透射電子顯微鏡技術1

第一節(jié)

透射電子顯微鏡(TransmissionElectronMicroscope)分析測試中心1當前1頁，總共103頁。主要內容電子顯微鏡概述透射電子顯微鏡及相關技術2當前2頁，總共103頁。

電子顯微鏡概述電子顯微鏡發(fā)展史電子顯微鏡的基本類型電子顯微鏡的基本結構電子顯微鏡的醫(yī)學應用3當前3頁，總共103頁。

電子顯微鏡概述電子顯微鏡：根據(jù)電子光學原理，用電子束和電磁透鏡代替光束和光學透鏡來照射樣品，獲得極高分辨率的顯微鏡，簡稱電鏡。產生基礎：

根據(jù)波動學說，運動著的電子可以看作是一種電子波。軸對稱分布的電磁場具有能使電子束偏轉、聚焦的作用。4當前4頁，總共103頁。

電子顯微鏡概述5當前5頁，總共103頁。電子束與物質的作用俄歇電子感應電導入射電子二次電子背散射電子吸收電子樣品特征X射線熒光透射電子

電子顯微鏡概述6當前6頁，總共103頁。一、電子顯微鏡發(fā)展史1924，DeBroglie提出波粒二象性假說1926，Busch發(fā)現(xiàn)電子可由外加電磁場的改變而偏折1933，Knoll和Ruska發(fā)明第一臺電子顯微鏡（50nm）1935，Knoll第一部掃描電子顯微鏡1938，Ruska第一部透射電子顯微鏡1939，西門子商用透射電子顯微鏡（10nm）1942，實驗用掃描電子顯微鏡1958，中國研制成功透射式電子顯微鏡，其分辨本領為3nm1979，大型電子顯微鏡0.3nm

電子顯微鏡概述7當前7頁，總共103頁。ErnstRuskaGerdBinnigHeinrichRohrer因為發(fā)明EM和STM而分享1986年的諾貝爾物理學獎

電子顯微鏡概述8當前8頁，總共103頁。二、電子顯微鏡基本類型

電子顯微鏡概述

透射電鏡

(Transmissionelectronmicroscope,TEM)

觀察細胞內部結構

掃描電鏡（Scanningelectronmicroscope,SEM)

觀察組織或細胞表面的立體形貌9當前9頁，總共103頁。

電子顯微鏡概述10當前10頁，總共103頁。俄歇電子感應電導入射電子二次電子背散射電子吸收電子樣品特征X射線熒光透射電子能譜儀（EDS）波譜儀（WDS）電子探針（EPMA)TEMSEM

電子顯微鏡概述電子束與物質的作用11當前11頁，總共103頁。我室現(xiàn)有兩臺電子顯微鏡

電子顯微鏡概述SEMHITACHIS-3000NTEMHITACHIH-750012當前12頁，總共103頁。三、電子顯微鏡的基本結構電子光學系統(tǒng)真空系統(tǒng)電源系統(tǒng)操作控制系統(tǒng)觀察系統(tǒng)

電子顯微鏡概述13當前13頁，總共103頁。電子光學系統(tǒng)電子槍——

發(fā)射自由電子形成電子束電磁透鏡——

用一個對稱于鏡筒軸線的空間電場或磁場使電子軌跡向軸線彎曲聚焦形成電子束

電子顯微鏡概述14當前14頁，總共103頁。四、電子顯微鏡的醫(yī)學應用細胞學和分子生物學中的應用解剖學中的應用病毒研究方面的應用臨床超微病理診斷中的應用

電子顯微鏡概述15當前15頁，總共103頁。細胞學和分子生物學中的應用

電子顯微鏡概述細胞亞顯微結構模式圖

組織細胞內亞顯微結構16當前16頁，總共103頁。骨骼肌肌絲縱斷面SEM×30000TTMiNZSR

電子顯微鏡概述17當前17頁，總共103頁。骨骼肌肌絲縱斷面TEM×29000

*Z**SRTT

18當前18頁，總共103頁。骨骼肌肌絲橫斷面

TEM×40000

電子顯微鏡概述19當前19頁，總共103頁。解剖學中的應用

電子顯微鏡概述肛門內括約肌

內耳毛細胞

20當前20頁，總共103頁。病毒研究方面的應用H1N1流感病毒

電子顯微鏡概述21當前21頁，總共103頁。H1N1流感病毒

電子顯微鏡概述22當前22頁，總共103頁。臨床超微病理診斷中的應用—腎活檢

電子顯微鏡概述足突融合系膜基質增生23當前23頁，總共103頁。肌營養(yǎng)不良肌肉糖原貯積病臨床超微病理診斷中的應用—肌活檢

電子顯微鏡概述24當前24頁，總共103頁。嬰兒肝炎綜合癥臨床超微病理診斷中的應用—肝活檢

電子顯微鏡概述25當前25頁，總共103頁。臨床超微病理診斷中的應用—神經(jīng)活檢軸索變性節(jié)段性脫髓鞘

電子顯微鏡概述26當前26頁，總共103頁。臨床超微病理診斷中的應用—皮膚活檢

電子顯微鏡概述角質層疏松變成纖細胞沉積致密顆粒27當前27頁，總共103頁。臨床超微病理診斷中的應用

電子顯微鏡概述毛細胞性白血病28當前28頁，總共103頁。

透射電子顯微鏡及相關技術透射電鏡基本結構透射電鏡成像原理透射電鏡主要性能指標透射電鏡相關技術

——超薄切片技術

——負染色技術

——免疫電鏡技術五.細胞超微結構簡介29當前29頁，總共103頁。一.透射電鏡基本結構電子光學系統(tǒng)觀察記錄顯示系統(tǒng)真空系統(tǒng)電源系統(tǒng)操作控制系統(tǒng)30當前30頁，總共103頁。電子照明系統(tǒng)成像系統(tǒng)觀察記錄顯示系統(tǒng)電子光學系統(tǒng)一.透射電鏡基本結構31當前31頁，總共103頁。陰極控制極陽極電子束聚光鏡樣品1.電子照明系統(tǒng)—

電子槍，聚光鏡一.透射電鏡基本結構電子槍32當前32頁，總共103頁。電子槍

——

電子束的發(fā)射源。常用的是發(fā)夾形熱鎢絲三電極式電子槍。燈絲（陰極）由鎢絲制成，通電加熱后發(fā)射電子發(fā)射出的電子束受處于負電位的柵極所調制,并被陽極的高電位（幾十～幾百千伏）區(qū)加速后形成一束“光源”,即電子源。另外還有六硼化鑭陰極、點陰極和場發(fā)射電子槍等幾種高亮度新型電子槍。一.透射電鏡基本結構33當前33頁，總共103頁。聚光鏡

——

一種電磁透鏡，由外包鐵殼的線圈形成。當線圈中通有電流時，鐵殼的縫隙處集中產生磁場，控制電子束的運動。聚光鏡的作用是將電子槍發(fā)出的電子流會聚后照射到樣品上。

一.透射電鏡基本結構34當前34頁，總共103頁。2.電子成像系統(tǒng)

——

樣品及樣品以下的電磁透鏡樣品

經(jīng)特殊制備的超薄樣品被放在直徑3mm的載網(wǎng)上，再把載網(wǎng)放在支架上并插入透射電鏡中。樣品架可以平移、傾動和旋轉。

一.透射電鏡基本結構35當前35頁，總共103頁。樣品以下的電磁透鏡——

物鏡、中間鏡和投影鏡改變各透鏡電流可以在很大范圍內改變圖像的大小圖像的聚焦是靠調節(jié)物鏡電流來實現(xiàn)的物鏡是整個儀器中最重要的部分，它決定電鏡分辨率一.透射電鏡基本結構36當前36頁，總共103頁。人眼無法觀測電子，TEM中的電子信息通過熒光屏和照相底版轉換為可觀察圖像。3.觀察記錄顯示系統(tǒng)

上圖為我室透射電鏡安裝的側插式數(shù)碼成像系統(tǒng)——SISMegaviewⅢ一.透射電鏡基本結構37當前37頁，總共103頁。真空系統(tǒng)一.透射電鏡基本結構由機械泵、油擴散泵、離子泵、真空測量儀表及真空管道組成。它的作用是排除鏡筒內氣體，保持一定的鏡筒真空度。如果真空度低的話，電子與氣體分子之間的碰撞引起散射而影響襯度，還會使電子柵極與陽極間高壓電離導致極間放電，殘余的氣體還會腐蝕燈絲，污染樣品。38當前38頁，總共103頁。電源系統(tǒng)一.透射電鏡基本結構39當前39頁，總共103頁。操作控制系統(tǒng)一.透射電鏡基本結構40當前40頁，總共103頁。ImageSampleObjectiveLens(IlluminationSource)LumpOMCondenserLensProjectionLensScreenImageImageSampleSampleObjectiveLensElectronSourceCondenserLensDeflectionCoilsSEDetectorCRTTEMSEMFluorescentscreenScanningTheoryofTransmissionElectronMicroscopeDifferenceamongOM,TEMandSEM41當前41頁，總共103頁。二.透射電鏡成像原理

光學顯微鏡中圖像的襯度（即對比度或反差）決定于樣品上各部位對光的不同吸收。電鏡中圖像襯度的形成卻主要靠樣品對電子波的散射及其相互間的干涉。通常可以把圖像襯度分成散射吸收襯度，衍射襯度和相位襯度。

42當前42頁，總共103頁。二.透射電鏡成像原理在真空條件下，電子束經(jīng)高壓加速后，穿透樣品時形成散射電子和透射電子，它們在電磁透鏡的作用下在熒光屏上成像。電子槍和電磁透鏡對電子束的作用決定電鏡成像質量。43當前43頁，總共103頁。吸收像：當電子射到質量、密度大的樣品時，主要的成像作用是散射作用。樣品上致密和較厚的部分對電子的散射角大，被物鏡下方設置一個帶孔的圓片（即物鏡光闌）攔掉，這樣通過的電子較少，像的亮度較暗，反之則為亮區(qū)。這種襯度稱散射吸收襯度，可以提供樣品形態(tài)方面的信息。早期的透射電子顯微鏡都是基于這種原理。

二.透射電鏡成像原理44當前44頁，總共103頁。衍射像：電子束被樣品衍射后，樣品不同位置的衍射波振幅分布對應于樣品中晶體各部分不同的衍射能力，當出現(xiàn)晶體缺陷時，缺陷部分的衍射能力與完整區(qū)域不同，從而使衍射波的振幅分布不均勻，反映出晶體缺陷的分布。相位像：當極薄、小顆?；虻兔芏葮悠烦上駮r，主要應該利用相位襯度。樣品受電子波照射后會產生不同的散射波。在條件合適時，這些散射波將按一定的相位關系干涉成像，這就是相位襯度像。它是一種高分辨率的像，可用于研究原子尺度（小于10埃）的樣品微結構。二.透射電鏡成像原理45當前45頁，總共103頁。一般生物醫(yī)學常用透射電鏡分辨率0.1～0.3nm放大率50～500000電壓在20～200KV樣品厚度<100nm三.主要性能指標46當前46頁，總共103頁。是TEM的最主要性能指標，表征電鏡顯示亞顯微組織、結構細節(jié)的能力。點分辨率：能分辨兩點之間的最短距離線分辨率：能分辨兩條線之間的最短距離，通過拍攝已知晶體的晶格象測定，又稱晶格分辨率。三.主要性能指標分辨率47當前47頁，總共103頁。指電子圖像對于所觀察試樣區(qū)的線性放大率。目前高性能TEM的M范圍為80～100萬倍。不僅考慮最高和最低放大倍數(shù)，還要考慮是否覆蓋低倍到高倍的整個范圍。電鏡不能將其所分辨的細節(jié)放大到人眼可辨認程度。對細節(jié)觀察是用電鏡放大在熒光屏上成像，經(jīng)附帶的立體顯微鏡進行聚焦和觀察。將儀器的最小可分辨距離放大到人眼可分辨距離所需的放大倍數(shù)稱為有效放大倍數(shù)。一般儀器的最大倍數(shù)稍大于有效放大倍數(shù)。放大倍數(shù)—常數(shù)—中間鏡激磁電流三.主要性能指標48當前48頁，總共103頁。人眼分辨本領約0.2mm，光學顯微鏡約0.2μm。把0.2μm放大到0.2mm的放大倍數(shù)是1000倍,是有效放大倍數(shù)。光學顯微鏡分辨率在0.2μm時，有效放大倍數(shù)是1000倍。光學顯微鏡的放大倍數(shù)可以做的更高，但高出部分對提高分辨率沒有貢獻，僅是讓人眼觀察舒服。關于放大倍數(shù)的幾點說明：三.主要性能指標49當前49頁，總共103頁。指電子槍陽極相對于陰極燈絲的電壓，決定了發(fā)射的電子的λ和E。電壓越高，電子束對樣品的穿透能力越強（厚樣品）、分辨率越高、對樣品的輻射損傷越小。普通TEM的最高V一般為100kV和200kV，通常所說的V是指可達到的最高加速電壓。加速電壓三.主要性能指標50當前50頁，總共103頁。四.透射電鏡相關技術透射電鏡生物樣品制備要求超薄切片技術負染色技術免疫電鏡技術51當前51頁，總共103頁。1.透射電鏡生物樣品制備要求四.透射電鏡相關技術電鏡標本觀察條件：高真空、高電壓、能夠散射電子生物樣品特點：含有大量水分、電子密度低（主要是C、H、O）生物樣品制備目的：去除水分，增加標本中能夠散射電子的重原子52當前52頁，總共103頁。四.透射電鏡相關技術新刀鋒產生于斷端超薄切片刀：玻璃刀、鉆石刀玻璃制刀機2.超薄切片技術53當前53頁，總共103頁。2.超薄切片技術四.透射電鏡相關技術超薄切片機原理示意圖超薄切片機54當前54頁，總共103頁。超薄切片技術——玻璃刀切片四.透射電鏡相關技術55當前55頁，總共103頁。Thinsections四.透射電鏡相關技術56當前56頁，總共103頁。載網(wǎng)分類及選擇：

1.分類：銅網(wǎng)、鎳網(wǎng)、金網(wǎng)，根據(jù)用途不同分別采用，如酶細胞化學、免疫金標記技術等需采用后兩者；

2.支持膜：貼附于載網(wǎng)，用來觀察懸浮的病毒、脂質體及其它顆粒物質的均質性膜，包括Formvar膜、碳膜等。四.透射電鏡相關技術57當前57頁，總共103頁。SpecimenPreparationforElectronMicroscopyThinSectioningforTEMThewaxsections:3-10um;ThePlasticultrathin-sectionsforTEM:40-50nmSectionsofLM:>5um;SectionsofTEM:<100nm

四.透射電鏡相關技術58當前58頁，總共103頁。59當前59頁，總共103頁。四.透射電鏡相關技術超薄切片技術

—生物樣品制備流程取材——漂洗（緩沖液）——前固定（2.5%戊二醛）——漂洗（緩沖液）——后固定(1%鋨酸)——漂洗（緩沖液）——梯度脫水——浸透（樹脂）——包埋——聚合——超薄切片——電子染色——TEM

觀察60當前60頁，總共103頁。定義：染液中的高電子密度物質包圍低電子密度的樣品，染色結果使背景是黑暗的，而樣品部分呈“透明”的光亮區(qū)，故稱之為負染色。用途：用于觀察生物大分子、病毒、細菌、分離的細胞器以及蛋白質晶體等顆粒性物質的結構、大小以及形狀等。3.負染色技術四.透射電鏡相關技術61當前61頁，總共103頁。負染色方法液滴20μL樣品懸液雙蒸水負染液負染液Parafilmgrid四.透射電鏡相關技術62當前62頁，總共103頁。負染色技術的應用四.透射電鏡相關技術63當前63頁，總共103頁。負染色技術的應用四.透射電鏡相關技術來自于加州一位患者的H1N1流感患者樣本的病毒透射電鏡照片，4月28日from美國疾控中心（CDC)經(jīng)過處理后，病毒的超微結構更將明顯地顯露出來。64當前64頁，總共103頁。負染色技術的應用四.透射電鏡相關技術CDC發(fā)表的1976年流行的豬流感病毒照片

1918流感病毒即為西班牙流感病毒65當前65頁，總共103頁。4.免疫電鏡技術免疫電鏡技術

是免疫化學技術與電鏡技術結合的產物，是在超微結構水平研究和觀察抗原、抗體結合定位的一種方法學主要使用的示蹤物：重金屬（如膠體金）酶（如HRP）四.透射電鏡相關技術66當前66頁，總共103頁。免疫電鏡技術類型主要分為兩大類：免疫凝集電鏡技術：即采用抗原抗體凝集反應后，再經(jīng)負染色直接在電鏡下觀察免疫電鏡定位技術：利用帶有特殊標記的抗體與相應抗原相結合，在電子顯微鏡下觀察，由標示物指示出相應抗原所在的部位四.透射電鏡相關技術67當前67頁，總共103頁。免疫凝集免疫電鏡定位68當前68頁，總共103頁。五.細胞超微結構簡介細胞膜及特化結構細胞核細胞器69當前69頁，總共103頁。

人胚胎成纖維細胞核大，胞質較少，有較發(fā)達的粗面內質網(wǎng)（▲）及線粒體，在細胞及細胞突起表面均可見質膜（↑）包繞。

×18000

細胞膜及特化結構五.細胞超微結構簡介70當前70頁，總共103頁。人腸吸收上皮細胞，細胞表面有微絨毛（↑），絨毛中心有微絲束組成的軸心，深入胞質淺面。絨毛表面可見呈絲網(wǎng)狀的細胞外衣（▲）。

×16000細胞膜及特化結構五.細胞超微結構簡介71當前71頁，總共103頁。兔輸卵管纖毛柱狀上皮細胞，細胞表面可見纖毛縱剖面（↑），內有微管，纖毛下端有基體（▲）×15000，角圖纖毛橫剖面，可見9+2微管結構。×16000

細胞膜及特化結構五.細胞超微結構簡介72當前72頁，總共103頁。細胞膜及特化結構人胚胎腸上皮細胞橫剖面，核大，胞質少，環(huán)繞細胞四周有質膜（↑），細胞間有原始連接（▲）。

×20000

五.細胞超微結構簡介73當前73頁，總共103頁。細胞膜及特化結構人胃粘液腺細胞間腺腔，表面有微絨毛（↑），有縱切及橫切面，細胞間有緊密連接（▲）×20000五.細胞超微結構簡介74當前74頁，總共103頁。人鱗狀上皮棘細胞，細胞突起間可見橋粒（↑）。×31000細胞膜及特化結構五.細胞超微結構簡介75當前75頁，總共103頁。人腸吸收上皮細胞，細胞間可見橋粒（↑）

×30000

角圖橋粒放大×70000細胞膜及特化結構五.細胞超微結構簡介76當前76頁，總共103頁。人鱗狀上皮細胞，基底面可見半橋粒（↑），相鄰有基板（▲）。

×18000細胞膜及特化結構五.細胞超微結構簡介77當前77頁，總共103頁。

相鄰血管內皮細胞間可見緊密連接（↑），胞質內有波形蛋白中絲（▲）?！?0000細胞膜及特化結構五.細胞超微結構簡介78當前78頁，總共103頁。人鼻咽部纖毛上皮細胞間緊密連接（黑“↑”）。×21000細胞膜及特化結構五.細胞超微結構簡介79當前79頁，總共103頁。人腸吸收上皮細胞間可見復合連接（黑“↑”），胞質內有多聚核糖體（黑“▲”）?！?5000細胞膜及特化結構五.細胞超微結構簡介80當前80頁，總共103頁。

人胃粘膜上皮基底細胞，基底面質膜外可見基板（黑“↑”）?！?2000細胞膜及特化結構五.細胞超微結構簡介81當前81頁，總共103頁。人肌內毛細血管內皮細胞，胞質內可見大量圓形胞飲小泡（↑）及少數(shù)Weibel-Palad小體（▲）?！?6000細胞膜及特化結構五.細胞超微結構簡介82當前82頁，總共103頁。細胞核核膜染色質核仁人胃粘液上皮細胞，可見由核外膜（↑）、核內膜（白↑）、核周隙及核孔（▲）組成的核膜，核內有常染色質及異染色質。

×13000五.細胞超微結構簡介83當前83頁，總共103頁。人鼻咽部上皮細胞，可見部分細胞核，核內外膜、核周隙及核孔均清楚可見，核鄰近可見核孔橫剖面（↑）。×32000

細胞核核膜染色質核仁五.細胞超微結構簡介84當前84頁，總共103頁。人鼻咽部上皮細胞核內可見多個聚集的染色質間顆粒（↑），及核模鄰近單個的染色質周顆粒（▲）。

×32000細胞核核膜染色質核仁五.細胞超微結構簡介85當前85頁，總共103頁。

人鼻咽部上皮細胞核內可見核仁，由深色的核仁絲（白“↑”）及淺色的基質（白“▲”）組成?！?8000

細胞核核膜染色質核仁五.細胞超微結構簡介86當前86頁，總共103頁。大白鼠肝細胞核內核仁，可見核仁絲由顆粒狀（白“↑”）及原纖維狀（黑“↑”）結構組成?！?2000細胞核核膜染色質核仁五.細胞超微結構簡介87當前87頁，總共103頁。細胞內各細胞器

大鼠肝細胞胞質內可見線粒體（↑），游離多聚核糖體（▲）及粗面內質網(wǎng)膜旁核糖體?！?5000

五.細胞超微結構簡介88當前88頁，總共103頁。大鼠肝細胞胞質，內有線粒體（↑）及高爾基體（▲），線粒體由外膜、內膜、外腔、內腔、嵴、基質及基質顆粒組成。

×40000細胞內各細胞器五.細胞超微結構簡介89當前89頁，總共103頁。人腎曲小管上皮細胞，基底端胞質內可見大量線粒體（白“↑”），基質電子密度高，質膜鄰近有基板（黑“▲”）。

×32000細胞內各細胞器五.細胞超微結構簡介細胞內各細胞器五.細胞超微結構簡介90當前90頁，總共103頁。人腎上腺皮質細胞，胞質內可見滑面內質網(wǎng)（▲）及管泡狀線粒體，嵴呈管狀及泡狀（↑）?！?4000細胞內各細胞器五.細胞超微結構簡介91當前91頁，總共103頁。大鼠腦神經(jīng)細胞，胞質內可見散在粗面內質網(wǎng)（↑），游離多聚核糖體及線粒體（▲）。

×34000細胞內各細胞