探討照山白抗癌細(xì)胞的作用機(jī)制,腫瘤學(xué)論文

探討照山白抗癌細(xì)胞的作用機(jī)制,腫瘤學(xué)論文照山白(ＲhododendronmicranthumTurcz)，又名萬經(jīng)棵、照山白杜鵑，屬于杜鵑花科杜鵑花屬植物小花杜鵑。主要分布在我們國家東北、華北等地。照山白中含有皂苷、鞣質(zhì)、復(fù)原性物質(zhì)、多糖、黃酮、油脂和揮發(fā)油等多種化學(xué)成分，當(dāng)前對(duì)照山白化學(xué)成分報(bào)道較少。從傳統(tǒng)的中醫(yī)記載看，照山白有祛風(fēng)通絡(luò)、調(diào)經(jīng)止痛、化痰止咳的作用。枝葉入藥，用于慢性氣管炎、風(fēng)濕麻木、痛經(jīng)、產(chǎn)后關(guān)節(jié)痛、高血壓等。但對(duì)照山白單體如金絲桃苷(Hy-perin)成分的研究及抗氧化損傷和抗腫瘤作用研究鮮有報(bào)道。已有學(xué)者證實(shí)照山白提取物可有效抑制多種癌細(xì)胞的增長，誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡，具有抗腫瘤的作用，但其促進(jìn)細(xì)胞凋亡的途徑及分子生物學(xué)機(jī)制尚不明確。細(xì)胞凋亡或稱程序性細(xì)胞死亡(programmedcelldeath，PCD)，近年來發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡與很多疾病尤其是腫瘤有密切關(guān)系，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中往往伴有抑凋亡基因的表示出加強(qiáng)或促凋亡基因表示出的受抑，因此細(xì)胞凋亡的研究對(duì)腫瘤的發(fā)生、預(yù)防和治療都有著廣闊的前景。然而當(dāng)前中藥成分抗腫瘤在分子水平上的研究尚不深切進(jìn)入，為了進(jìn)一步討論照山白抗癌細(xì)胞的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用MTT法，流式細(xì)胞術(shù)PI染色、及westernblot檢測金絲桃苷處理對(duì)人乳腺癌細(xì)胞株MCF－7的細(xì)胞生長、細(xì)胞周期以及凋亡相關(guān)蛋白的表示出的影響，旨在進(jìn)一步討論其抗乳腺癌的可能機(jī)制。1材料與方式方法1．1材料與試劑1．1．1材料人乳腺癌細(xì)胞株MCF－7購于中科院生化細(xì)胞所，細(xì)胞周期檢測試劑盒購自南京凱基生物公司，兔抗人CDK2、CyclinA及caspase3多克隆抗體及二抗羊抗兔IgG均購自美國基因(CST)公司。二甲基亞砜(DMSO)為北京化工廠產(chǎn)品;ＲPMI－1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自GIBCO公司;MTT購自Sigma公司;胰蛋白酶－EDTA消化液購自北京Solarbio科技有限公司。1．1．2照山白金絲桃苷單體的制備金絲桃苷由泰山醫(yī)學(xué)院藥物化學(xué)合成教研室提供。根據(jù)已有文獻(xiàn)［6］從泰山杜鵑屬植物照山白枝葉中提取，純化，經(jīng)與對(duì)照品比對(duì)，高效液相色譜法測定純度在98%以上。將金絲桃苷溶解在二甲基亞砜(DMSO)中，作為原液，儲(chǔ)存在－20℃，并在實(shí)驗(yàn)前用培養(yǎng)基稀釋。整個(gè)研究經(jīng)過中DMSO的終濃度的不超過0.1%，對(duì)照組相應(yīng)的用含0．1%DMSO培養(yǎng)基處理。1．1．3細(xì)胞培養(yǎng)及干涉將MCF－7細(xì)胞置于含10%FBS的ＲPMI－1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，80%～85%融合率后常規(guī)傳代。1．2方式方法1．2．1MTT法檢測細(xì)胞生長取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，制成1105/ml的細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加細(xì)胞懸液100l培養(yǎng)過夜，PBS洗滌，實(shí)驗(yàn)組分別參加濃度為1g/L、10g/L、100g/L、1mg/L、2mg/L的金絲桃苷，對(duì)照組只加培養(yǎng)基。金絲桃苷組分別繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h、72h、96h、120h后，參加MTT溶液(5mg/ml)10l繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄去各孔內(nèi)液體，每孔參加100l二甲基亞砜，置振蕩器上振蕩5min，使細(xì)胞內(nèi)和周圍的紫色顆粒充分溶解，室溫放置10min，于全自動(dòng)酶標(biāo)儀上測定各孔A490nm值，取3孔平均值計(jì)算細(xì)胞抑制率:抑制率%=(1－實(shí)驗(yàn)組A值)/對(duì)照組A值100%。1．2．2流式細(xì)胞儀PI染色分析各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞周期變化:以含10%FBS的ＲPMI－1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度至每毫升1105個(gè)，按每瓶2ml接種于25ml的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，每48h更換培養(yǎng)液1次。待細(xì)胞融合率為80%～85%時(shí)，無血清培養(yǎng)使細(xì)胞同步化于G0期，然后按分組分別加金絲桃苷處理24h。細(xì)胞分組如下。對(duì)照組:僅含培養(yǎng)基;金絲桃苷低、中、高劑量處理組:(10g/L、100g/L、1mg/L)。取出各處理組細(xì)胞培養(yǎng)瓶，胰蛋白酶消化，分別收集細(xì)胞入試管中。以1000轉(zhuǎn)/分離心5min，棄上清，參加4℃PBS緩沖液，渦旋混勻，再離心，洗滌細(xì)胞2次。4℃70%的乙醇約0．5ml貼壁緩慢參加試管中固定細(xì)胞。以1800轉(zhuǎn)/分離心5min，棄去固定液。再加PBS離心洗滌細(xì)胞1次。每106細(xì)胞參加500U的ＲNA酶，置37℃孵育30min。離心去除ＲNA酶，再經(jīng)PBS洗1次，離心去上清液。參加50mg/L的PIlml，室溫下避光染色20min后，300目尼龍網(wǎng)過濾。上流式細(xì)胞儀測定(激發(fā)波長488nm，氫離子激光)，用multcycleDNA分析軟件包進(jìn)行細(xì)胞周期分析。1．2．3Westernblot法檢測蛋白的表示出細(xì)胞接種、分組、消化處理同上，預(yù)冷的PBS洗2次，參加1ml細(xì)胞裂解液充分混合，冰上放置30min，12000轉(zhuǎn)/min離心10min，取上清，BCA法進(jìn)行蛋白定量?？偟鞍捉?jīng)SDS－PAGE分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，參加5%脫脂奶粉室溫封閉2h，再參加1∶1000稀釋的兔抗人的抗體，4℃過夜，用TBST洗3次，參加相應(yīng)的二抗，室溫孵育1h，漂洗4次，ECL顯色后，用Image軟件進(jìn)行灰度分析。1．2．4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS13．0軟件分析對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行one－wayANOVA分析及LSD兩兩比擬。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2．1金絲桃苷對(duì)人乳腺癌細(xì)胞株MCF－7增殖的抑制作用(表1，圖1)。MTT法測定結(jié)果顯示金絲桃苷對(duì)人乳腺癌細(xì)胞株MCF－7有抑制作用，并呈濃度和時(shí)間依靠效應(yīng)。2．2實(shí)驗(yàn)各組藥物對(duì)細(xì)胞周期的影響(表2)。與對(duì)照組相比，金絲桃苷各處理組DNA倍體分析顯示G2/M期細(xì)胞比例顯著高于對(duì)照組、S期細(xì)胞百分比低于對(duì)照組(P＜0．05或P＜0．01)，表1為流式細(xì)胞儀PI染色DNA倍體分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果。2．3實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞周期及凋亡相關(guān)蛋白表示出的變化(圖2)。Westernblot結(jié)果表示清楚，與對(duì)照組相比，經(jīng)金絲桃苷處理后，CDK2、CyclinA表示出降低而caspase3的表示出增高，華而不實(shí)高劑量組較低劑量組組間則有明顯差異(P＜0．05)。3討論已有研究表示清楚，金絲桃苷和槲皮素等黃酮類成分對(duì)心肌缺血損傷有明顯的保衛(wèi)作用。而金絲桃苷作為黃酮醇苷化合物具有抗氧化和鎮(zhèn)痛作用，已被廣泛用于臨床治療。與其他黃酮類物質(zhì)相比，金絲桃苷具有低毒、無誘變性等特點(diǎn)，具有抑制癌細(xì)胞的活性。細(xì)胞要分裂，必須正確復(fù)制DNA和到達(dá)一定的體積，在獲得足夠物質(zhì)支持分裂以前，細(xì)胞不可能進(jìn)行分裂。細(xì)胞周期的運(yùn)行，是在一系列稱為檢驗(yàn)點(diǎn)(checkpoint)的嚴(yán)格檢控下進(jìn)行的，當(dāng)DNA發(fā)生損傷，復(fù)制不完全或紡錘體構(gòu)成不正常，周期將被阻斷。細(xì)胞周期蛋白依靠性激酶CDK2與細(xì)胞周期蛋白結(jié)合才具有激酶的活性，另外，細(xì)胞中還具有細(xì)胞周期蛋白依靠性激酶抑制因子(CDKinhibitor，CKI)對(duì)細(xì)胞周期起負(fù)調(diào)控作用，在G2/M期，cycli-nA、cyclinB與CDK1結(jié)合，CDK1使底物蛋白磷酸化、如將組蛋白H1磷酸化導(dǎo)致染色體凝縮，核纖層蛋白磷酸化使核膜解體等下游細(xì)胞周期事件，完成一個(gè)細(xì)胞周期。為了討論金絲桃苷誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡的詳細(xì)通路，本研究應(yīng)用MTT法檢測細(xì)胞生長的抑制作用，結(jié)果顯示，10g－1mg/L金絲桃苷能顯著抑制細(xì)胞的生長，10g/L金絲桃苷作用48h后抑制率可達(dá)23．81%，并且金絲桃苷對(duì)乳腺癌細(xì)胞的抑制作用具有時(shí)間和劑量依靠性效應(yīng)。為探究細(xì)胞生長抑制的原因，本研究應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)PI染色檢測細(xì)胞周期的分布，顯示細(xì)胞分裂增殖最旺盛的G2/M期細(xì)胞比率顯著增加，提示細(xì)胞分裂被明顯抑制，復(fù)制不完全，正常細(xì)胞周期被阻斷。而在下一步的實(shí)驗(yàn)中，促進(jìn)通過細(xì)胞周期G2/M期檢驗(yàn)點(diǎn)的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白cyclinA與CDK2表示出下降，同時(shí)凋亡家族的最后通路caspase3表示出增高，可見金絲桃苷抑制腫瘤細(xì)胞的生長與細(xì)胞周期阻滯，促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)。當(dāng)前以為除既往研究較清楚的兩個(gè)主要通路:細(xì)胞凋亡的細(xì)胞膜死亡受體通路;細(xì)胞色素C釋放和caspases激活的線粒體途經(jīng)。細(xì)胞凋亡不僅在維持細(xì)胞群體數(shù)量的穩(wěn)定、胚胎發(fā)育和免疫系統(tǒng)的克隆選擇方面起著作用，而且在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及抗腫瘤治療等方面有特別重要的作用［9］。研究細(xì)胞凋亡對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展及治療均有指導(dǎo)意義。用當(dāng)代生物學(xué)技術(shù)研究中醫(yī)藥抗腫瘤療效及其分子機(jī)制的研究越來越引起人們的關(guān)注?？傊瑢?shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，金絲桃苷作用后抑制MCF－7細(xì)胞生長，呈時(shí)間和劑量依靠性地誘導(dǎo)細(xì)胞周期G2/M期阻滯及細(xì)胞凋亡。這提示金絲桃苷