新一代測(cè)序技術(shù)solid

基對(duì)），前面堿基的顏色編碼直接影響緊跟其后堿基的解碼，所以一個(gè)錯(cuò)誤顏色編碼就會(huì)引起“連鎖解碼錯(cuò)誤”，改變錯(cuò)誤顏色編碼之后的所有堿基。和其它所有測(cè)序儀一樣，測(cè)序錯(cuò)誤在所難免，關(guān)鍵是對(duì)測(cè)序錯(cuò)誤的評(píng)價(jià)和后續(xù)處理。由于SOLiD系統(tǒng)采用了雙堿基編碼技術(shù)，在測(cè)序過(guò)程中對(duì)每個(gè)堿基判讀兩遍，從而減少原始數(shù)據(jù)錯(cuò)誤，提供內(nèi)在的校對(duì)功能。這樣，雙保險(xiǎn)確保了SOLiD系統(tǒng)原始?jí)A基數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度大于%，而在15X覆蓋率時(shí)的準(zhǔn)確度可以達(dá)到%，是目前新一代基因分析技術(shù)中準(zhǔn)確度最高的。為避免“連鎖解碼錯(cuò)誤”的發(fā)生，SOLiD數(shù)據(jù)分析軟件不直接將SOLiD原始顏色序列解碼成堿基序列，而是依靠reference序列進(jìn)行后續(xù)數(shù)據(jù)分析。SOLiD序列分析軟件首先根據(jù)“雙堿基編碼矩陣”把reference堿基序列轉(zhuǎn)換成顏色編碼序列，然后與SOLiD原始顏色序列進(jìn)行比較，來(lái)獲得SOLiD原始顏色序列在reference的位置，及兩者的匹配性信息。Reference轉(zhuǎn)換而成的顏色編碼序列和SOLiD原始序列的不完全匹配主要有兩種情況：“單顏色不匹配”和“兩連續(xù)顏色不匹配”。由于每個(gè)堿基都被獨(dú)立地檢測(cè)兩次，且SNP位點(diǎn)將改變連續(xù)的兩個(gè)顏色編碼，所以一般情況下SOLiD將單顏色不匹配處理成測(cè)序錯(cuò)誤，這樣一來(lái)，SOLiD分析軟件就完成了該測(cè)序錯(cuò)誤的自動(dòng)校正；而連續(xù)兩顏色不匹配也可能是連續(xù)的兩次測(cè)序錯(cuò)誤，SOLiD分析軟件將綜合考慮該位置顏色序列的一致性及質(zhì)量值來(lái)判斷該位點(diǎn)是否為SNP。在初步了解了SOLiD系統(tǒng)的工作原理之后，我們才能明白它的魅力所在。系統(tǒng)可擴(kuò)展性SOLiD系統(tǒng)采用開(kāi)放玻片式的結(jié)構(gòu)，使用包被DNA樣品的微珠來(lái)輸入基因組信息。微珠密度并不是一成不變的，系統(tǒng)支持更高密度的微珠富集。開(kāi)放式玻片形式、微珠富集、以及軟件算法的結(jié)合，能使平臺(tái)輕松升級(jí)到更高的通量，而無(wú)需對(duì)基礎(chǔ)技術(shù)和配置做重大改變。這也是SOLiD系統(tǒng)平均每季度將通量擴(kuò)大一倍的原因所在。無(wú)以倫比的通量目前SOLiD3系統(tǒng)單次運(yùn)行能產(chǎn)生50GB的人基因組序列數(shù)據(jù)，相當(dāng)于基因組的17倍覆蓋度，這顯然是其他任一臺(tái)新一代測(cè)序系統(tǒng)都無(wú)法達(dá)到的。今年初，ABI公司和貝勒醫(yī)學(xué)院人類基因組測(cè)序中心（HGSC）的科學(xué)家總結(jié)了他們?cè)谇嘶蚪M計(jì)劃首次數(shù)據(jù)發(fā)布中的貢獻(xiàn)。作為商業(yè)參與者以及與HGSC共同協(xié)作，ABI公司利用SOLiD系統(tǒng)產(chǎn)生了超過(guò)460GB可作圖的序列數(shù)據(jù)，比這兩個(gè)機(jī)構(gòu)的預(yù)定目標(biāo)高出了65%。而通量的升高也有望進(jìn)一步降低基因組測(cè)序的費(fèi)用，成本只需1萬(wàn)美元的人類基因組測(cè)序指日可待。最大的靈活性SOLiD3系統(tǒng)具有兩個(gè)獨(dú)立的流動(dòng)室，讓用戶能在一臺(tái)SOLiD分析儀中運(yùn)行兩個(gè)完全獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)——同時(shí)提供兩套儀器。玻片也能分成1個(gè)、4個(gè)或8個(gè)小室。而20個(gè)條形碼序列則提供了額外的靈活性，顯著增加了定向重測(cè)序、表達(dá)和ChIP分析的經(jīng)濟(jì)性。目前最多能同時(shí)運(yùn)行320個(gè)樣品（2×8×20）。至此，SOLiD系統(tǒng)已不再是一臺(tái)單純的測(cè)序儀，而是成為功能更全面的基因分析儀。除了測(cè)序和重測(cè)序，還能進(jìn)行全基因表達(dá)圖譜分析、SNP、microRNA、ChIP、甲基化等多種分析。全基因表達(dá)圖譜分析芯片大概是目前應(yīng)用最廣泛的從全局角度分析基因表達(dá)整體模式的方法。然而，基于雜交技術(shù)的微陣列技術(shù)只限用于已知序列，無(wú)法檢測(cè)新的mRNA；而且雜交技術(shù)靈敏度有限，難以檢測(cè)低豐度的目標(biāo)（需要更多的樣品量），難以檢測(cè)重復(fù)序列；也無(wú)法捕捉到目的基因表達(dá)水平的微小變化而這恰恰是研究在刺激下或環(huán)境變化時(shí)的生物反應(yīng)所必需的。與芯片技術(shù)相比，基于測(cè)序的高靈敏SOLiD技術(shù)可對(duì)單個(gè)細(xì)胞和癌癥樣品中存在的痕量RNA進(jìn)行整體的全基因組表達(dá)圖譜分析，每次運(yùn)行能定位高達(dá)2億4千萬(wàn)個(gè)標(biāo)簽（mRNA的相對(duì)表達(dá)水平可通過(guò)系統(tǒng)產(chǎn)生的序列標(biāo)簽數(shù)目來(lái)計(jì)算），可檢測(cè)低至每個(gè)細(xì)胞中10-40pg的總RNA，即使mRNA表達(dá)水平很低，SOLiD系統(tǒng)也能夠無(wú)偏向性地分析樣品中存在的已知和未知mRNA，從而定量特定mRNA的差異表達(dá)模式。起始樣品比微陣列技術(shù)要少得多，尤其適用于來(lái)源極為有限的生物樣品分析，如癌癥干細(xì)胞分析其基因和非編碼RNA的表達(dá)圖譜有助于有助于加速發(fā)掘潛在的生物標(biāo)志物，從而更準(zhǔn)確區(qū)分不同的疾病類型以及識(shí)別疾病易感性，幫助于研究人員更好地了解病變細(xì)胞的特性。更多RNA研究除了單細(xì)胞基因表達(dá)圖譜分析，SOLiD系統(tǒng)在RNA方面的其他應(yīng)用還包括利用SOLiDSmallRNAExpressionKit來(lái)發(fā)現(xiàn)和篩選小分子RNA，實(shí)現(xiàn)在無(wú)需預(yù)先知道序列信息的情況下高通量發(fā)現(xiàn)新的RNA分子。這個(gè)方案有望顯著地提高研究人員鑒別小分子RNA的能力，將過(guò)去不可能完成的實(shí)驗(yàn)變?yōu)榭赡堋Ｄ壳耙寻l(fā)現(xiàn)的microRNAs還非常有限，SOLiD可在不知道目標(biāo)分子DNA序列的情況下進(jìn)行檢測(cè)和定量小的RNA分子，可將樣品制備工作從常規(guī)方法的四天縮短為僅需一天，是分析在生物樣品中表達(dá)的已知和未知miRNA及其它小分子RNAs的有效工具。利用SOLiDWholeTranscriptomeKit還可以探索和鑒定全轉(zhuǎn)錄本。SOLiD無(wú)可比擬的高通量和測(cè)序數(shù)據(jù)的高精確性使得可以用短序列讀長(zhǎng)即可測(cè)序整個(gè)轉(zhuǎn)錄組。了解轉(zhuǎn)錄組對(duì)有助于解開(kāi)導(dǎo)致復(fù)雜疾病的分子通路的秘密。這一系列應(yīng)用補(bǔ)充使研究人員能在單個(gè)超高通量平臺(tái)上開(kāi)展綜合的RNA研究。SNP分析盡管絕大多數(shù)的人類遺傳信息在所有人中都相同，但是研究人員通常更感興趣的是研究個(gè)體之間微小的遺傳差異。這種差異包括單堿基變異，以及被稱為結(jié)構(gòu)變異的各種較大片段DNA序列變異。結(jié)構(gòu)變異包括DNA片段的插入、缺失、倒位和易位，結(jié)構(gòu)變異的DNA片段范圍可從幾個(gè)堿基對(duì)到數(shù)百萬(wàn)個(gè)堿基對(duì)，可能對(duì)基因產(chǎn)生重要影響，并導(dǎo)致人類疾病的發(fā)生。SOLiD流程獲得的嚴(yán)密的片段范圍，使研究人員可以鑒別出很寬范圍內(nèi)的插入和缺失片段，結(jié)構(gòu)重排也能很容易鑒別出來(lái)。這個(gè)平臺(tái)的超高通量使研究人員可輕而易舉地獲得高度基因組覆蓋率的數(shù)據(jù)，精確鑒定個(gè)體基因組中存在的數(shù)百萬(wàn)個(gè)單堿基多態(tài)性SNP，揭示大量此前未知、具有潛在醫(yī)學(xué)價(jià)值的遺傳變異，從而促進(jìn)我們對(duì)正常/疾病狀態(tài)下DNA結(jié)構(gòu)變異的了解，以及在更高的分辨率下對(duì)結(jié)構(gòu)變異進(jìn)行深入分析，解釋個(gè)體之間的易感性差異和對(duì)疾病治療應(yīng)答的差異，最終實(shí)現(xiàn)個(gè)性化醫(yī)療。甲基化分析甲基化是自然發(fā)生的DNA化學(xué)修飾的一種。已知抑癌基因的失活與DNA序列特定區(qū)域的甲基化有關(guān)。而去甲基化則可能導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定和表達(dá)模式變化。DNA甲基化區(qū)域可能作為基因在癌癥過(guò)程中的標(biāo)記。研究人員一直致力研究從正常到癌變過(guò)程中甲基化模式如何變化的，原癌基因異常甲基化模式在癌變過(guò)程中扮演怎樣的角色。SOLiD系統(tǒng)運(yùn)行通量非常驚人，很快就可以做多個(gè)樣本全基因組甲基化模式檢測(cè)，使得研究人員可以鑒別基因組中對(duì)應(yīng)元件的甲基化狀態(tài)，從而幫助研究人員檢測(cè)甲基化模式是否可以作為癌癥的生物標(biāo)識(shí)，以及更好了解甲基化在癌變過(guò)程中扮演的角色。著名的Sanger研究院和Broad研究院正利用SOLiD系統(tǒng)來(lái)探索人類基因組樣品中的遺傳變異。包括美國(guó)華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院、加利福尼亞大學(xué)SantaBarbara分校、哥倫比亞大學(xué)、澳洲昆士蘭大學(xué)、日本東京大學(xué)、荷蘭Hu