基因克隆及克隆基因的表達(dá)

關(guān)于基因克隆及克隆基因的表達(dá)第一頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日

一、目的DNA的分離獲?。ǚ郑┓蛛x獲取目的DNA有多種方法：(一)PCR——待擴(kuò)增目的基因兩端序列已知（據(jù)此設(shè)計(jì)引物）(二)基因文庫——先構(gòu)建，后篩選(三)化學(xué)合成法——直接合成目的DNA（序列已知、片段較短）第二頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日

文庫法：一個(gè)細(xì)胞只接受一個(gè)重組DNA分子一般一個(gè)載體只攜帶一段外源DNA

單克隆第三頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日

基因組DNA文庫（genomicDNAlibrary）：包含某一個(gè)生物細(xì)胞或組織全部基因組DNA序列的隨機(jī)克隆群體，以DNA片段的形式貯存了所有的基因組DNA信息。如何從文庫中釣取基因？第四頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍第五頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系4種dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA

0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+

1.5mmol/L第六頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日

二、載體的選擇與準(zhǔn)備（擇）；載體（vector）：攜帶外源DNA，實(shí)現(xiàn)外源DNA在受體細(xì)胞中的無性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。1.按功能克隆載體（cloningvector）表達(dá)載體（expressionvector）2.按基本元件的來源分類：質(zhì)粒載體噬菌體載體黏粒載體病毒載體人工染色體載體等第七頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日

二、載體的選擇與準(zhǔn)備（擇）；（一）根據(jù)DNA克隆的目的選擇與準(zhǔn)備適宜載體1.獲得目的DNA片段——選用克隆載體；2.獲得目的DNA片段所編碼的蛋白質(zhì)——選用表達(dá)載體。（二）考慮目的DNA的大小及受體細(xì)胞的種類和來源（三）含有合適的MCS第八頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日克隆載體用于外源DNA的克隆和無性繁殖

（一）克隆載體（cloningvector）應(yīng)具備的主要特點(diǎn)1.至少有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)（originofreplication,ori）2.至少有一個(gè)選擇性標(biāo)志（selectionmarker）3.有適宜的限制性內(nèi)切酶的單一切點(diǎn)：多克隆位點(diǎn)（multiplecloningsites，MCS）4.應(yīng)有較高的拷貝數(shù)pBR322質(zhì)粒圖譜第九頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日

克隆載體用于外源DNA的克隆和無性繁殖（二）常用克隆載體的種類1.質(zhì)粒(plasmid)是最常用的克隆載體廣泛存在于細(xì)菌、酵母等多種微生物中獨(dú)立于宿主細(xì)胞染色體外的環(huán)狀雙鏈的超螺旋結(jié)構(gòu)能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制帶有某些遺傳信息,會(huì)賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀質(zhì)粒的不相容性：兩個(gè)質(zhì)粒在同一宿主中不能共存的現(xiàn)象。第十頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日

目前，已有一系列商品化質(zhì)?？寺≥d體可供選擇，可容納10kb以內(nèi)的外源DNA。pUC18/19質(zhì)粒圖譜pUC18/19質(zhì)粒，2686bp，是最常用的質(zhì)粒載體缺乏控制拷貝數(shù)的rop基因，因此其拷貝數(shù)達(dá)500-700第十一頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日

T-載體：pMD18-T2692bpAmpicillinresistanceoriginHindIIISplnPstIHincIIAccISalIXbalBamHISmaIXmaIKpnISacIEcoRISp6T7LacZTT第十二頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日

克隆載體用于外源DNA的克隆和無性繁殖（二）常用克隆載體的種類2.噬菌體(phage)能感染細(xì)菌的病毒（1）λ噬菌體DNA改造系統(tǒng)cos位點(diǎn):兩端各有一條由12個(gè)堿基組成、彼此完全互補(bǔ)且5’突出的序列插入型：λgt系列，適用于cDNA克隆置換型：EMBL系列，適用于基因組DNA克隆線性雙鏈DNA分子coscos12bp12bp48500bpNonessentialportionforreplicationLong(left)armShort(right)arm（2）M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因）單鏈閉合環(huán)狀DNA分子第十三頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日

克隆載體用于外源DNA的克隆和無性繁殖（二）常用克隆載體的種類3.穿梭載體(shuttlevector)

可在不同宿主細(xì)胞中應(yīng)用人工構(gòu)建，含有不止一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，能攜帶外源DNA序列在不同種類宿主細(xì)胞中復(fù)制、擴(kuò)增。例如，既能在原核生物中復(fù)制,又能在真核生物中復(fù)制的載體。這類載體不僅具有細(xì)菌質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)及選擇標(biāo)記基因；還有真核生物的自主復(fù)制序列及選擇標(biāo)記性狀；具有多克隆位點(diǎn)。通常穿梭載體：在細(xì)菌中用于克?。〝U(kuò)增克隆的基因），在酵母菌中用于基因表達(dá)分析。第十四頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日

表達(dá)載體用于外源DNA的表達(dá)

表達(dá)載體（expressionvector）：用來在宿主細(xì)胞中表達(dá)外源基因的載體依據(jù)其宿主細(xì)胞的不同可分為:

原核表達(dá)載體（prokaryoticexpressionvector）

真核表達(dá)載體（eukaryoticexpressionvector）第十五頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日

三、目的DNA與載體連接（接）T4DNAligase第十六頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日

四、重組DNA轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增（轉(zhuǎn)）宿主細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞（competentcell）：處于易于接納外源物質(zhì)的狀態(tài)的細(xì)菌第十七頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日轉(zhuǎn)化（transformation）質(zhì)粒或黏?！?xì)菌質(zhì)?！湍福ㄕ婧思?xì)胞）轉(zhuǎn)染（transfection）外源DNA→真核細(xì)胞（酵母除外）感染（infection）噬菌體顆?！?xì)菌病毒顆?！溉榧?xì)胞

幾個(gè)相關(guān)概念：第十八頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日

將重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞的常用方法：化學(xué)法：氯化鈣法物理法：電擊法顯微注射法等第十九頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日

五、重組體的篩選與鑒定（篩）1.抗生素抗性篩選2.藍(lán)白篩選3.限制性內(nèi)切酶法4.PCR法5.DNA測序法主要方法：第二十頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日

五、重組體的篩選與鑒定（篩）細(xì)胞在含有相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)：無載體轉(zhuǎn)入的細(xì)胞——dead；含有載體的細(xì)胞——alive。1.利用抗生素抗性標(biāo)志可篩選出帶有載體的重組子尚需進(jìn)一步鑒定載體是否為含有目的DNA的重組載體第二十一頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日IPTGBlue-whitescreeningofrecombinants誘導(dǎo)物β半乳糖苷酶LacOperon?——在指示培養(yǎng)基上用顏色直接篩選重組克隆的方法五、重組體的篩選與鑒定（篩）2.藍(lán)白篩選

第二十二頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日

3.限制性內(nèi)切酶法：根據(jù)限制酶切圖譜篩選特定DNA五、重組體的篩選與鑒定（篩）Linearvector(2700bp)insert(300bp)M空質(zhì)粒重組質(zhì)粒NcoIHindIII2700bp300bp提取陽性克隆的重組DNARE消化電泳有無DNA片段的插入；插入片段的大小連接前用什么酶，就用什么酶切第二十三頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日

可明確序列和閱讀框的正確性5.核苷酸序列測定是最準(zhǔn)確的鑒定目的DNA的方法五、重組體的篩選與鑒定（篩）利用序列特異性引物，可鑒定陽性克隆。如利用克隆位點(diǎn)兩側(cè)序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR，再結(jié)合序列分析，能可靠地證實(shí)插入片段的方向、序列和閱讀框的正確性。4.PCR法：直接鑒定目的DNA的存在第二十四頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日基因克隆技術(shù)重組蛋白人源抗體重組多肽藥物重組疫苗基因克隆DNA序列測定重組載體基因治療載體RNA轉(zhuǎn)錄載體打靶載體轉(zhuǎn)基因載體基因敲除動(dòng)物模型轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型發(fā)夾RNARNAi核酸探針標(biāo)記分子雜交SouthernblotNorthernblot構(gòu)建文庫基因組文庫cDNA文庫基因合成PCR-克隆-亞克隆基因突變基因克隆技術(shù)是分子生物學(xué)的核心技術(shù)

第二十五頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日

克隆基因的表達(dá)—獲取重組蛋白重組子目的基因的mRNA表達(dá)蛋白質(zhì)第二十六頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日亞克隆（Subcloning）克隆載體表達(dá)載體第二十七頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日原核表達(dá)系統(tǒng)ProkaryoticexpressionsystemEukaryoticexpressionsystem真核表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌酵母昆蟲細(xì)胞哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞RecombinantvectorpromoterTargetgeneProteinsTransformation/Transfection

第二十八頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日原核表達(dá)系統(tǒng)：外源基因引入原核細(xì)胞，使其快速高效表達(dá)基因產(chǎn)物。真核表達(dá)系統(tǒng)：外源基因引入真核細(xì)胞，使外源基因在真核細(xì)胞中表達(dá)。表達(dá)體系

第二十九頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日第一部分.外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)組成二、原核表達(dá)載體一、原核宿主細(xì)胞第三十頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日

大腸桿菌（E.coli)優(yōu)點(diǎn)：簡便,快速、成本低可高密度發(fā)酵培養(yǎng)20-30min12hours6-8BillionbacteriaOncetherecombinantsystemisestablished,itischeaptomanufacture.insulinRecombinant一、原核宿主細(xì)胞注意：用來克隆基因和表達(dá)基因的菌株不一樣，表達(dá)時(shí)，選用與表達(dá)載體相匹配的菌株。第三十一頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日①生長快，代謝易于控制，可通過發(fā)酵迅速獲得大量基因表達(dá)產(chǎn)物。②基因組結(jié)構(gòu)簡單，便于基因操作和分析。③多數(shù)原核生物細(xì)胞內(nèi)含有質(zhì)?；蚴删w，便于構(gòu)建相應(yīng)的表達(dá)載體。④生理代謝途徑及基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制比較清楚。⑤不具備真核生物的蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)，表達(dá)產(chǎn)物無特定的空間構(gòu)象。⑥內(nèi)源蛋白酶會(huì)降解表達(dá)的外源蛋白，造成表達(dá)產(chǎn)物的不穩(wěn)定性。原核生物作為基因表達(dá)系統(tǒng)的受體細(xì)胞具有如下的特點(diǎn)：

第三十二頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日

二、原核表達(dá)載體在原核細(xì)胞中表達(dá)外源基因的載體。質(zhì)粒：噬菌體：最方便，最常用。長片段原核表達(dá)質(zhì)粒第三十三頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日

強(qiáng)啟動(dòng)子終止子SD序列1、原核表達(dá)質(zhì)粒的元件：oriPT7SDMCSTerminatorProkaryoticExpressionPlasmidProkaryoticpromoterLacIstartpiontAmpicillinresistance克隆元件：表達(dá)元件：復(fù)制原點(diǎn)插入位點(diǎn)篩選標(biāo)記第三十四頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日啟動(dòng)子終止子SDmRNA多肽鏈利用強(qiáng)啟動(dòng)子，增加蛋白質(zhì)的生物合成轉(zhuǎn)錄起始的速率是基因表達(dá)的主要限速步驟，因此，選擇強(qiáng)的、可調(diào)控啟動(dòng)子是組建一個(gè)高效表達(dá)載體首先要考慮的問題。

第三十五頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日原核表達(dá)載體的啟動(dòng)子都是可誘導(dǎo)的,目的是在需要目的蛋白的時(shí)候才表達(dá)它.最理想的可調(diào)控啟動(dòng)子應(yīng)該是：早期階段：啟動(dòng)子被阻遏當(dāng)細(xì)胞數(shù)目達(dá)到一定密度時(shí)：通過誘導(dǎo)使阻遏物失活，RNA聚合酶快速起始轉(zhuǎn)錄。

第三十六頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日Plac：受Lac阻遏蛋白負(fù)調(diào)節(jié)，

受IPTG的誘導(dǎo)。PL啟動(dòng)子：噬菌體早期左向啟動(dòng)子。

常用的原核啟動(dòng)子PR啟動(dòng)子：噬菌體早期右向啟動(dòng)子。受λ噬菌體CI基因調(diào)控

第三十七頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日

終止子：強(qiáng)終止子、二聚體終止子轉(zhuǎn)錄過度的危害：影響目的基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯效率干擾基因載體的復(fù)制等生物學(xué)功能增加受體細(xì)胞的無效能量消耗

啟動(dòng)子終止子SDmRNA第三十八頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日成熟型融合型分泌型減少原核細(xì)胞對外源蛋白的降解天然完整蛋白融合蛋白分泌性蛋白2、原核表達(dá)質(zhì)粒的類型：第三十九頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日1）成熟型表達(dá)載體oripromoterSDMCSExpressionvector特點(diǎn)：外源基因需攜帶ATG和TAA只表達(dá)目的基因編碼的氨基酸產(chǎn)生天然蛋白，容易被降解，因此產(chǎn)量小，也可能不穩(wěn)定。缺點(diǎn)!PForeignDNA

第四十頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日2)融合型表達(dá)載體載體1：……..ATGACG

TCA

GAT……….

載體2：……..ATGNAC

GTC

AGA

T..…….

載體3：………ATGNNA

CGT

CAG

AT.…第一種情況：ATGATGNATGNATGNATGNNInsertsiteInsertsiteInsertsite

第四十一頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日第二種情況：

表達(dá)載體含有一段編碼原核蛋白的基因順序，使表達(dá)的蛋白質(zhì)N端或C端帶著一小段原核多肽。

ProteinofinterestwithasmalladditionalpeptideatNorCend.Fig.Aschematicstructureoffusionprotein2)融合型表達(dá)載體第四十二頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日Mostpopularprokaryoticexpressionplasmidwithhis-tag.

融合型表達(dá)載體舉例第四十三頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日融合蛋白Ni-affinitychromatographyifthefusedis6-hisNiNiHis-his-his-his-his-hisIonicbondHis-tag

Protein可以加入蛋白酶切位點(diǎn)HistaqHistaqTAANcoI(ATG)EcoRIHindIII離子鍵親和層析第四十四頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日

外源蛋白以融合蛋白的形式表達(dá),讀碼框架固定或可選擇特點(diǎn)：

小結(jié):融合型表達(dá)載體表達(dá)效率高產(chǎn)物穩(wěn)定

易純化：利用融合原核多肽的特性

FusionproteincanbepurifiedeasilyCanbemadeinlargeamounts.優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：非天然蛋白，需要表達(dá)后切除融合蛋白第四十五頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日3)分泌型表達(dá)載體

SecretionexpressionvectorsATG下游構(gòu)建了信號肽基因序列Secretedintomedium?(!!)E.Colicannotdothat第四十六頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日CellwallCytoplasmicmembraneGenome分泌到細(xì)胞周間隙中的重組蛋白質(zhì)Recombinantproteinthespacebetweencellmembraneandcellwall.

第四十七頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日Therecombinantproteinwillbesecretedintoperiplasm避免目的蛋白被細(xì)菌蛋白酶降解Thehighexpressionlevel利于收集外源蛋白優(yōu)點(diǎn)：讀碼框架固定:ThetargetgenedoesnotneedstartcodonbecauseitusestheATGofsignalpeptide.特點(diǎn)：

第四十八頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日

Singlecolony50mlLBmediumfor5hours.OD=0.6induceforeigngeneexpressioninhost.transformrecombinantplasmidintoexpressionhostcell(BL21DE3)轉(zhuǎn)化平板細(xì)菌處于對數(shù)生長期時(shí)擴(kuò)大培養(yǎng)留種，然后1/100接種。轉(zhuǎn)化的表達(dá)菌要與表達(dá)載體相配套！三、外源基因在E.coli中的表達(dá)第四十九頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日IPTGadditionIPTGInduction：

addingIPTGtothecultureifthevectorusesLacoperontoregulateforeigngeneexpression.Quantityoftargetproteinincell,units

第五十頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日

Whereyourexpressedproteinwillbelocated?Inclusionbodies

(insoluble)Cytoplasm(soluble)Secretedintoperiplasmaticspace(solubleorinsoluble)

NothingRecombinantproteinmaybehydrolyzedbyproteinasesresistanttoproteinasehydrolysisthatresultsinthehighyield

第五十一頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日

SDSPurifyandIdentifytheproteinWesternBlotAnalysis問題：是不是所有基因都可以在E.coli中表達(dá)？第五十二頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日外源基因在原核細(xì)胞表達(dá)的必要條件：刪除內(nèi)含子和5’非編碼區(qū)外源基因置于強(qiáng)啟動(dòng)子和SD順序控制下維持正確開放閱讀框架（ORF）mRNA穩(wěn)定且可有效轉(zhuǎn)譯，形成的蛋白質(zhì)不被降解蛋白不需要翻譯后加工過程

第五十三頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日真核基因在E.coli中表達(dá)應(yīng)該如何構(gòu)建？（1）基因片段應(yīng)該來源于mRNA，因?yàn)镋.coli不能對基因進(jìn)行剪接。真核基因原核基因斷裂基因連續(xù)基因采用RT-PCR法

第五十四頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日（2）盡量將密碼子改變成E.coli偏愛密碼子，如果有困難，可嘗試將基因5’端前50個(gè)堿基變成偏愛密碼子。

E.Coli

核糖體蛋白質(zhì)的密碼子使用頻率：第五十五頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日

Case1.hIFN-2b的表達(dá)hIFN-2b的特點(diǎn)：1）一級結(jié)構(gòu)發(fā)揮作用，不需要翻譯后加工2）經(jīng)過密碼子的改造可以在E.coli中高效表達(dá)第五十六頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日Case2.HBsAg的表達(dá)HBsAg的特點(diǎn)：1）高度糖基化E.Coli沒有蛋白質(zhì)加工修飾功能，即使表達(dá)出蛋白質(zhì)也不具備天然蛋白質(zhì)的功能。2）HBV是真核病毒，因此HBsAg基因含有E.coli的稀有密碼子。因此，到目前為止，HBsAg重組疫苗還是在真核CHO細(xì)胞或酵母中表達(dá)的。

第五十七頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日

真核表達(dá)系統(tǒng)的必要性及優(yōu)勢：1.

具轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)2.

具翻譯后修飾系統(tǒng)，重組蛋白具有很好的活性3.

可實(shí)現(xiàn)真正的分泌表達(dá)4.基因治療、研究基因的功能等

原核表達(dá)系統(tǒng)的缺點(diǎn)：1.沒有轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)，不能識別、剪除內(nèi)含子2.缺乏翻譯后加工系統(tǒng)，不能對翻譯的蛋白質(zhì)進(jìn)一步修飾加工

第五十八頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日

真核細(xì)胞酵母細(xì)胞昆蟲細(xì)胞哺乳動(dòng)物細(xì)胞酵母表達(dá)系統(tǒng)昆蟲表達(dá)系統(tǒng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)以獲得大量的有活性的蛋白為目的研究基因或其蛋白質(zhì)產(chǎn)物的功能為目的第二部分.外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)YeastInsectMammalianEukaryoticExpressionSystem第五十九頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日

一、酵母表達(dá)系統(tǒng)系統(tǒng)組成：酵母細(xì)胞酵母質(zhì)粒表達(dá)載體…比細(xì)菌菌落大而厚，菌落表面光滑濕潤、粘稠、容易挑起，質(zhì)地、顏色均一，多為乳白色*低等真核單細(xì)胞生物，生長快，可大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng),成本較低。*可以進(jìn)行一定程度的蛋白質(zhì)翻譯后修飾。1.酵母細(xì)胞：第六十頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日

大腸桿菌/酵母菌穿梭載體：1.在E.coli中復(fù)制與篩選

*pUCori,Ampr2.在酵母細(xì)胞象細(xì)菌中質(zhì)粒一樣復(fù)制（2uorigin）3.在酵母細(xì)胞中表達(dá)外源基因

*酵母可識別的啟動(dòng)子4.篩選標(biāo)記：營養(yǎng)缺陷篩選URA32.酵母質(zhì)粒表達(dá)載體第六十一頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日

二、昆蟲表達(dá)系統(tǒng)昆蟲病毒：baculovirus轉(zhuǎn)遞質(zhì)粒載體1、可對蛋白質(zhì)進(jìn)行翻譯后加工修飾2、可高水平表達(dá)外源基因產(chǎn)物3、操作相對簡單已經(jīng)商品化4、蛋白準(zhǔn)確定位如分泌到膜外。載體：昆蟲表達(dá)系統(tǒng)的組分：昆蟲細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)：第六十二頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日病毒基因組相對較大，不宜直接將外源基因克隆到病毒基因組。thepolyhedringenebecomesunnecessary.replacepolyhedrincodingseqwithgeneofinterest(GofI)BaculovirusgenomestrongPromoterPolyhedringene昆蟲病毒昆蟲表達(dá)載體：提供目的基因的質(zhì)粒載體昆蟲桿狀病毒……..

第六十三頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日

*首先將外源片段克隆到某質(zhì)粒上，再以某種機(jī)制將外源片段遞到病毒基因組上有兩種不同原理構(gòu)建的昆蟲表達(dá)系統(tǒng)：1）根據(jù)同源重組原理構(gòu)建的2）根據(jù)轉(zhuǎn)座子原理構(gòu)建的，如Bac-To-Bac表達(dá)系統(tǒng)昆蟲表達(dá)載體：提供目的基因的質(zhì)粒載體第六十四頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日

--轉(zhuǎn)座子機(jī)制：如Bac-To-Bac表達(dá)系統(tǒng)Bacmid--insectcellBacmidPolyhedrinpromoter將轉(zhuǎn)座子的靶點(diǎn)構(gòu)建到昆蟲病毒基因組上（Baculovirusplasmid）帶有桿狀病毒基因組的質(zhì)粒，可在細(xì)菌和昆蟲細(xì)胞之間穿梭第六十五頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日

是否還記得轉(zhuǎn)座子是在染色體間運(yùn)動(dòng)？轉(zhuǎn)座子(trans-poson,Tn)是存在于染色體DNA上可自主復(fù)制和位移的基本單位?？稍诩?xì)菌的染色體，質(zhì)?；蚴删w之間自行移動(dòng)的遺傳成分，是基因組中一段特異的具有轉(zhuǎn)位特性的獨(dú)立的DNA序列。第六十六頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日

*將轉(zhuǎn)座子的兩個(gè)臂構(gòu)建到MCS兩側(cè)。1.構(gòu)建重組轉(zhuǎn)遞質(zhì)粒*通過基因克隆的方法將外源片段克隆到轉(zhuǎn)遞質(zhì)粒上。慶大Ppolh真核篩選標(biāo)記基因＋promoterofPolyhedrin

＋

GofIareflankedwithtwoarmsofatransposon.第六十七頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日

2RecombinantbacmidDNA主要是LacZ’,Kanr,

oriEBaculovirusgenomepFastBac1Tn7LPpolhForeigngeneAttachmentsitehelperCompetentDN10BacE.coliTransformationhelperForeigngenePpolhE.colicontainingrecombinantBacmidPpolhMini-prepofhighmolecularweightDNA2.ToconstructrecombinantBacmidDNAbasedontranspositionmechanisminE.coli.1RecombinantdonorplasmidHelper質(zhì)粒編碼轉(zhuǎn)座酶TetramprTn7RTetKan,慶大

Blue-Whiteselection

慶大Transposition

Bacmid（2～3天）第六十八頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日IsolatedrecombinantbacmidDNAthentransfectinsectcellswithlipo-insect4.Viralamplyfication:harvestthesupernatantandinfectinsectcellsfor5times5.recombinantprotein:Expressedbyinsectcellsisinsupernantantwhileviralamplificates.3.Bacmidwillbepackagedintoviralparticleininsectcell.Reconbinantbaculoverusparticleisreleasedintothesupernatant.Infectothercell.Recombinantbacmidparticles

第六十九頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日感染前感染后

第七十頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日三、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)系統(tǒng)組成：宿主細(xì)胞：哺乳動(dòng)物細(xì)胞*表達(dá)最接近天然的重組蛋白質(zhì)*重組蛋白的產(chǎn)量較低*直接利用宿主細(xì)胞研究重組蛋白的功能*可用于基因治療表達(dá)載體：*哺乳動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)粒表達(dá)載體*動(dòng)物病毒

第七十一頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日

哺乳動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)粒表達(dá)載體eukaryoticMCSPolyAsignalterminatorNeor第七十二頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期日