分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用 一代測(cè)序技術(shù) 分子生物學(xué)

一代測(cè)序技術(shù)主講人:XXX發(fā)展歷程第二代測(cè)序使用最為廣泛。以Roche公司的454技術(shù)，Illumina公司的Solexa，HiSeq技術(shù)為代表一代測(cè)序技術(shù)01基本介紹02一代測(cè)序技術(shù)的方法基本介紹01基本介紹——第一代測(cè)序的發(fā)明人在1997年發(fā)明了利用DNA聚合酶和雙脫氧鏈終止測(cè)定DNA核苷酸序列的方法。FredSanger及其同事基本介紹——第一代測(cè)序的發(fā)明人第一代測(cè)序技術(shù)概念：傳統(tǒng)的鏈終止法，化學(xué)降解法，以及在它們的基礎(chǔ)上的各種DNA測(cè)序技術(shù)。一代測(cè)序技術(shù)的方法02一代測(cè)序技術(shù)的方法０１對(duì)DNA片段5’或3’末端進(jìn)行放射性標(biāo)記。０２采用特異性化學(xué)試劑修飾和裂解特定的堿基位點(diǎn)。Maxam-Gilbert

化學(xué)降解測(cè)序法實(shí)驗(yàn)步驟將標(biāo)記完的樣品，分成四份取待測(cè)DNA片段２．G+A反應(yīng)"甲酸"１．G反應(yīng)，"硫酸二甲酯"４．C反應(yīng)在NaCl存在時(shí)，只有C與肼反應(yīng)，得到一系列C末端的片段３．T+C反應(yīng)"肼"一代測(cè)序技術(shù)的方法形成大小不一的DNA鏈電泳分離DNA鏈根據(jù)同位素標(biāo)記自顯影后讀出序列Maxam-Gilbert化學(xué)降解測(cè)序法的弊端化學(xué)降解測(cè)序法自建立以來沒有很大的改進(jìn)，目前僅在分析DNA和蛋白質(zhì)相互作用中的DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)等中才使用。受制于當(dāng)時(shí)聚丙烯酰胺凝膠電泳的分辨能力dNTP和ddNTP分子結(jié)構(gòu)式Sanger雙脫氧鏈終止法利用DNA聚合酶特性，使ddNTP參入到寡核苷酸鏈的3’末端?；驹恚弘p脫氧鏈終止法主要用于DNA基因分析一代測(cè)序技術(shù)的方法Sanger雙脫氧鏈終止測(cè)序法原理原理：是以待測(cè)單鏈DNA為模板，以dNTP為底物，在寡核苷酸引物的引導(dǎo)下依據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則。在此對(duì)引物進(jìn)行了事先標(biāo)記，可以實(shí)現(xiàn)4個(gè)測(cè)序反應(yīng)在同一反應(yīng)管中進(jìn)行?？梢岳米燥@影技術(shù)。測(cè)序程序2.在4只試管中加入適當(dāng)?shù)囊?、模板?種dNTP。分別加入一種一定濃度的ddNTP。3.與單鏈模板結(jié)合的引物，在DNA聚合酶作用下從5’端向3’端進(jìn)行延伸反應(yīng)，32P隨著引物延長(zhǎng)摻入到新合成鏈中。1.分離待測(cè)核酸模板。放射自顯影用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳同時(shí)分離4只反應(yīng)管中的反應(yīng)產(chǎn)物自動(dòng)化測(cè)序技術(shù)DNA重組技術(shù)1986年美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司推出首臺(tái)商