志賀氏菌檢驗(yàn)演示文稿

志賀氏菌檢驗(yàn)演示文稿當(dāng)前1頁(yè)，總共43頁(yè)。志賀氏菌檢驗(yàn)當(dāng)前2頁(yè)，總共43頁(yè)。一、流行病學(xué)簡(jiǎn)介一種古老的腸道傳染性腹瀉。19世紀(jì)曾出現(xiàn)全世界菌痢的大流行。1899年，日本人志賀氏首先發(fā)現(xiàn)菌痢是由痢疾桿菌引起。第一次世界大戰(zhàn)期間（1914-1918年），德國(guó)死于痢疾者約4萬(wàn)余人，并進(jìn)一步證實(shí)痢疾桿菌是菌痢流行的病原。當(dāng)前3頁(yè)，總共43頁(yè)。細(xì)菌性痢疾歷年來一直是我國(guó)夏秋季發(fā)病率最高的腸道傳染病。近年來報(bào)道非洲及中美洲流行的痢疾志賀菌病死率達(dá)5%-15%。我國(guó)屬發(fā)展中國(guó)家，人民的生活條件雖然在不斷改善，但由于部分地區(qū)衛(wèi)生知識(shí)普及不夠，食品衛(wèi)生管理、監(jiān)督不力，使得志賀菌的感染在我國(guó)傳染病中多年來一直處于較高的地位。當(dāng)前4頁(yè)，總共43頁(yè)。每年均有志賀菌感染暴發(fā)的報(bào)告，每次暴發(fā)的發(fā)病人數(shù)在數(shù)十人到上千人不等。多數(shù)由于食物和飲水污染引起。1994年5月11日，江蘇省無錫市發(fā)生一起26所小學(xué)的學(xué)生因課間餐食用豆奶導(dǎo)致1345人食物中毒的事故，后經(jīng)調(diào)查是一起志賀菌和致病性大腸桿菌混合感染引起的食物中毒，此次爆發(fā)波及范圍之大，發(fā)病人數(shù)之多，在我國(guó)歷史上頗為少見。當(dāng)前5頁(yè)，總共43頁(yè)。志賀菌致病力強(qiáng)，少量細(xì)菌進(jìn)入人體即可引起發(fā)病。是否發(fā)病，取決于細(xì)菌數(shù)量、致病力（粘附、侵襲力、毒素）和人體的抵抗力。各種志賀菌都可以產(chǎn)生強(qiáng)烈的內(nèi)毒素，是引起全身毒血癥的主要因素。志賀菌還可產(chǎn)生外毒素（志賀毒素），具有神經(jīng)毒、細(xì)胞毒和腸毒性作用，能引起更嚴(yán)重的臨床表現(xiàn)如溶血性尿毒綜合癥等。當(dāng)前6頁(yè)，總共43頁(yè)。二、生物學(xué)特性（一）、形態(tài)與染色革蘭氏陰性短桿菌、無莢膜，無芽胞，無鞭毛

2~3um*0.5~0.7um

當(dāng)前7頁(yè)，總共43頁(yè)。（二）、培養(yǎng)特性1、需氧或兼氧性厭氧，最適溫度37℃，PH7.2~7.42、在普通瓊脂和SS平板上，能形成圓形、微凸、光滑濕潤(rùn)、無色半透明、邊緣整齊、在中等大小的菌落3、宋氏志賀氏菌菌落較大，較不透明，粗糙而扁平，在SS平板上可遲發(fā)酵乳糖，菌落呈玫瑰紅色。4、在肉湯中呈均勻混濁生長(zhǎng)，無菌膜。

當(dāng)前8頁(yè)，總共43頁(yè)。（三）、生化反應(yīng)1、發(fā)酵葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，除宋氏志賀氏菌外，均不發(fā)酵乳糖。2、不發(fā)酵側(cè)金盞花醇、肌醇、水楊苷。3、不產(chǎn)生H2S，不分解尿素，V-P試驗(yàn)陰性，不能利用檸檬酸鹽。4、甲基紅陽(yáng)性。當(dāng)前9頁(yè)，總共43頁(yè)。（四）、抗原結(jié)構(gòu)1、抗原構(gòu)成：O抗原：群特異性抗原：A、B、C、DK抗原：除B群外，一般有K抗原當(dāng)前10頁(yè)，總共43頁(yè)。2、志賀氏菌的分群與血清型志賀氏菌分為四群：A群（痢疾志賀氏菌）：1~10型B群（福氏志賀氏菌）：1~6型+X、Y兩個(gè)變種，C群（鮑氏志賀氏菌）：1~15型D群（宋內(nèi)氏志賀氏菌）

：1個(gè)型當(dāng)前11頁(yè)，總共43頁(yè)。三、志賀氏菌檢驗(yàn)

GB4789.5-20121.以原國(guó)標(biāo)為基礎(chǔ)，保持與原標(biāo)準(zhǔn)的連續(xù)性

考慮基層單位方法的可操作性，對(duì)增菌步驟、培養(yǎng)條件盡可能簡(jiǎn)化；生化反應(yīng)方面亦盡量沿用原標(biāo)準(zhǔn)中的方法2.與國(guó)際接軌的原則

該標(biāo)準(zhǔn)的起草內(nèi)容主要參考了國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)組織ISO標(biāo)準(zhǔn)，部分參考采用了美國(guó)FDA、NMKL等標(biāo)準(zhǔn)當(dāng)前12頁(yè)，總共43頁(yè)。3.與現(xiàn)有已頒布的新版國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)協(xié)調(diào)統(tǒng)一

參考了已頒布的2008版國(guó)標(biāo)，在樣品的前處理步驟，培養(yǎng)條件的選擇，文字描述等方面盡量保持一致。

當(dāng)前13頁(yè)，總共43頁(yè)。GB/T4789.5-2003

標(biāo)準(zhǔn)不足處1.采用GN增菌肉湯,37℃需氧培養(yǎng),4小時(shí)后大腸菌的生長(zhǎng)速度大大超過志賀氏菌,檢測(cè)效果較差2.使用的分離平板SS對(duì)志賀1型有抑制3.檢驗(yàn)方法與現(xiàn)行的其它國(guó)家的標(biāo)準(zhǔn)存在差異當(dāng)前14頁(yè)，總共43頁(yè)。增菌：用GN增菌液使處于瀕死狀態(tài)的細(xì)菌恢復(fù)活力選擇性平板分離培養(yǎng)：XLD+MAC/顯色培養(yǎng)基生化試驗(yàn)：可采用API20E或VITEK2血清學(xué)鑒定：特異性診斷血清鑒定到種。

志賀氏菌操作流程當(dāng)前15頁(yè)，總共43頁(yè)。修改的內(nèi)容

增菌部分志賀氏菌增菌液（新生霉素0.5μg/mL）原國(guó)標(biāo)：GNISO：志賀氏菌增菌液（新生霉素0.5μg/mL）FDA：志賀氏菌增菌液（新生霉素0.5μg/mL和3μg/mL）NMKL：志賀氏菌增菌液（新生霉素0.5μg/mL）當(dāng)前16頁(yè)，總共43頁(yè)。培養(yǎng)條件：41.5℃±1℃厭氧培養(yǎng)原國(guó)標(biāo)：37℃需氧培養(yǎng)ISO：41.5℃厭氧培養(yǎng)FDA：42℃（除宋內(nèi)其他志賀菌)和44℃（宋內(nèi)）厭氧培養(yǎng)NMKL：42℃厭氧培養(yǎng)當(dāng)前17頁(yè)，總共43頁(yè)。

分離用平板原國(guó)標(biāo)：HE或SS;MAC或EMBISO：MAC、XLD、HEFDA：MACNMKL：MAC、XLD、HE當(dāng)前18頁(yè)，總共43頁(yè)。（一）增菌培養(yǎng)用志賀氏菌增菌液增菌,41.5℃±１℃，16h～20h厭氧培養(yǎng)。當(dāng)前19頁(yè)，總共43頁(yè)。智能厭氧微需氧培養(yǎng)系統(tǒng)當(dāng)前20頁(yè)，總共43頁(yè)。（二）分離培養(yǎng)取增菌后的GN增菌液或志賀氏增菌肉湯分別劃線接種于XLD瓊脂平板和MAC瓊脂平板或R&F志賀氏菌顯色培養(yǎng)基平板上于36℃1℃培養(yǎng)20h～24h，觀察各個(gè)平板上生長(zhǎng)的菌落形態(tài)若出現(xiàn)的菌落不典型或菌落較小不易觀察，則繼續(xù)培養(yǎng)至48h再進(jìn)行觀察。當(dāng)前21頁(yè)，總共43頁(yè)。菌落特征

MAC瓊脂：無色至淺粉紅色，半透明、光滑、濕潤(rùn)、圓形、邊緣整齊或不齊，直徑2～3mmXLD瓊脂：粉紅色至無色，半透明、光滑、濕潤(rùn)、圓形、邊緣整齊或不齊，直徑1～2mm當(dāng)前22頁(yè)，總共43頁(yè)。R&F志賀氏菌顯色瓊脂：白色，不透明、圓形、邊緣不整齊，直徑1mm～3mm，菌落周圍瓊脂顏色變?yōu)樽霞t色當(dāng)前23頁(yè)，總共43頁(yè)。志顯1宋內(nèi)氏典型菌落XLD當(dāng)前24頁(yè)，總共43頁(yè)。2福氏典型菌落志顯XLD當(dāng)前25頁(yè)，總共43頁(yè)。XLD3

鮑氏典型菌落志顯當(dāng)前26頁(yè)，總共43頁(yè)。XLD4痢疾典型菌落志顯當(dāng)前27頁(yè)，總共43頁(yè)。5熟肉制品中宋內(nèi)的分離效果R&F志顯XLD當(dāng)前28頁(yè)，總共43頁(yè)。志顯6蔬菜制品中宋內(nèi)分離效果XLD當(dāng)前29頁(yè)，總共43頁(yè)。志顯7鮑氏在生肉中的分離效果XLD當(dāng)前30頁(yè)，總共43頁(yè)。8熟肉制品中福氏的分離效果志顯當(dāng)前31頁(yè)，總共43頁(yè)。（四）初步生化選取平板上5個(gè)或5個(gè)以上可疑菌落接種TSI、葡萄糖半固體、營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，36℃1℃培養(yǎng)20h～24h，觀察結(jié)果。培養(yǎng)物中出現(xiàn)以下情況可以棄去a.在三糖鐵瓊脂斜面上蔓延生長(zhǎng)b.發(fā)酵乳糖或蔗糖c.不分解葡萄糖和只生長(zhǎng)在半固體表面的d.產(chǎn)氣的e.產(chǎn)生硫化氫f.有動(dòng)力的培養(yǎng)物當(dāng)前32頁(yè)，總共43頁(yè)。初步生化:三糖鐵（TSI）現(xiàn)象說明底層黃色葡萄糖陽(yáng)性紅色或不變色葡萄糖陰性黑色產(chǎn)H2S氣泡產(chǎn)氣斜面黃色乳糖和（或）蔗糖陽(yáng)性紅色或不變色乳糖和（或）蔗糖陰性志賀氏菌都能分解葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，大多不發(fā)酵乳糖，不產(chǎn)生H2S。如圖中2號(hào)管的反應(yīng).當(dāng)前33頁(yè)，總共43頁(yè)。生化反應(yīng)A群：痢疾志賀氏菌B群：福氏志賀氏菌C群：鮑氏志賀氏菌D群：宋內(nèi)氏志賀氏菌?-半乳糖苷酶－c－－c＋尿素－－－－賴氨酸脫羧酶－－－－鳥氨酸脫羧酶－－－a＋水楊苷－－－－七葉苷－－－－靛基質(zhì)－/＋(＋)－/＋－甘露醇－＋b＋＋棉子糖－＋－＋甘油(＋)－(＋)d注：+陽(yáng)性；-陰性；-/+多數(shù)陰性；+/-多數(shù)陽(yáng)性；（+）遲緩陽(yáng)性；d有不同生化型。a鮑氏13型為鳥氨酸陽(yáng)性。b福氏4型和6型常見甘露醇陰性變種。c痢疾志賀1型和鮑氏13型為陽(yáng)性。志賀氏菌屬四個(gè)群的生化特征當(dāng)前34頁(yè)，總共43頁(yè)。附加生化實(shí)驗(yàn)

由于某些不活潑的大腸埃希氏菌（anaerogenicE.coli）、A-D（Alkalescens-Disparbiotypes堿性-異型）菌的部分生化特征與志賀氏菌相似，并能與某種志賀氏菌分型血清發(fā)生凝集；因此前面生化實(shí)驗(yàn)符合志賀氏菌屬生化特性的培養(yǎng)物還需另加葡萄糖胺、西蒙氏檸檬酸鹽、粘液酸鹽試驗(yàn)(36℃培養(yǎng)24h～48h)。志賀氏菌屬和不活潑大腸埃希氏菌、A-D菌的生化特性區(qū)別見表3當(dāng)前35頁(yè)，總共43頁(yè)。（五）生化鑒定增加了API20E診斷試劑條和全自動(dòng)細(xì)菌生化鑒定儀VITEK；當(dāng)前36頁(yè)，總共43頁(yè)。當(dāng)前37頁(yè)，總共43頁(yè)。當(dāng)前38頁(yè)，總共43頁(yè)。（六）血清學(xué)鑒定1.抗原的準(zhǔn)備

志賀氏菌屬?zèng)]有動(dòng)力，所以沒有鞭毛抗原?？乖瓨?gòu)造與分型：志賀氏菌屬細(xì)菌的抗原結(jié)構(gòu)由菌體抗原（O）及表面抗原（K）組成。O抗原為糖脂蛋白復(fù)合物，可分為型特異性抗原和群特異性抗原。志賀氏菌分為4個(gè)群，48個(gè)血清型（包括亞型及變種）。K抗原在志賀菌屬分類上無意義。當(dāng)前39頁(yè)，總共43頁(yè)。菌體（0）抗原1.型特異性抗原：化學(xué)組成為多糖，是光滑型菌株所含有的重要抗原。當(dāng)菌株變?yōu)榇植谛蜁r(shí)，此抗原也常隨之消失，根據(jù)所含的型抗原不同，可將志賀菌屬分為A、B、C、D四個(gè)群及39個(gè)抗原型。2.群特異性抗原：為光滑型菌株的次要抗原，也是菌體抗原的一種。特異性較低，主要存在于B群。根據(jù)所含的群抗原不同，可將一些菌型分為多種亞型。當(dāng)前40頁(yè)，總共43頁(yè)。表面抗原（K抗原）在新分離的某些菌株菌體表面含有此種抗原。不耐熱，加熱100℃1小時(shí)即被破壞。具有此種抗原的菌株，可阻止菌體抗原與相應(yīng)免疫血清發(fā)生凝集。2.凝集反應(yīng)當(dāng)前41頁(yè)，總共43頁(yè)。3.血清學(xué)分型（選做項(xiàng)目）

先用四種志賀氏菌多價(jià)血清檢查，如果呈現(xiàn)凝集，則再用相應(yīng)各群多價(jià)血清分別試驗(yàn)。先用B群福氏志賀氏菌多價(jià)血清進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，如呈現(xiàn)凝集，再用其群和型因子血清分別檢查，福氏志賀氏菌各型和亞型的型抗原和群抗原鑒別見表4。如果B群多價(jià)血清不凝集，則用D群宋內(nèi)氏志賀氏菌血清進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，如呈現(xiàn)凝集，則用其Ⅰ相和Ⅱ相血清檢查；如果B