東方肝膽外科醫(yī)院膽道

東方肝膽外科醫(yī)院膽道第1頁/共22頁第六屆中國腫瘤學術大會

現(xiàn)狀

合并膽管癌栓（Bileducttumorthrombi，BDT）的肝細胞癌(Hepatocellularcarcinoma,HCC)約占原發(fā)性肝癌病人總數(shù)的1.66%～4.9%。據(jù)此推算，我國每年合并膽管癌栓的肝細胞癌（Hepatocellularcarcinomawithbileducttumorthrombi，HCCBDT）的新發(fā)病例約為5000～15000人，因此，雖然HCCBDT發(fā)生率相對較低，但是罹患者的絕對數(shù)量較大。

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HCCBDT是HCC中的一種特殊類型，它具有很強的侵襲和轉移能力，術后早期復發(fā)和轉移率高，術后1年復發(fā)率高達50%，5年生存率在20%左右，總體預后差，該病療效亟待改善。第3頁/共22頁第六屆中國腫瘤學術大會

1.臨床資料

4例原發(fā)性肝癌伴膽管癌栓患者，

男性3例，女性1例，均經(jīng)手術切除肝癌原發(fā)灶，并切開膽管取出癌栓。材料和方法：第4頁/共22頁第六屆中國腫瘤學術大會

2.實驗方法采用GIBCOBRC公司Trizol試劑盒及其方法抽提肝(肝癌)組織總RNA，采用RNeaSyMini試劑盒及其操作手冊方法純化RNA。核酸定量后，采用美國Agilent公司的WholeHumanGenomeOligoMicroarray芯片和有關試劑盒及其方法，樣本RNA使用cy3熒光標記后檢測肝癌原發(fā)灶和膽管癌栓樣本中等量RNA的轉錄水平。材料和方法：第5頁/共22頁第六屆中國腫瘤學術大會

差異基因篩選：4組數(shù)據(jù)進行配對t檢驗，1-samplet-test。P-value<0.05且averagefoldchange>2or<0.5的基因為差異表達基因。我們定義foldchange為膽管癌栓/癌原發(fā)灶，比值取2的對數(shù)后大于1為上調(diào)基因，比值小于1為下調(diào)基因。材料和方法：第6頁/共22頁第六屆中國腫瘤學術大會

與GeneBank比對，隨機選擇其中的差異表達基因，采用RT-PCR進行驗證材料和方法：第7頁/共22頁第六屆中國腫瘤學術大會

結果：Agilent公司W(wǎng)holeHumanGenomeOligoMicroarray芯片共撿測41000個人類基因，共篩選到150個差異表達基因（其中膽管癌栓樣本中49個基因上調(diào)，101個基因下調(diào)，P<0.05）。第8頁/共22頁散點圖第9頁/共22頁第六屆中國腫瘤學術大會GeneOntology分析通過使用GO（GeneOntology）分析方法結合國外文獻相關報道，分別按照生物學過程（biologicalprocess)，細胞組分(cellularcomponent)，分子功能(molecularfunction)三種獨立的方式對這些差異基因進行分類。并發(fā)現(xiàn)生物學過程分類中，差異基因與developmentalprocess,celladhesion,defenseresponse,inflammatoryresponse,secretion；在細胞組分分類中，與extracellularregion；在分子功能分類中，與carbohydratebinding,proteinbinding,transferaseactivity,transferringacylgroups,glycosaminoglycan（糖胺聚糖）binding顯著相關，p<0.05。這些結果提示我們差異表達基因可能通過影響細胞的粘附、炎癥反應等具體生物學功能參與肝癌中膽管癌栓的發(fā)生發(fā)展過程。第10頁/共22頁GO分析第11頁/共22頁第六屆中國腫瘤學術大會差異表達基因分子互作網(wǎng)絡通過整合三種蛋白相互作用數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)，建立了膽管癌栓中差異表達基因的相互關系網(wǎng)絡圖。150個差異表達基因通過兩兩之間的相互作用，共同組成了一個復雜的網(wǎng)絡圖。這一結果提示我們差異表達蛋白之間可能通過相互作用實現(xiàn)彼此之間的功能調(diào)節(jié)，同時還提示我們其中某些重要基因的表達可能具有至關重要的作用，具體的功能還需要進一步的分子生物學實驗來證實。第12頁/共22頁差異表達基因分子互作網(wǎng)絡

第13頁/共22頁第六屆中國腫瘤學術大會部分RT-PCR驗證結果第14頁/共22頁第六屆中國腫瘤學術大會部分RT-PCR驗證結果第15頁/共22頁2010開題報告

部分重要差異基因的生物學功能BAXBCL2-associatedXprotein，BAX（蛋白凋亡家族成員）LIFleukemiainhibitoryfactor（白血病抑制因子）CXCL1chemokine(C-X-Cmotif)ligand1(melanomagrowthstimulatingactivity,alpha)生長調(diào)節(jié)致癌基因αIL2RAinterleukin2receptor,alpha（白介素2受體-α）THBS1(TSP-1)Thrombospondin-1(凝血酶致敏蛋白-1)ECM2extracellularmatrix-2(細胞外基質(zhì))HBBhemoglobin,beta(血紅蛋白，beta)第16頁/共22頁第六屆中國腫瘤學術大會

與腫瘤轉移關系非常密切的細胞外基質(zhì)蛋白2（extracellularmatrixprotein2，ECM2）在膽管癌栓樣本中的表達水平明顯低于原發(fā)灶樣本（P=0.002）。一般認為，惡性腫瘤的侵蝕、轉移是一個動態(tài)的、連續(xù)的過程。而胞外基質(zhì)蛋白是腫瘤轉移的重要組織屏障，與之相關基因的表達水平降低將會直接導致腫瘤細胞轉移能力的增強。

討論第17頁/共22頁第六屆中國腫瘤學術大會

與分泌相關的基因白血病抑制因子(leukemiainhibitoryfactor,LIF)的表達在膽管癌栓樣本中的表達水平則較對照組發(fā)生了顯著的升高（P=0.029）。LIF是一種抑制細胞分化的細胞因子，可以由許多細胞分泌，它的表達能使細胞處于一個相對去分化的狀態(tài)。而這類去分化或未分化的腫瘤細胞對于腫瘤的增殖和轉移又是必須的，討論第18頁/共22頁癌栓在膽管內(nèi)并不具備良好的生長環(huán)境，一方面膽汁主要偏堿性，具有一定的腐蝕性，另一方面在膽管內(nèi)缺乏充分的血供，在如此環(huán)境中，癌栓仍能保持較快速度的生長，說明癌栓具有較強的生存能力。本項研究發(fā)現(xiàn)：膽管癌栓樣本中BAX基因的表達水平顯著低于原發(fā)灶。蛋白凋亡家族成員Bcl2蛋白相關X蛋白（BCL2-associatedXprotein，BAX），它與BAK一起被認為是啟動細胞凋亡的必需信號。討論第19頁/共22頁第六屆中國腫瘤學術大會

另外，膽管癌栓中錨蛋白重復域11(Ankyrinrepeatdomain11,ANKRD11)表達水平