：95℃變性45s，60℃退火1min,72℃延伸2min（一個(gè)循環(huán)）用PCR法制備的DIG探針靈敏度高（即使含有很少量的副產(chǎn)物，也會(huì)明顯影響雜交的特異性；所以在雜交之前，要用凝膠電泳純化探針），數(shù)量大第十五頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二4.寡核苷酸探針的制備用DIG-11-ddUTP制備寡核苷酸探針，制備出來(lái)的探針有3’端-、5’端-寡核苷酸標(biāo)記和3’-端尾部寡核苷酸標(biāo)記之分第十六頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二（1）3’端-寡核苷酸探針第十七頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二（2）3’-端尾部寡核苷酸探針第十八頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二

在寡核苷酸3’-端加上10~100個(gè)堿基的尾巴。可提高探針的靈敏度在標(biāo)記過(guò)程中，末端轉(zhuǎn)移酶可將DIG-11-dUTP加到寡核苷酸的3’-尾端但探針的尾巴加長(zhǎng)，可能會(huì)產(chǎn)生非特異性反應(yīng)。所以在雜交之前，通過(guò)一競(jìng)爭(zhēng)序列（如polyA序列等）“預(yù)雜交”，或者改變?cè)O(shè)計(jì)條件等措施可降低非特異性反應(yīng)（如P201“b”）第十九頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二（3）5’端-寡核苷酸探針在合成待標(biāo)記寡核苷酸至最后一步時(shí)，按固相氨基磷酸鹽法，使5’端氨基化，將用氨水處理載體釋放的寡核苷酸與DIG反應(yīng)制成標(biāo)記于5’端的寡核苷酸探針第二十頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二5.RNA探針的制備采用體外轉(zhuǎn)錄法制備①先克隆合適的模板DNA到相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄載體（如噬菌體）②將得到的重組DNA線性化③RNA-pol催化核苷三磷酸在強(qiáng)啟動(dòng)子下游固定位點(diǎn)開(kāi)始轉(zhuǎn)錄，并將修飾的核苷酸（如DIG-UTP）摻入到RNA鏈中，從而獲得具有一定長(zhǎng)度和較高活性的RNA探針（每20~25個(gè)核苷酸可結(jié)合一個(gè)DIG-11-UTP）第二十一頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二第二十二頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二（二）生物素用生物素標(biāo)記的探針與靶核酸雜交后，探針上的生物素能與鏈霉菌親和素（或稱(chēng)鏈霉菌白蛋白）-酶直接結(jié)合，親和素與生物素的結(jié)合力強(qiáng)（結(jié)合常數(shù)）；這類(lèi)蛋白質(zhì)有4個(gè)結(jié)合生物素的位點(diǎn)，所以它既可與酶標(biāo)記的生物素結(jié)合，又可以與探針中的生物素結(jié)合第二十三頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二第二十四頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二1.切口平移法制備生物素?；奶结槾朔ú捎蒙锼?11-dUTP制備探針，每1kbDNA可摻入約50個(gè)生物素分子第二十五頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二2.隨機(jī)引物介導(dǎo)法制備生物素?；结樀诙?yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二（三）兩種新標(biāo)記法掃若侖標(biāo)記和分子燈塔探針第二十七頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二1.掃若侖標(biāo)記掃若侖（psoralen）是一種天然的三環(huán)化合物，其帶有胺活性基團(tuán)衍生物可用來(lái)標(biāo)記多種核酸（如DNA、RNA、PCR產(chǎn)物和寡核苷酸等）。用其制成的探針靈敏度高（可達(dá)fg級(jí)別）

掃若侖標(biāo)記為非酶促反應(yīng)，是用波長(zhǎng)320~400nm的紫外光照射，引起光循環(huán)反應(yīng)，使帶胺基的掃若侖以三環(huán)平面形式插入核酸分子，并以共價(jià)鍵結(jié)合形成探針，DNA和RNA時(shí)，共價(jià)鍵結(jié)合的位置分別在dT和U處；探針中掃若侖衍生物的含量與核酸中胸苷（dT

）或尿苷（U）的含量成正比關(guān)系第二十八頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二第二十九頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二2.分子燈塔探針概念用新的非核素化合物標(biāo)記，用于檢測(cè)特別序列核酸的核酸探針特征①由25個(gè)核苷酸組成②燈中間環(huán)形的15個(gè)核苷酸與靶DNA是互補(bǔ)序列；燈竿一端的5個(gè)核苷酸與另一端的5個(gè)核苷酸是互補(bǔ)③在5’和3’端分別耦合一種熒光素（發(fā)光劑）和非熒光素（熄滅劑）第三十頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二第三十一頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二分子燈塔探針的熄滅劑可吸收發(fā)光劑發(fā)射的能量。在室溫條件下，分子燈塔的構(gòu)型可確保發(fā)光劑和熄滅劑緊密互補(bǔ)結(jié)合，致使熒光基團(tuán)處于熄滅狀態(tài)，無(wú)熒光產(chǎn)生；一旦當(dāng)燈塔探針的15個(gè)核苷酸與靶DNA或RNA序列雜交時(shí)，其發(fā)光劑和熄滅劑便相互分離，產(chǎn)生熒光第三十二頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二三、核素標(biāo)記標(biāo)記核酸的核素有32P、33P、35S和3H。其中32P是制備高比活度放射性探針常用的一種同位素；33P比32P使用安全；35S能量低，不會(huì)引起核酸損傷，常用于制備穩(wěn)定的比活度低的探針，但對(duì)許多酶的活性有影響；3H標(biāo)記的探針常用于原位雜交、核酸的合成和降解分析由于不同放射性同位素對(duì)人體傷害和環(huán)境污染程度不同，因此實(shí)際操作時(shí)根據(jù)檢測(cè)要求結(jié)合實(shí)驗(yàn)室條件選擇相應(yīng)的標(biāo)記方法第三十三頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二（一）雙鏈DNA探針1.切口平移法原理類(lèi)似于非核素DIG標(biāo)記中的切口平移法，所不同的是，此處用高放射活性標(biāo)記的核苷酸置換原來(lái)的核苷酸操作要點(diǎn)將DNase和E.coli-DNA-polⅠ催化的反應(yīng)分開(kāi)進(jìn)行，這樣可避免DNase在聚合反應(yīng)過(guò)程中降解DNA第三十四頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二第三十五頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二2.隨機(jī)引物介導(dǎo)法方法與DIG-隨機(jī)引物介導(dǎo)法制備DNA探針相似，即用DNase水解小牛胸腺DNA（或鮭魚(yú)精DNA），產(chǎn)生6~12核苷酸的單鏈DNA或隨機(jī)6聚合體核苷酸的混合物作為引物；以變性的閉環(huán)DNA或線性DNA作為模板，在klenow片段的催化作用下，介導(dǎo)產(chǎn)生DNA探針?lè)譃橛坞xDNA片段為模板和固定DNA片段為模板制備探針第三十六頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二（1）以游離DNA片段為模板制備探針模板DNA用限制性?xún)?nèi)切酶消化，電泳純化或乙醇沉淀后，與其他試劑混合制備探針第三十七頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二（2）以固定DNA片段為模板制備探針DNA經(jīng)電泳后，用EB染色，切下DNA色帶，加水后沸水浴使其變性，然后37℃（固定），再加其他試劑室溫或37℃制備探針第三十八頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二（二）RNA探針的制備（體外轉(zhuǎn)錄法）第三十九頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二四、標(biāo)記物純化標(biāo)記物純化就是除去未標(biāo)記的同位素或非同位素產(chǎn)物并非所有探針都需純化，通常用于膜雜交的探針不需純化，而用于原位雜交的探針則需要純化。常用的純化方法有萃取/沉淀法、層析法、離心法和電泳法等第四十頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二（一）EtOH沉淀法①加1μl糖原溶液（20mg/ml）到含探針的試管中，混勻②加2~3倍體積冷EtOH，低溫沉淀，離心分離沉淀，并用少量70%冷EtOH洗滌③干燥的沉淀物溶于TE緩沖液中，低溫貯存第四十一頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二（二）層析法SepharoseCL-4B柱層析層析結(jié)果用PAGE檢測(cè)SephadexG-50或G-25柱層析第四十二頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二五、探針的鑒定主要鑒定探針的長(zhǎng)度、示蹤物的摻入率及特異性（一）雜交法用靶DNA或RNA鑒定探針的特異性根據(jù)示蹤物的性質(zhì)，采取相應(yīng)方法（如熒光、化學(xué)發(fā)光、酶聯(lián)免疫等）檢測(cè)其含量根據(jù)凝膠電泳Rf值檢測(cè)探針長(zhǎng)度第四十三頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二（二）酸沉淀法

主要用于測(cè)定放射性核素標(biāo)記的探針，檢測(cè)放射性核素的摻入率。原理：先用強(qiáng)酸（如冰乙酸）沉淀探針（與前體dNTP、NTP分離），再測(cè)定其放射性強(qiáng)度；根據(jù)放射性強(qiáng)度計(jì)算放射性核素的摻入率第四十四頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二（三）色譜法如用DIG標(biāo)記的探針其酯溶性增強(qiáng)，可用RP-HPLC分離檢測(cè)?第四十五頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二（四）比色法根據(jù)標(biāo)記物在某條件下能呈色的性質(zhì)，采取相應(yīng)的顯色劑顯色后，比色第四十六頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二（五）發(fā)光法先用紫外照射法將靶DNA交聯(lián)到膜（如尼龍膜）上，再使探針DNA或RNA與交聯(lián)到膜上的DNA雜交，封藏，至暗室中暴光，用合適的X線片接收，并用圖像儀對(duì)印記斑點(diǎn)進(jìn)行掃描第四十七頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二第二節(jié)蛋白質(zhì)(酶、抗體)標(biāo)記

第四十八頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二

通常抗體與抗原、酶與底物、激素與受體等物質(zhì)之間發(fā)生的特異反應(yīng)，其結(jié)果通常不能從檢測(cè)儀上直接讀出或者用肉眼查覺(jué)，一般都需要借助發(fā)色、發(fā)光試劑，或者同位素、酶試劑標(biāo)記產(chǎn)生具有高度專(zhuān)一性的探針來(lái)判斷第四十九頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二目的掌握蛋白質(zhì)的常見(jiàn)標(biāo)記物的種類(lèi)及標(biāo)記方法掌握核素和非核素標(biāo)記第五十頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二一、標(biāo)記方法

抗體（IgG）或蛋白質(zhì)的標(biāo)記方法包括

酶標(biāo)記、熒光標(biāo)記、生物素標(biāo)記、有色金屬標(biāo)記等第五十一頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二

1、酶標(biāo)記

常用于標(biāo)記抗體的酶

辣根過(guò)氧化酶(HRP)堿性磷酸酶(AKP)半乳糖苷酶(galactosidase)由抗體-酶制成的偶聯(lián)體(或稱(chēng)特異性探針)的用途：ELISA、免疫印跡、細(xì)胞和組織化學(xué)免疫染色第五十二頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二

(1)辣根過(guò)氧化酶(HRP)抗體偶聯(lián)

A

過(guò)碘酸鹽(periodate)法

B

戊二醛(glutaricdialdehyde)法

原理：HRP是一種糖蛋白，糖鏈部分無(wú)活性，其己糖鄰位-OH可被堿性過(guò)碘酸鹽氧化成醛基，并與IgG中游離-NH2共價(jià)結(jié)合成HRP-IgG偶聯(lián)物。此酶標(biāo)抗體可直接使用，或凝膠過(guò)濾純化后使用（是制備酶標(biāo)抗體的有效方法）原理：先將戊二醛偶聯(lián)到HRP，用凝膠過(guò)濾除去多余的戊二醛，再與IgG偶聯(lián)；制成的的HRP-IgG偶聯(lián)物需純化分離后使用

第五十三頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二(2)堿性磷酸酶(AKP)抗體偶聯(lián)

原理：戊二醛一步法，即通過(guò)戊二醛將AKP與IgG偶聯(lián)成酶標(biāo)抗體此法偶聯(lián)效果好，酶活性較高；但偶聯(lián)時(shí)需用高濃度的酶和抗體；成品需在有抑菌劑（如NaN3等）存在的條件下保存第五十四頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二

(3)半乳糖苷酶抗體偶聯(lián)

A戊二醛一步法

將IgG與β-半乳糖苷酶按一定比例溶解于PBS溶液中，透析后加入戊二醛偶聯(lián)BMBS法

MBS（間位-馬來(lái)酰胺苯-N-羥基琥珀酰亞胺酯）為一種雙功能試劑，可連接帶-NH2或含-Cys的蛋白質(zhì)。由于IgG不含-Cys，故先讓MBS與IgG

的游離-NH2偶聯(lián)，經(jīng)透析除去游離的MBS后，IgG-MBS再與β-半乳糖苷酶偶聯(lián)第五十五頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二

(4)HRP與抗-磷酸酪氨酸抗體偶聯(lián)

是將HRP偶聯(lián)到抗-磷酸酪氨酸抗體上，制成的酶標(biāo)抗體；可直接檢測(cè)蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化情況第五十六頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二

2、熒光染料標(biāo)記

常見(jiàn)的熒光染料熒光素(nuorescien)、羅丹明(rhodamine)、德克薩斯紅(texasred)、藻紅朊(rhycoerythrin，PE)、四甲基羅丹明(tetramethylrho-damine)熒光染料標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)標(biāo)記抗體或蛋白質(zhì)后會(huì)增加發(fā)色強(qiáng)度、縮小波長(zhǎng)范圍，為直接觀察創(chuàng)造了條件第五十七頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二(2)二氯三嗪基氨基熒光素（DTAF)-抗體偶聯(lián)(3)CyDye熒光染料-抗體偶聯(lián)特點(diǎn)：①熒光染料可直接與二抗偶聯(lián)，不需要反應(yīng)底物

②CyDyeULS標(biāo)記的核苷酸和切口轉(zhuǎn)移試劑盒，使用CyDyeTM熒光染料可以直接標(biāo)記PCR產(chǎn)物采用熒光染料制備熒光素-抗體偶聯(lián)的探針的方法

(1)異硫氰酸鹽衍生物-抗體偶聯(lián)異硫氰酸熒光素（FTTC）、羅丹明異硫氰酸鹽和四甲基羅丹明異硫氰酸（TRITC）第五十八頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二

3、生物素標(biāo)記生物素標(biāo)記的特點(diǎn)蛋白質(zhì)(如酶和抗體)與小分子生物素偶聯(lián)后，并不會(huì)改變其生物活性，反而可提高檢測(cè)靈敏度

第五十九頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二

(1)生物素標(biāo)記抗體一般先將生物素制備成生物素琥珀酰亞胺酯（可直接購(gòu)買(mǎi)），然后與IgG按一定比例反應(yīng)標(biāo)記

第六十頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二(2)生物素標(biāo)記蛋白質(zhì)

常用于標(biāo)記蛋白質(zhì)的生物素衍生物及標(biāo)記原理①生物素-羥基琥珀酰亞胺（BNHS）在堿性條件下，可將生物素與蛋白質(zhì)的α-NH2偶聯(lián)；也可用于標(biāo)記抗體、激素，或其他含Lys殘基的多肽。此法制備的標(biāo)記物穩(wěn)定，標(biāo)記效率高②生物素馬來(lái)酰亞胺

適用于含Lys殘基或含-SH的蛋白質(zhì)的標(biāo)記馬來(lái)酰亞胺通過(guò)提供間隔臂使生物素與蛋白質(zhì)結(jié)合③生物素肼通過(guò)碳二亞胺（縮合劑）將生物素標(biāo)記到蛋白質(zhì)或肽的Asp或Glu的-COOH上第六十一頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二生物素標(biāo)記蛋白質(zhì)的操作

試劑：生物素酰氨基己酸N-羥基琥珀亞胺酯；

間隔臂-氨基己酸操作：所有的試劑要在用時(shí)配制，生物素衍生物是溶在重蒸的DMF（二甲基甲酰胺）或DMSO（二甲亞砜）第六十二頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二4、金標(biāo)記原理借助金粒的電子密度特征，用其與抗體偶聯(lián)后，可成功地置顯微鏡下觀察膠體金顆粒分類(lèi)及用途一般分為三種：5nm、l0nm和20nm5nm粒子容易滲透到細(xì)胞膜，使細(xì)胞間染色，適用于電子顯微鏡準(zhǔn)確定位抗原l0nm粒子較大，可使細(xì)胞表面染色，適用于光學(xué)顯微鏡觀察20nm粒子可用于免疫印跡和某些細(xì)胞和組織化學(xué)免疫染色第六十三頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二簡(jiǎn)要操作

(1)制備抗體

以相應(yīng)抗原作為配體，與CNBr活化的Sepharose-4B偶聯(lián)制成的親和吸附劑，裝柱后用于分離純化抗體(2)制備金粒

①5nm金粒a．用100％二乙酯(diethylether)制備飽和磷(phosphorus)溶液(A)(Merck)，然后將棒狀磷保存在水中并切成小段，迅速轉(zhuǎn)移到10ml100％二乙酯中，密封2h以上b．離心收集固體部分，用1份溶液A與4份酯混合(溶液B)，同時(shí)制備1％HAuCl4(氯金酸鹽)，用0.22μm濾膜過(guò)濾c．在裝有冷凝迥流管的長(zhǎng)頸燒瓶中，加3mlHAuCl4溶液、240mlH2O，混勻后，加5.4mlK2C03溶液調(diào)pH到9.0d．在攪拌下，加2ml溶液B到HAuCl4溶液中，于室溫緩慢混合15mine．加熱迥流，除去二乙酯，冷卻到4℃，制備的膠體金溶液可使用兩星期第六十四頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二②12nm金粒在快速攪拌下，加10ml0.07％抗壞血酸溶液到一混合溶液(1mll％HAuCl4，1.5m10.2mol／LK2CO3和25mlH2O中，然后補(bǔ)加蒸餾水到100ml，除抗壞血酸鈉溶液外，其余溶液都要經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾③17~20nm金粒制備4％HAuCl4儲(chǔ)備液(Merck)，經(jīng)0．22μm濾膜過(guò)濾后，取0.5ml4％HAuCl4溶液加到200ml水(終濃度0.01％)中，煮沸，然后加6ml1％檸檬酸鈉溶液，加熱迥流0.5h，冷卻到4℃，該膠體金溶液使用時(shí)間同上④40nm金粒制備方法同上，僅僅是將1％檸檬酸鈉溶液用量由6ml改為3ml第六十五頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二(3)膠體金與抗體的連接①抗體將抗體溶液(1mg/ml)對(duì)2mmol／L硼酸緩沖液(pH9.0)透析，離心(100000g，1h，4℃，收集上清液立即與膠體金偶聯(lián)(用不同稀釋度抗體溶液與膠金偶聯(lián)，以確定最佳濃度)②膠體金膠體金溶液經(jīng)離心[3000g，15min(收集5~12nm粒子)；500g，15min(收集20~40nm粒子)]后，取5ml上清液[pH(已用0.2mol／LK2CO3調(diào)節(jié))與偶聯(lián)抗體pI相近，用抗血清作偶聯(lián)物時(shí)，其pH≈9.0]與0.5ml抗體溶液迅速混合lmin，加100μl10％NaCl溶液，5min后，測(cè)定A280，以確定最佳抗體量③偶聯(lián)將0.5mL抗體溶液(約0.5mg／ml)與5ml膠體金溶液(pH已調(diào))迅速混勻，2min后，加10％BSA溶液(pH=9.0)，令其終濃度為10％，靜置15~30min，離心[60000g，1h(5~12nm粒子)；14000g，1h(20-40nm粒子)]，獲得抗體-膠體金偶聯(lián)物④洗滌在偶聯(lián)物中加含1％BSA的20mmol／LTris緩沖液(pH8.2，經(jīng)0.22gm濾膜過(guò)濾)，平衡洗滌15~30min，重復(fù)離心，最終得到懸于1％BSA溶液的抗體-膠體金懸液(加0.02mol／LNaN3)，測(cè)定A520。不同懸粒如40nm、20nm和5nm的懸浮液A值應(yīng)分別控制在0.35、0.5和0.25。該法的標(biāo)記率為70％~80％第六十六頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二二、核素和非核素標(biāo)記

許多蛋白質(zhì)在合成過(guò)程或合成之后可通過(guò)修飾或標(biāo)記生成磷酸化蛋白質(zhì)，這種蛋白對(duì)某些功能起到敏感可逆的調(diào)節(jié)作用。在真核細(xì)胞中，細(xì)胞的增殖、分化、周期調(diào)控、信號(hào)傳導(dǎo)和代謝過(guò)程都受制于蛋白激酶和磷酸酶活性的平衡。如用核素和非核素標(biāo)記探針聯(lián)合檢測(cè)環(huán)化激酶(cycledependentkinases，CDK)磷酸化和脫磷酸化的反應(yīng)，可以深刻地認(rèn)識(shí)細(xì)胞周期的調(diào)控過(guò)程。近十年深入研究也為揭示腫瘤細(xì)胞的增殖機(jī)理和藥物治療提供了不少理論依據(jù)。胞外配體(如多肽生長(zhǎng)因子)、胞內(nèi)信號(hào)傳遞因子(如cAMP）以及鈣離子的濃度與相應(yīng)蛋白激酶的密切關(guān)系都是受蛋白質(zhì)磷酸化作用調(diào)節(jié)控制的。這部分將重點(diǎn)介紹如何通過(guò)檢測(cè)激酶或磷酸化酶來(lái)確定蛋白質(zhì)磷酸化反應(yīng)，如何用標(biāo)記探針來(lái)鑒定蛋白質(zhì)磷酸化第六十七頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二32P、33P、3H、14C和125I等物質(zhì)都可用于標(biāo)記蛋白質(zhì)

1、核素標(biāo)記第六十八頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二(1)32p正磷酸鹽(orthophosphate)原理通過(guò)體內(nèi)生物合成法來(lái)標(biāo)記酶或蛋白質(zhì)操作用HRP標(biāo)記抗-磷酸酪氨酸抗體的試劑，并直接檢測(cè)蛋白質(zhì)的酪氨酸磷酸化①材料

表皮生長(zhǎng)因子(EGF)刺激A431細(xì)胞株激活酪氨酸激酶，并使其受體上的酪氨酸發(fā)生磷酸化作用，用未刺激的A431細(xì)胞株作對(duì)照第六十九頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二

②操作A.免疫沉淀細(xì)胞萃取溶液用抗-EGFR抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)1h，然后將EGFR／抗-EGFR抗體復(fù)合物在蛋白質(zhì)G-瓊脂糖凝膠進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)B.分離抗體復(fù)合物經(jīng)SDS(8％)分離后，轉(zhuǎn)移抗體復(fù)合物到PVDF膜上C.印記檢測(cè)按蛋白質(zhì)印跡法操作，用HRP-抗-磷酸酪氨酸抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)后，再與發(fā)光底物ECL反應(yīng)，接著置感光片上，曝光5min檢測(cè)，結(jié)果表明在EGF刺激的細(xì)胞中EGF受體酪氨酸磷酸化的數(shù)量明顯升高

第七十頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二(2)[Υ32P]或[Υ32P]-ATP

原理它們是通過(guò)體外生物合成使蛋白質(zhì)磷酸化和脫磷酸化的操作程序第七十一頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二(3)3H、14C或125I

原理它們可以標(biāo)記到底物，通過(guò)檢測(cè)由底物生成產(chǎn)物的量，即可換算出相應(yīng)激酶的活性(體外檢測(cè))

示意圖底物+ATP產(chǎn)物+ADP

激酶

(4)其他核素

35S蛋氨酸、35S半胱氨酸或者3H-亮氨酸等

第七十二頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二2、非核素標(biāo)記

許多蛋白質(zhì)的絲氨酸和蘇氨酸可以磷酸化，而不少與信號(hào)傳遞有關(guān)的蛋白質(zhì)磷酸化又多發(fā)生在酪氨酸上?，F(xiàn)在已有抗-磷酸絲氨酸、抗—磷酸蘇氨酸和抗-磷酸酪氨酸的抗體商品，其特異性較強(qiáng)，靈敏度較高。用這類(lèi)抗體進(jìn)行免疫印跡試驗(yàn)就能便捷地檢測(cè)出它們的磷酸化程度。在SDS中，由于磷酸化與未磷酸化蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同，所以致使它們二者的遷移率出現(xiàn)差異。將溫育的與未溫育的磷酸化蛋白質(zhì)(酶)和磷酸酶反應(yīng)液進(jìn)行SDS，從蛋白質(zhì)(酶)遷移率的變化可以推論蛋白質(zhì)(酶)磷酸化的程度。此法在采用效率很差32P-ATP或33P-ATP標(biāo)記時(shí)，尤為適用，其操作詳見(jiàn)應(yīng)用實(shí)例第七十三頁(yè)，共七十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二3、關(guān)于樣品分析的若干問(wèn)題(1)SDS處理細(xì)胞(2)蛋白酶抑制劑(3)酶或蛋白質(zhì)的免疫沉淀(4)磷酸酶消化(5)標(biāo)記磷酸氨基酸的鑒定(6)體外酶活性測(cè)定第七十四頁(yè)，共七十九頁(yè)